印度南部一家三级护理医院的原发性耐多药结核病及其在痰涂片阳性样本检测中的应用

摘要

在印度这样结核病负担严重的国家，迫切需要快速、具有成本效益和可靠的结核病诊断工具，以防止不适当的治疗策略和耐药性的进一步传播。这项研究的目的是估计对利福平和/或异烟肼有初级耐药性的涂片阳性结核病新病例的比例，并确定与之相关的常见突变。对200例初诊1+及以上涂片阳性患者的痰液直接进行基因型MTBDR直线探针检测+化验设备。所有样品接种在固体培养基上，61个样品接种在自动液体培养中。Line Probe Assay给出了100%的可解释结果，2.5%的研究人群显示出耐药模式。只有1%的病例是原发性耐多药肺结核，1.5%是异烟肼单耐。S531L和C15T分别是利福平和异烟肼耐药最常见的基因突变。40%的人没有rpoB经临床相关分析，8型可能为沉默突变。Line Probe Assay的平均周转时间(3.8天)远低于固体和液体培养(分别为35.6天和13.5天)。

1.介绍

结核病(TB)在18和19世纪因其造成的发病率和死亡率而赢得了“所有这些死亡之人的船长”的绰号，现在它与艾滋病毒一起成为全球主要的死亡原因[1］．印度在结核病负担最重的国家中排名第一，占估计全球发病率的24%。它也是占全球耐多药结核病负担一半以上的三个国家之一，另外两个是中国和俄罗斯联邦[2，3.］．

在这些国家，改进的快速诊断方法、对病例报告的警惕监测以及通过国家监测规划的后续行动将对结核病统计产生全球影响。尽管由于人口众多和结核病负担高，据报告耐多药结核病发病率较低，在新发病例中占2.2%，在再治疗病例中占15%，但这转化为大量实际病例(2014年通报的肺结核病例中估计有7.1万例耐多药结核病病例)[1］．痰涂片镜检由于其简单、成本效益和可行性仍然是诊断的主要手段。然而，分子诊断技术，如GeneXpert，聚合酶链反应(PCR)， Line Probe assay (lpa)，近年来被越来越多地使用。这些更新的技术有助于快速诊断耐药性，从而防止不适当的治疗制度、耐药性的扩大和在印度等结核病高负荷国家的传播。2008年，世界卫生组织(世卫组织)推荐了一项新政策，使用lpa对耐多药结核病风险患者进行快速筛查[4］．

LPA是一种反向杂交技术，在提取和扩增DNA后，将患者的样本与涂有针对特定基因的互补探针的膜条杂交。互补DNA链的高度特异性结合是由缓冲液组成和一定温度的组合所产生的严格条件所保证的。在杂交过程中，加入链霉亲和素结合的碱性磷酸酶，通过链霉亲和素部分与扩增子的生物素结合。最后，碱性磷酸酶将添加的底物转化为染料，在膜条上作为有色沉淀可见。模板有助于解释获得的条带模式。

基因型MTBDR+分析(Hain Lifesciences, GmbH, Nehren, Germany)针对rpoB(RNA聚合酶β亚基编码)，katG(编码过氧化氢酶过氧化物酶)和启动子区韩国仁荷(编码NADH烯酰ACP还原酶)基因。因此，除了利福平耐药性(rpoB基因),MTBDR+该方法可用于异烟肼(INH)高、低水平耐药检测katG基因和韩国仁荷基因,分别。在印度，根据修订的国家结核病控制规划(RNTCP)，推定耐药结核病病例的定义包括诊断时的所有再治疗病例、随访期间的任何痰检阳性病例、确诊的耐药结核病病例的接触者以及诊断时的艾滋病毒相关结核病病例[5］．对于药敏试验(DST)，如有可用的快速分子试验，如LPA和CB-NAAT(盒基核酸扩增试验)，是根据RNTCP协议首选的一线药物DST方法[5］．本研究旨在发现研究人群中原发性耐药病例的比例，并评估LPA与固体和自动液体培养系统相比在我们的设置中的效用。

2.材料和方法

2．1．标本收集及储存

在一年半的研究期间，收集200例1+级及以上涂片阳性新发病例的晨咳痰标本，置于无菌防漏容器中。所有样品在2-8℃温度下保存不超过4天，然后去污。

2．2.标本处理

2.2.1。直接涂片检查

标本采用Ziehl-Neelsen染色法。10 - 99 AFB/100 OIF为1+，1 - 9 AFB/OIF为2+，>10 AFB/OIF为3+。分级为“稀疏”阳性的涂片被排除在本研究之外。

2.2.2。去污

采用n -乙酰- l-半胱氨酸- (NALC-) NaOH-柠檬酸钠法，将4% NaOH和2.9%柠檬酸钠与NALC粉(0.5 g NALC/100 mL NaOH-柠檬酸钠溶液)混合。该混合物在配制后24小时内使用。在50ml塑料无菌锥形底分度离心管中，加入≤10ml的标本，等体积加入NALC溶液。旋压加盖的管(大约5-20秒/管)，静置15-20分钟后，将pH为6.8的无菌磷酸盐缓冲溶液填充到50 mL的管中，手动旋压混合。然后标本以3000 g的速度在离心机中浓缩15分钟，从颗粒中小心地倒出上清液。颗粒沉淀物用磷酸盐缓冲液(pH 6.8)重悬，最终体积为1 mL。

2.2.3。文化

所有样品在Lowenstein-Jensen (LJ)培养基上进行固体培养。61个样品接种到MB-Bact全自动液体培养基中。本方案的制定是为了确保在直接LPA检测痰液样品无效/阴性的情况下，可以按照制造商的说明对其培养分离株进行LPA(基因型MTBDR)处理+版本2.0)。然而，没有一个样本给出无效的结果。

2.2.4。DNA提取与扩增

净化后的样品在−20℃下保存不超过5天，直到进行DNA提取。500年μ取去污染后的标本于1.5 mL微离心管中，10,000 g离心15分钟。该颗粒在200年重新悬浮μL分子生物学级水，95℃水浴20分钟。然后在超声波浴中孵育15分钟。在14000克的情况下旋转了5分钟μL的上清直接用于PCR。

DNA提取后，每个样品(5μL)与10混合μ我是AM-A和35μL AM-B(试剂盒附带扩增液)，最终体积为50μL.代替提取的DNA溶液，5μ阴性对照加分子生物学级水L。根据试剂盒手册，在热循环器中进行放大[6］．在延迟的情况下，放大产品存储在−20°C直到进一步使用。

2.2.5。杂交

按照制造商的说明执行了Hain协议。

孵化是在“TwinCubator”中完成的，这是一个半自动洗涤和摇床设备，一次可以容纳12个样品。杂交步骤使用试剂盒提供的试剂进行。20μL的变性溶液(DEN)被分配到每口井的角落。放大后的产品被小心地添加和混合。孵育5分钟后，加入杂交缓冲液，在每个孔中放置单条，涂层面朝上。在孵育和洗涤步骤之后，加入稀释的共轭物并继续孵育。最后，添加衬底，将条带置于避光孵育中。按照试剂盒规程的要求，使用严格的清洗和漂洗溶液进行清洗。最后一步用蒸馏水洗涤后，用镊子取出条状物，在两层吸水纸之间晾干。通过将CC和AC带与各自的线对齐，将开发好的表粘贴在试剂盒提供的评估表上。

每条带总共有27个反应区。没有突变带的野生型带的存在被解释为敏感的，同时有或没有相应野生型带的突变带的存在被解释为抗性模式。

所有病人都在科兹科德政府医学院的RNTCP单位登记，并接受定期随访。所有痰检阳性患者均开始采用第一类“直接观察短期治疗”(DOTS)方案，而确诊的耐多药结核病患者开始采用第IV类方案(DOTS)+)(表1)．

3.结果

共200例痰涂片阳性的新标本被处理并直接接受LPA。所有的样本都给出了有效和可解释的结果，因为所有的对照位点都存在。阴性对照仅显示共轭对照(CC)和扩增对照(CC)条带(图)1)．所有样本均显示TUB带，提示感染结核分枝杆菌复杂。

在200个样本中，1%(2个样本)显示LPA的耐多药结核病模式。另有1.5%(3个样本)在本研究中显示INH单抗。

LPA和表型DST在喀拉拉邦的一个中间参比实验室(IRL)确认了LPA和LPA上具有耐多药结核病模式的两个样本。本研究中的两种耐多药结核分离株均显示缺失rpoBWT8波段和存在rpoBMUT3乐队(图2和3.)，这代表一个突变，氨基酸由丝氨酸转变为亮氨酸，密码子数为531rpoB基因。

本研究发现利福平耐药与异烟肼耐药之间存在显著关联，因为两种对利福平耐药的样本也对异烟肼耐药。

在本研究发现的2例MDR病例中，1例患者同时存在高水平和低水平的INH耐药决定区突变katGMUT1带对应于密码子315的S315T1突变katG基因和韩国仁荷MUT3A带对应于T8C突变的-8核酸位置韩国仁荷分别启动子区域。两种INH突变均表现出异抗性模式;也就是说，特定基因同时存在突变和野生型条带。

另一MDR样品仅表现出低水平的INH异电阻韩国仁荷MUT1带对应于C15T突变的-15核酸位置韩国仁荷启动子区域。

这两名患者都是糖尿病患者，其中一人是HIV阳性。在表型DST证实了这项研究的发现后，他们开始使用IV类方案。

3例(1.5%)INH单抗患者中，2例表现为低水平INH异抗韩国仁荷MUT1带对应于C15T突变的-15核酸位置韩国仁荷启动子区同时存在野生型条带(图4)．两例患者在I类治疗方案下均有改善。

第三例患者有类似的突变C15T，表明低水平的INH单抗，但没有野生型条带(图)5)．该患者同时患有糖尿病肾病、双侧输尿管积水和肾结核。她在进行第一类治疗时死亡。然而，死亡原因不能完全归因于由于她的健康状况不佳而产生的INH耐药性。

这项研究中另一个有趣的观察是rpoBWT8波段中近40%的样品(图)6)．根据手册和试剂盒，微弱带被视为阳性。

所有患者只有缺席rpoBWT8波段对I类方案有效，随访痰涂片阴性。

3．1.LPA与固体和自动液体培养的比较

LJ培养基的分离率为79%，MB-Bact培养基的分离率为91.8%。相比之下，LPA在所有200个样本中都给出了有效的结果。

常规固体培养法(17 ~ 50 d)平均检测时间为35.6 d，全自动MB-Bact法(5 ~ 25 d)平均检测时间为13.5 d。另一方面，LPA从收到样本到报告结果的平均周转时间为3.8天(范围2-8天)。

３．２．研究人群的流行病学特征

在200个样本中，162个(81%)来自男性，男女比例为0.23:1。

研究人群的年龄和性别分布如图所示7．

在这项研究中，4.5%的研究人群艾滋病毒呈阳性，这与RNTCP的发现一致，即印度的结核病流行仍然主要是由艾滋病毒阴性结核病感染个体的人群驱动的[7］．

结核合并糖尿病患者中，77.6%的患者涂片分级为2+和3+。本研究显示糖尿病(DM)与涂片分级显著相关，在糖尿病患者中观察到较高的细菌负荷(见表)2)．糖尿病最近被认为是结核病的一个危险因素，流行病学研究阐明了糖尿病和结核病的发展之间的联系[8］．

4.讨论

这项研究是在北喀拉拉邦的一家三级护理医院，科日科德政府医学院进行的，目的是评估初发耐多药结核病在痰涂片阳性病例中的比例，以及LPA快速检测的效用。本研究还旨在发现研究人群中与利福平和INH耐药相关的最常见基因突变。

在印度，新病例中耐多药结核病估计为2-3% [7］．这项研究显示，与印度其他研究类似，新痰阳性肺结核患者中耐多药结核病的发生率很低(1%)[9，10］．印度的各种研究报告显示，INH单抗的流行率从1%到7%不等[11，12]，我们的研究人群显示1.5%的INH单抗。

与利福平耐药相关的最常见突变是在rpoB与其他多项研究结果一致的区域[12- - - - - -15］．

有一些出版物[16，17，认为利福平耐药可以作为耐多药结核病的替代标记物，因为90%以上的利福平耐药菌株也具有异烟肼耐药。但是，系统的回顾[18]得出结论，在利福平耐药流行率低的地区，仅靠快速检测利福平耐药不能准确预测利福平耐药或耐多药结核病。然而，在利福平耐药和耐多药结核病高发地区，这些检测在耐多药结核病管理战略中可能有价值。

在INH抗性的情况下，在我们的研究中观察到更普遍的异抗性模式。异质电阻是完全电阻的初步阶段，传统的DST方法难以检测。然而，对异源抗性的研究表明，表型DST结果与突变即抗的生物体相对应[19，20.］．在以前的研究中，异源抗性的发展被解释为两种方式:两个相同的亚群体(敏感和抗性)共存结核分枝杆菌一株或两株单独的敏感株和耐药株结核分枝杆菌在同一样品中同时发生的。这些机制与临床实体有关:新病例、治疗失败和复发。

正如Tolani等人所解释的[21]，异源耐药可能是由于易感菌和耐药菌群从耐药患者传播到以前未治疗的病例，或者在发病时存在专一敏感菌，在治疗期间逐渐产生耐药性，而敏感菌群不完全消除，并会导致表型抗性，但这两种形式仍可通过基因型检测。

在本研究中，与INH抗性相关的常见突变为启动子区-15核酸位置的C15T韩国仁荷基因。突变在katG和韩国仁荷根据在不同国家进行的不同研究报告，基因似乎在不同的地理位置有很大的差异[12，22，23］．在Maurya等人的一项研究中[24，最显著的突变rpoB，katG,韩国仁荷基因分别为S531L、S315T1和C15T，与本研究相似。

INH抗性是由于过氧化氢酶-过氧化物酶的替换而产生的katG超过四分之三的病例是由基因引起的，更罕见的是由基因突变引起的韩国仁荷(低于10%)或aphC基因。获得阻力的主要方式是通过katG改变是选择特定的突变，即315密码子AGC-ACC (Ser-Thr)的转位，降低过氧化氢酶的活性，但维持一定水平的酶过氧化物酶活性的活菌抗inh [25］．

在本研究中，2例低水平INH异位抵抗患者在I类方案下得到改善。根据另一项研究[26]，韩国仁荷突变与不良治疗结果无关。然而，研究表明韩国仁荷突变确实增加了复发的风险，在持续阶段只包含INH和乙胺丁醇的治疗方案作为细菌的存活概率韩国仁荷巨噬细胞内的突变高于katG315突变株，因为它们仍有充分的过氧化氢酶-过氧化物酶表达。是否会增加复发的风险，尤其是韩国仁荷突变，也与世界卫生组织(WHO)推荐的6个月方案(2RHEZ/4RH)仍有待研究[26］．

近40%的研究人群中没有WT8带，这是一个需要进一步研究澄清的问题。试剂盒手册中提到WT8带的缺失rpoB区域可能归因于沉默突变L533P (Leu (CTG)至Pro (CCG)) [6］．一项研究[27]报道了密码子533或515的变化不太可能与利福平耐药表型相关。Raveendran等人的另一项研究[28指出在本试验中可能会遇到这种差异，在这种情况下表型结果被认为是确定的。

然而，本研究中WT8频段缺失的患者均在I类方案下得到改善。所有患者均为涂片阳性的新发病例，无耐药嫌疑。因此，如果WT8带的缺失是利福平耐药的唯一指示，且没有突变探针，建议患者继续利福平治疗，直到表型敏感性报告。

不同的研究报告不同的LPA周转时间，由24小时内至5天不等[13，28，29］．这种变化可能是由于每天收到的样品频率较低，且只在一次运行中有足够的样品时才分批进行分析。

尽管如此，与固体和自动化液体培养系统相比，LPA的使用大大缩短了周转时间。平均3.8 d, LPA可获得利福平和INH的药物敏感性结果。因此，诊断和给予适当治疗的时间有效地减少了。这对减少耐多药结核病的传播及其有效管理具有重大影响。

不同的研究已经证明了MTBDR的可行性+结果表明，该方法可作为MDR结核病早期检测的有效工具，且与表型DST具有良好的一致性。lpa的作用已在直接检测痰涂片阳性标本和分离株中得到充分验证结核分枝杆菌复合生长从涂片阴性和涂片阳性标本。然而，不建议对涂片阴性临床标本直接使用LPA [30.］．

5.结论

本研究组原发性肺耐多药结核病和INH单耐的比例相对较低，最常见的突变在S531L区rpoB利福平耐药基因和C15T韩国仁荷INH抗性启动子区。本研究强调，LPA的实施将是MDR结核病诊断、治疗和管理的一个前所未有的里程碑，它具有快速的转换时间和直接从痰涂片阳性样本检测MDR结核病的高特异性和高敏感性。然而，LPA不能完全取代表型培养方法，从上述结果可以看出，沉默突变可能会使临床解释复杂化，在这种情况下，提倡表型DST。本研究的一个局限性是由于时间和人员的限制而不能进行表型DST。

总之，LPA肯定有助于MDR结核病的早期诊断和适当治疗，尽管与其他分子检测一样，在必要时应使用传统方法补充LPA。

相互竞争的利益

作者声明本论文的发表不存在利益冲突。

致谢

Fahmiya博士要感谢微生物学系前任主任Rema Devi S博士，感谢她允许她进行这项研究。Fahmiya博士还衷心感谢Biju M. George博士、Shabana O.博士、Jaishid Ahdal博士和Sreeja女士在本次研究中提供的宝贵意见和建议。

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