肺结核(TB)赢得了绰号“死亡所有这些人的队长”在18、19世纪的发病率和死亡率造成的,现在排名与艾滋病毒作为主要的死亡原因在全世界范围内( 1]。印度排名第一结核病高负担国家导致估计全球发病率的24%。也是一个三个国家导致超过一半的全球负担的耐药结核病(MDR结核),另外两个被中国和俄罗斯联邦 2, 3]。

改进的快速诊断方法,谨慎的监控病例报告,后续通过国家监测项目在这些国家将会产生全球影响结核病统计数据。尽管据报道耐多药结核病是低2.2%的新病例和15%再处理情况下,由于人口众多和结核病高负担,它转化为高实际病例数(71000年估计耐多药结核病例报告了肺结核病例中2014)( 1]。痰涂片镜检诊断仍然是最主要的,因为它很简单,成本效益和可行性。然而,分子诊断技术像GeneXpert,聚合酶链反应(PCR)和线性探针分析(lpa)最近被越来越多的使用。这些新技术援助耐药性的快速诊断,从而防止不恰当的治疗方法,耐药性的放大和传播在印度这样的国家结核病高负担。世界卫生组织(世卫组织)推荐新政策使用lpa的快速筛查病人耐多药结核病的风险(2008年 4]。

LPA是反向杂交技术在病人的样本,进行DNA提取和放大后,受到与膜条涂上互补的探针杂交针对特定的基因。高度特定绑定的互补DNA链是由严格的保证条件组合的结果缓冲区组成和一定的温度。在杂交,streptavidin-conjugated添加碱性磷酸酶扩增子的结合,通过链霉亲和素生物素的一部分。最后,碱性磷酸酶转换成为可见的底物添加到一个染料膜条作为有色沉淀。一个模板可以帮助获得条带的解释模式。

基因型MTBDR +试验(海Lifesciences GmbH, Nehren,德国)的目标 rpoB(β亚基编码的RNA聚合酶), katG(过氧化氢酶编码过氧化物酶),启动子区域 韩国仁荷(编码NADH enoyl ACP还原酶)基因在两种文化隔离和临床样本。因此,除了耐利福平( rpoB基因),MTBDR +化验艾滋病检测的高水平和低水平耐异烟肼(INH)通过 katG基因和 韩国仁荷基因,分别。在印度,根据修订后的国家结核控制规划(RNTCP),假定的定义耐药结核病(TB)博士在诊断病例包括所有再处理,任何痰检阳性病例随访期间,博士联系确认的结核病病例,与艾滋病毒相关的结核病例诊断( 5]。药敏测试(DST),快速分子检测LPA和CB-NAAT(盒式based-nucleic酸放大测试),如果可用,一线药物的首选DST方法按RNTCP协议( 5]。本研究旨在发现原发性耐药病例的比例的人口研究和评估效用LPA在我们设置相比,固体液体培养系统和自动化。

总共200个新的痰涂片阳性样本,直接受到LPA处理。所有的样品给有效和可翻译的结果所显示的所有控制位点的存在。消极的控制显示的存在共轭控制(CC)和放大控制(CC)只乐队(图 1)。所有的样品显示浴缸乐队从而表明感染的存在 结核分枝杆菌复杂。

的200个样本,1%样品(2)耐多药结核病LPA的模式。额外的1.5%(3)样本显示异烟肼monoresistance在这项研究中。

两个样品的耐多药结核病模式从一个中间LPA被证实参考实验室(IRL)在喀拉拉邦LPA和表型DST。两个耐多药结核病隔离在这个研究显示缺席 rpoBWT8乐队和存在 rpoBMUT3乐队(图 2和 3)代表一个突变和氨基酸变化从丝氨酸亮氨酸与密码子531号的 rpoB基因。

之间存在显著相关的利福平抗性和耐异烟肼在本研究的样本与利福平耐药性也耐异烟肼。

在两个MDR例检测到在这项研究中,一个病人有高水平和低水平的突变耐异烟肼确定区域的存在 katGMUT1带对应于S315T1 315密码子的突变 katG基因和 韩国仁荷MUT3A带对应于8核酸的T8C突变的位置 韩国仁荷分别启动子区域。异烟肼突变显示heteroresistant模式;即有同时出现的两个突变体和野生型乐队为指定的基因。

其他MDR样本显示只有低水平异烟肼heteroresistance表示的存在 韩国仁荷MUT1带对应于C15T -15核酸突变的位置 韩国仁荷启动子区域。

患者糖尿病和其中一个是HIV阳性。他们发起的第四类方案确认后,本研究通过表型DST的发现。

从与异烟肼monoresistance 3例(1.5%),2例低水平异烟肼heteroresistance显示 韩国仁荷MUT1带对应于C15T -15核酸突变的位置 韩国仁荷启动子区域同时存在的野生型乐队(图 4)。两个类别下的患者改善我治疗方案。

第三个病人有类似的突变,C15T,表明低水平异烟肼monoresistance但没有野生型乐队(图 5)。这个病人并存糖尿病肾病的发病率与双边hydroureteronephrosis肾结核。她屈服于死亡在类别我治疗。然而死亡的原因不能完全归因于异烟肼耐药性由于她否则糟糕的健康状况。

本研究的另一个有趣的观察是没有的 rpoBWT8乐队在几乎40%的样本(图 6)。微弱的乐队是作为积极按照手册以及装备。

所有的患者只缺席 rpoBWT8乐队回应类别我方案后续痰涂片是负面的。

这项研究是在北部的一个三级保健医院进行喀拉拉邦政府医学院科泽科德,评估中主要耐多药结核病的比例新的痰涂片阳性病例和效用LPA的快速检测。本研究旨在找到最常见的基因突变与利福平和异烟肼耐药性研究人口。

在印度,耐多药结核新病例估计在2 - 3% 7]。这项研究显示低利率(1%)的新痰液中的耐多药结核病阳性肺结核病人类似于其他印度研究[ 9, 10]。异烟肼的患病率monoresistance从1%到7%不等据报道在不同的印度研究[ 11, 12人口),我们的研究显示,1.5%异烟肼monoresistance。

最常见的突变与利福平耐药性S531L突变在有关 rpoB地区与其他研究的结果一致( 12- - - - - - 15]。

有出版物 16, 17]说明利福平抗性可以替代标记自超过90%的耐多药结核病rifampicin-resistant隔离也耐异烟肼。但是,系统回顾 18)得出结论,对利福平耐药性的快速检测无法准确预测耐利福平或地区耐多药结核病患病率较低的利福平耐药性。然而,在利福平抗性和耐多药结核病发病率高的地区,这些测试可能在耐多药结核病管理策略的价值。

异烟肼耐药性,heteroresistant模式观察更常见的在我们的研究中。Heteroresistance是完整的一个初步阶段电阻难以用常规DST方法检测到。heteroresistance然而,研究表明,突变表型DST结果对应,也就是说,抗,生物 19, 20.]。heteroresistance的发展已经在先前的研究解释了发生在两个方面:两个亚种群的共存(敏感和耐药)是一样的 结核分枝杆菌应变或两个单独的敏感和耐药菌株 结核分枝杆菌同时发生在同一样本。这些机制与临床实体:新病例,治疗失败和复发。

以解释为Tolani et al。 21],heteroresistance可能出现由于敏感和耐药细菌种群的传播耐药病人以前未经治疗的病例或专门的存在敏感的细菌在发病过程中逐渐产生耐药性治疗,不完全消除敏感人群,将导致表型的阻力,但剩下两种形式可检测遗传型的。

在这项研究中,与异烟肼耐药性相关的常见突变是C15T -15核酸的启动子区域的位置 韩国仁荷基因。突变的发生率 katG和 韩国仁荷基因似乎相差很大在不同地理位置的各研究报道在不同的国家 12, 22, 23]。在孔雀王朝的研究和et al。 24),最显著的突变 rpoB, katG, 韩国仁荷基因S531L、S315T1 C15T分别,类似的研究。

异烟肼耐药性发生由于catalase-peroxidase替换 katG基因在超过四分之三的情况下,更很少,由于突变 韩国仁荷(少于10%)或 aphC基因。主要通过收购方式抵抗 katG改变特定突变的选择,也就是说,315密码子的颠换AGC-ACC (Ser-Thr)降低了过氧化氢酶的活动,但保持一定程度的过氧化物酶酶的活动可行INH-resistant生物( 25]。

在这项研究中,低水平的2例异烟肼heteroresistance类别下改进方案。根据另一项研究[ 26), 韩国仁荷突变并不与不利的治疗结果。然而,研究指出 韩国仁荷突变增加复发的风险与治疗方案,只包含异烟肼、乙胺丁醇延续阶段作为生存的细菌的概率 韩国仁荷突变内巨噬细胞比的高 katG315突变株,因为他们仍然有完整catalase-peroxidase表达式。是否增加复发的风险,特别是 韩国仁荷突变,也存在与世界卫生组织(世卫组织)推荐6个月疗程(2 rhez / 4 rh)仍有待研究[ 26]。

缺乏WT8乐队在研究人口的近40%是通过进一步的研究需要澄清。设备手册提到的缺席WT8乐队的 rpoB地区可能归因于沉默突变L533P(低浓缩铀(玻纤)专业(20))( 6]。一项研究[ 27)报道,密码子533年或515年的变化不可能与rifampicin-resistant表型。另一项研究通过Raveendran et al。 28)指出,这种差异可能会遇到在这个试验和在这种情况下表型结果被认为是确认。

然而,所有的患者在这项研究没有WT8乐队类别下改进方案。此外,所有这些患者痰涂阳性新病例无耐药性的怀疑。因此,如果删除WT8乐队是唯一的利福平抗性和没有突变的探针,它建议继续对利福平治疗到患者表型敏感性报告是可用的。

不同的研究报告不同的周转时间LPA在24小时内从一段一段5天( 13, 28, 29日]。变化可能是由于小样本接收频率和每天做化验分批,只有当足够的样品存在在一个单一的运行。

尽管如此,LPA的使用大大减少了周转时间比固体和自动化液体培养系统。在平均3.8天,结果随着药物的敏感性可以通过LPA利福平和异烟肼。因此,时间管理诊断和适当的治疗是有效的减少。这对减少耐多药结核病的传播产生重大影响和高效管理。

不同的研究已经证明MTBDR的可行性 +分析作为一种有效的工具在耐多药结核病的早期检测与表型DST有良好的一致性。lpa的表现已经充分验证直接检测痰涂片阳性标本分离的 结核分枝杆菌复杂的从涂阴和痰检阳性标本。但是,不建议直接使用LPA smear-negative-clinical标本( 30.]。

原发性肺耐多药结核病比例以及异烟肼monoresistance在目前相对较低的研究小组与最常见的突变S531L地区的 rpoB利福平耐药性和C15T的基因 韩国仁荷启动子区域的异烟肼耐药性。本研究强调LPA的实现快速周转时间和高特异性和敏感性检测直接从痰涂片阳性肺结核诊断样本将是史无前例的里程碑,耐多药结核病的治疗和管理。然而,LPA不能完全替代表型的文化方法,如上面明显的结果,沉默突变可能使临床解释和表型DST是主张在这种情况下。本研究的局限性是无法执行表型DST由于时间和人员的限制。

总之,LPA绝对艾滋病耐多药结核病的早期诊断和适当的管理,尽管如此,与其他分子测试,明智的决定补充LPA与传统方法应该使用任何必要的。