两个呼吸季节克罗地亚儿童单、多呼吸道病毒感染的病因及临床特点

抽象的

本研究的目的是确定住院儿童急性呼吸道感染(ARI)的病原体，并通过单病毒和多病毒检测探讨两个呼吸季节的急性呼吸道感染特点。2010年和2015年，对因急性呼吸道感染住院的134名儿童的鼻咽和咽拭子进行了多重PCR检测。81.3%的患者病原学确定。27.6%的患者诊断为同时感染两种病毒，12.8%的患者诊断为同时检测到三种或三种以上病毒。两季合胞病毒(RSV)占28.6%，其次为1-3型副流感病毒(PIVs)占18.4%，鼻病毒(HRV)占14.3%，人偏肺病毒(10.1%)，腺病毒(AdV)占7.1%，A、B型流感病毒(4.8%)和冠状病毒(4.2%)。2015年调查了其他病原体，检出率如下:肠道病毒(13.2%)、bocavvirus (HBoV)(10.5%)、PIV-4(2.6%)和parechovirus(1.3%)。单病毒感染和多病毒感染在患者年龄、感染部位和疾病严重程度方面没有统计学差异．AdV、HRV、HBoV和piv在多种病毒感染中明显高于其他呼吸道病毒．

1.介绍

急性呼吸道感染(ARIs)是所有年龄段人类最常见的感染。儿童和婴儿是人口中最脆弱的群体之一，ARIs是全世界儿童住院最常见的原因[1］．虽然细菌、真菌和寄生虫都能引起急性呼吸道感染，但呼吸道病毒是主要的感染源。幼儿期大多数呼吸道病毒感染局限于上呼吸道。约有三分之一的婴儿患上下呼吸道感染[2］．呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(HMPV)、流感病毒(Flu)和腺病毒(AdV)是儿童急性呼吸道感染最常见的病原体，多年来一直是深入研究的对象;因此，克罗地亚急性呼吸道感染的临床特征和区域流行病学特征是众所周知的[3.- - - - - -6］．然而，由于实验室诊断方法的快速进展，呼吸道病毒列表正在增长。在过去的十年中，已经鉴定了新发现的病毒，包括人类生物病毒（HBOV），冠状病毒NL63（HCOV-NL63）和HKU1（HCOV-HKU1），新的肠病毒（HEV），PareChovirus（HPEV）和鼻病毒（HRV）菌株[7］．此外，尽管一些呼吸道病毒早已为人所知，特别是副流感病毒4型(PIV-4)，但技术上的培养方法要求很高，且缺乏商业测试，使得PIV-4的感染诊断困难[8，9］．国内部分新发现病毒(HBoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1)和难培养病毒(PIV-4)未见感染记录。该区域最近很少有研究提供关于上述病毒引起感染的区域流行病学的有价值但仍然不够充分的数据[10，11］．此外，由于分子方法的高敏感性，出现了多种呼吸道病毒检测问题，使实验室诊断的解释复杂化。本研究的目的是确定萨格勒布地区两个呼吸季节住院的ARI儿童中16种病毒的多重PCR检测方法的病原学，以证明在常规实践中引入分子诊断的必要性。此外，我们的目的是研究单病毒和多病毒检测的感染特征，特别是涉及的病毒类型和感染的严重程度。

2.材料和方法

2．1．病人和标本

A total of 134 children admitted to Children’s Hospital Zagreb during two winter seasons (January to March) in 2010 and 2015 with symptoms of ARI and suspected for viral etiology (normal or slightly elevated inflammatory markers, i.e., white cell count) were included in the study. Patients were categorized into three groups according to age (<1, 1–3, and ≥4 years of age) and two groups according to the localization of infection in those with upper respiratory tract infection (URTI) and lower respiratory tract infection (LRTI). URTI was defined by symptoms of the common cold, coryza, cough, and hoarseness often accompanied with fever. Clinical syndromes of respiratory catarrh, rhinitis, and/or pharyngitis are included in URTI category. LRTI was defined according to the clinical symptoms of tachypnea, wheeze, severe cough, breathlessness, and respiratory distress accompanied by LRTI signs such as nasal flaring, jugular, intercostal, and thoracic indrawings, rarely cyanosis, and, on auscultation of the chest, wheeze, crackles, crepitations, and inspiratory rhonchi or generally reduced breath sounds [2］．支气管炎、毛细支气管炎和肺炎的临床综合征被纳入LRTI类别。为避免不必要的x线照射，仅对部分患者进行了胸片检查，以排除或确认细菌性肺炎。严重疾病和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)定义为需要补氧和/或机械通气。从病历中回顾性收集患者的基本情况资料。最常见的基础疾病为哮喘、无记忆性复发性喘息发作、神经系统疾病、早产和贫血。获得了孩子父母或监护人的书面同意。这项研究得到了公共卫生教学研究所伦理委员会" Andrija Stampar博士"的批准。

收集每个患者的鼻咽部和咽部植绒拭子，合并并置于病毒转运培养基(UTM)中™、科潘、意大利)。伴随人口统计数据和临床诊断的标本立即被运送到公共卫生研究所的分子微生物实验室，在那里它们被保存在−80°C，直到检测。研究鼻咽拭子、咽拭子、血培养和血清的血清学，以排除细菌感染。样本细菌学检验呈阳性的患者随后被排除在研究之外。

2．2.实验室检测

从病毒运输培养基中分离病毒DNA和RNA, 200μL根据制造商的协议用QIAAMP®Minelute®Virus旋转套件（Qiagen，Hilden，德国）提取。通过基于多路复用的PCR试验来测试2010年收集的标本，用于检测12次呼吸道病毒，并分别使用Seeplex RV12和Seegper RV15检测试剂盒进行15次呼吸道病毒测试的标本（Seegene Inc.，首尔，韩国）。简而言之，使用热循环仪Geneamp®9700PCR系统（应用生物系统，USA）在一步反应中进行多重PCR和cDNA合成，然后在MCE®-202 Multina设备上进行Microchip电泳检测（Shimadzu，Kyoto，日本）包括显示电气图和虚拟凝胶形式的软件分析（图1)．根据制造商的协议，使用LightMix®Molbiol，GmbH，德国曼海姆，曼海姆，曼海姆，德国曼海姆，德国德国柏林，德国）进行了实时RT-PCR进行实时RT-PCR。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
(c)

图1

电泳图的凝胶图像（a），（b）和（c）SEEPLEX®RV15ONESTEP ACE检测测试：（L）梯子;（1）在套（a）和（b）中的样品阴性，并为甲型生育病毒阳性（c）;（2）在设定（a）中的人冠状病毒229 / nl63的样品阳性（a）和集合（b）和设置（c）;（3）套装（a）中的样品阴性，SET（b）中的人冠状病毒OC43，符合综合症（c）中的均为阳性病毒;（4）在套（a）和（b）中的样品阴性，并且肌孢子虫和肠道病毒阳性（c）。PC：阳性控制;设定（a）= 859 bp / pcr控制，534 bp /腺病毒，375 bp / coronavirus 229 / nl63,264 bp / parainfluenza 2,189 bp / parainfluenza 3，和153 bp / parainfluenza类型1;设定（b）= 850 bp / pcr控制，578 bp / coronavirus OC43，394 bp / rhinovirus，269bp /呼吸合胞病毒A，206bp /甲型流感A和155bp /呼吸合胞病毒B;SET（c）= 579 bp / bocavirus，456 bp /甲型流感b病毒，351 bp / metapneumovirus，254 bp / parainfluenza病毒4，194 bp /肠病毒和153 bp /全过程控制;NC：负面控制。

组间比较采用卡方检验，采用STATISTICA 12.7进行统计学分析。被认为是显著的。

3.结果

2010年检测62例，2015年检测72例。患者年龄1个月至16岁，中位年龄2010年和2015年的年份。总体而言，有56名女孩（41.8％）和78名男孩（58.2％），女性到男性比例为1：1.4（2010年1：1.3和2015年的1：1.5，Arch。）。在134名（81.3％）ARI（2010年54/62,87％87％的872％的患者中，59名中成立了病毒学病毒学（2010年的87％，2015年的55/72,76.4％）。有43（39.4％）的女性和66名（60.6％）男性感染儿童，女性至男性比例为1：1.5。在表格中介绍了受感染的儿童的特征和感染的特征，包括检测到，本地化和疾病的严重程度1．在两个调查季节间，上述类别的差异均无统计学意义(表)1)．平均住院时间为在两个季节的白天。

61.3%(65/109)的患者诊断为单病毒，27.6%(30/109)的患者同时感染两种病毒，11.0%(12/109)的患者同时检出三种病毒。同时检出4种病毒2例(1.8%)，每个调查季节1例。单、多重病毒感染患者的年龄差异无统计学意义()、局部感染()及疾病严重程度()．然而，一些病毒在多重感染组合中明显比其他病毒更经常被检测到。这些是AdV (), HRV ()、piv (）和HBOV（)．桌子2介绍了某些病毒的发病率和它们在单一感染和合并感染中的表现。

两个季节中最常见的病毒组合为RSV（28.6％; 48/168），其次是PIVS类型1-3（PIV-3 12.5％，21/168; PIV-1 3.6％，6/168;和PIV-2 2.3％，4/168），HMPV（14.3％，24/168），HMPV（10.1％，17/168），adv（7.1％，12/168），流感A + B（4.8％，8 /168）和HCOV（4.2％，7/168）。然而，病毒的发生率在季节之间不同（图2)．2010年没有检出流感病毒，2015年检出8种()．2010年的PIV在2010年比2015年更常被检测到（)， PIV-3检出率在两个季节均最高。PIV在不同季节间的分布没有差异()．

图2

2010年和2015年患者年龄和病毒类型的病毒发病率。

2015年，又检测了4种病毒，HEV、HBoV、PIV-4和HPeV，发现2015年的检出率如下:HEV 13.2%， HBoV 10.5%， PIV-4 2.6%， HPeV 1.3%。

2个季节中，1 - 3岁年龄组的病毒感染发生率最高(2010年54.4%，50/92,2015年38.2%，29/76)，PIV和HRV的季节发病率与患者年龄有关(图)2)．在低于一年的儿童，与2015年相比，2010年的HRV和PIV的发病率更高（和，resp。），以及在2010年的PIV的1 - 3岁的儿童比2015年更高（）也被观察到。RSV发病率是2010年1-3岁儿童中最高的，与2015年<1岁集团的最高RSV发病率相反。然而，观察到季节之间的RSV发病率没有观察到的统计差异对患者年龄（<1岁组和分别适用于1 - 3岁年龄组)。HRV在患有URTI的儿童中更容易被发现(），而RSV在LRTI的儿童中经常被检测得多（)与其他病毒相比。

4.讨论

由于缺乏病原体特异性的临床症状，仅根据症状、临床表现和生化检查而不进行充分的实验室检测是不可能确定ARIs病因的。用传统的方法如病毒培养建立病毒病原学对临床目的来说太慢，技术上费力。直接免疫荧光试验(DFA)和快速抗原试验在几小时内就能产生结果，但在许多情况下，它们缺乏敏感性和特异性，仅对少数病毒有效[12］．因此，目前用于检测流感、RSV、AdV和1-3型piv等传统呼吸道病毒的金标准(如病毒培养或DFA)将受到挑战，并最终被核酸扩增技术(NAATs)所取代，这种技术在克罗地亚并不经常使用。更有甚者，对于HBoV等新发现的病毒，NAATs直到最近都是唯一可用的实验室诊断方法[13］．此外，最近开发的多重PCR方法可以在单一分析中同时检测许多病原体，而且基于临床综合征方法的商业检测也可用[14］．本研究的病毒病原学研究采用了两种多重PCR检测方法:一种是在2010年季节进行的12种病毒检测，另一种是在2015年呼吸季节进行的病毒扩展谱检测，包括检测HBoV、PIV-4和HEV。结果首次在克罗地亚儿童中检测到HBoV和PIV-4，从而强调在今后的诊断方法中使用将涵盖所有已知呼吸道病毒的检测方法的必要性。在解释结果时，应始终考虑所用分析方法的性能。的特点和局限性分析本研究中使用54.17%的敏感性相对较低,但优秀的特异性的98.41,0.96的准确性,协议kappa系数为0.81的性能相比Argene / bioMerieux双工测试作为黄金标准(14］．还应注意到这项观察性研究的局限性。它们包括相对较小的样本量，这表明需要进行更大规模的研究，以获得更准确的流行病学数据和精确的抽样方法，并严格确定ARI发病的样本收集时间，这可能导致更高的病毒检出率。

在这两个季节最常见的病毒以及LRTI的重要原因是RSV，这与其他调查住院儿童急性呼吸道感染病因的研究一致[15- - - - - -17］．不同季节患儿年龄RSV检出率差异无统计学意义，但2015年RSV检出率随患儿年龄呈典型下降趋势。2010年检测到的最常见病毒分别为PIV-3和HRV, 2015年检测到的最常见病毒为RSV，其次是HEV, HMPV和HBoV检测频率相同。PIV-3是两个季节检测到的所有piv中最流行的类型，这与其他国家的piv类型流行程度一致[18］．本研究揭示了不同调查季节检测流感病毒的差异，2010年未检测到流感病毒和2015年检测到8个流感毒株。世卫组织克罗地亚流感监测合作中心提供的关于影响活动的详细回顾性数据分析表明，2009/2010年季节的特点是出现了不寻常的流行病学模式。由于出现了大流行毒株，在2009年秋季和活动结束时记录到发病率最高，2010年初没有报告病例。与此相反，2015年初出现流感高发，2月份流感发病率达到高峰[19］．本研究中，两季合检出HMPV的比例为10.1%，季节间无差异，与已公布的住院儿童和门诊ARI患者HMPV发病率均在7% - 19%之间的情况一致[3.，7］．虽然之前的研究表明，LRTI的儿童中已经经常检测到HMPV [6]，本研究未发现根据感染部位不同HMPV检出率存在差异。对HRV和HEV的分子检测揭示了这些病毒在ARI病因学中的真正意义。HRV和呼吸道HEV似乎是上呼吸道感染的主要原因，但分子诊断技术显示HRV也存在于下呼吸道，其在下呼吸道疾病中的作用越来越多的报道[20.］．本研究结果表明，HRV更频繁地与其他呼吸道病毒一起检测，以及患有URTI的儿童。有许多类型的HRV和HEV，其禁用使用快速测试，例如DFA，并且培养是一种选择的方法，仅适用于细胞培养物容易生长的那些，这对于许多呼吸类型的HEV来说是不特征的。HEVs导致许多临床综合征。患有无菌脑膜炎和无意中疾病的HEV的类型最常感染学龄前和学龄的儿童[21］．本研究中检测到的混合动力汽车中有一半记录在1岁以下的儿童中，这表明呼吸型混合动力汽车感染出现在幼儿期。为了在本研究中尽可能多的调查ARI的病毒原因，我们在2015年季节对HPeV进行了单倍实时PCR，并在1岁以下的儿童中诊断出1例感染。尽管在回顾性研究中经常发现，且通常与胃肠道和呼吸道症状有关，hpev的诊断仍未纳入急性腹泻或呼吸道综合征的常规筛查。根据以往的经验及报告[22]，它们应列入呼吸道感染的鉴别诊断，即使仅在幼儿。

本研究发现，两季合并感染检出率高达40.4%。在中国和巴西最近发表的两项研究中，在ARI患者的鼻咽部和咽部分泌物中寻找18和13种呼吸道病毒的合并感染率分别为18%和65% [17，23］．单病毒感染和多病毒感染在患者的年龄、感染部位和疾病严重程度方面没有显著差异。最近发表的meta分析也表明，病毒合并感染并没有增加所有评估结果的严重程度(即住院需求、住院时间、补充氧需求、重症监护和机械通气)[24］．然而，本研究表明，在多种感染组合中，adv，hrv，piv和hbov比其他病毒更常被检测到。似乎是辛纤维与呼吸道粘膜粘膜中的延长病毒持久性有关。特别地，HBOV-1原发性感染与轻度呼吸疾病有关，随后延长检测HBOV-1 DNA至多一年[25］．brocolo等人也主张一种假说，即病毒持久性在与URTI和LRTI合适病原体的高频率共感染中发挥作用[26］．Shi等发表的一项meta分析也强调了在多重病毒性呼吸道感染中识别真正呼吸道病原体的重要性。研究显示，与无症状或健康儿童相比，患有LRTI的幼儿中RSV、Flu、PIV和HMPV的因果归因有强有力的证据，而HRV的证据不那么有力，但病例和对照组中AdV、BoV或CoV的检测没有显著差异[27］．Therefore, detected specific sequences of nucleic acid of HMPV, Flu, PIVs, or RSV in respiratory specimens enable conclusions about the causative pathogen, but for the evaluation of the detection of other pathogens (i.e., HBoV, HCoV, HRV, and AdV) a clinical evaluation is needed in order to distinguish acute infections from subclinical events with nucleic acid persistence. Several studies indicated that symptomatic infections are associated with higher viral load [28，29］．虽然在这项研究中使用的复合PCR试验是声明为一个定性测试,在病毒特定的强度有差异乐队中观察到一些合并感染,给外界的印象是病毒的发现导致了低强度乐队实际上是存在于少量的样本(图1)．因此，测量呼吸道标本中的病毒载量可能是鉴别真正呼吸道病原体的可能进展[30.］．

结论

综上所述，呼吸道合胞病毒仍然是ARI患儿中最常见但不是唯一的病原体，尤其是3岁以下儿童。多重PCR可以检测多种病毒，所有可能的病原体都应纳入ARI的实验室诊断。多重病毒检测仍然是解释结果的难点。定量分子诊断可能有助于澄清呼吸道病毒病原体的共同感染和共同检测。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

致谢

这项研究部分得到了萨格勒布大学资助Sunčanica Ljubin-Sternak (no。BM075)。作者感谢Matea Kvaternik Celjak的技术援助。

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