缺铁影响以膜完整性为靶点的分枝杆菌的药物敏感性

摘要

获得的多药耐药(MDR)结核分枝杆菌通过持续使用抗结核药物，可以立即寻找新的靶点和机制。结核分枝杆菌感知和适应宿主变化的能力对生存至关重要，是感染的基础。结核分枝杆菌在感染过程中必须克服铁的限制，因为细菌和人都需要铁。这项研究的重点是缺铁如何影响已知抗结核药物的药物敏感性分枝杆菌smegmatis，一种“结核分枝杆菌的替代品”。我们发现，缺铁可增强最常用的一线抗结核药物的效力，这些药物可在补充铁后恢复效力。我们发现，在铁剥夺后，细胞膜的稳态被破坏，这是通过增强细胞膜渗透性和对膜干扰剂的过敏导致药物被动扩散增加和透射电镜图像显示的细胞膜厚度的可检测到的差异所揭示的。此外，铁似乎对维持基因毒性应激是必不可少的，这表明它可能在DNA修复机制中发挥作用。综上所述，我们首次建立了细胞铁和分枝杆菌药物敏感性之间的联系，提示铁是对抗耐多药的新决定因素。

1.介绍

结核病(TB)由结核分枝杆菌(MTB)继续构成重大的全球卫生挑战，需要立即针对新的目标采取治疗方案。结核病是可补救的;然而，由于其漫长的用药过程或药物方案管理不善，导致了针对各种一线抗结核药物的多药耐药结核病(MDR-TB)的出现[1- - - - - -3.］．尽管对促进耐多药机制的主要因素有合理的文献记载，但似乎不可避免地要剖析抗耐多药的新机制[4］．铁缺乏是结核分枝杆菌在感染过程中由于人体宿主无法获得游离铁而遇到的重要环境应激条件之一[5，6］．因此，宿主细胞中铁的可获得性受到严格的控制，使得宿主和入侵的病原体(如结核分枝杆菌)都难以获得铁。因此，针对体内铁平衡可能是一种有效的策略，以阻止快速增长的抗性。

铁在药物易感性方面的作用已经在其他主要的人类病原体中得到证实，白色念珠菌，杜氏利什曼虫，金黄色葡萄球菌,链球菌epidermidis［7- - - - - -11］．研究表明，在白色念珠菌对包括氟康唑(FLC)在内的许多常见抗真菌药物的敏感性增加。许多不同种类的假丝酵母铁限制条件下药物敏感性增加。研究了铁螯合对生长的影响利什曼虫braziliensis (Viannia)对该寄生虫的蛋白质表达和超微结构也进行了研究。对革兰氏阳性菌的类似研究葡萄球菌在铁螯合剂二胺二邻羟基苯乙酸存在下进行。

在分枝杆菌中，磷脂稳态、毒性和铁获取之间的联系最近被脂质体学方法探索[12］．吡唑嘧啶酮和ATP的抗细菌活性也被归因于它们的铁螯合能力[13，14］．甚至对各种铁获取策略进行了回顾，以了解少数依赖铁的候选者和蛋白质的潜力，这些候选者和蛋白质可能影响从宿主中消除分枝杆菌[5，15，16］．因此，铁在分枝杆菌中的重要性正在显现，而且从最近广泛的研究中也得到了很明显的证实。然而，还没有这样的直接研究描述铁和分枝杆菌药物敏感性之间的联系，还没有实验证明。

本研究的目的是找出铁的可用性和分枝杆菌对已知抗结核药物的药敏性之间的相关性。在本研究中，首次探索铁在控制已知抗结核药物易感性中的作用。我们发现，缺铁导致一线抗结核药物(乙胺丁醇、异烟肼和利福平)的效力增强，这些药物可在补充铁后逆转。我们探索了铁的剥夺会导致膜稳态的破坏，这被增强的膜渗透性和对膜扰动剂和TEM图像的过敏所证实。我们还发现，在溴化乙锭存在的情况下，缺铁导致基因毒性增强，提示其可能在DNA修复机制中发挥作用。总之，这项研究揭示了细胞铁和分枝杆菌药物敏感性之间的复杂关系。

2.材料和方法

2．1．材料

所有Media chemicals Middlebrook 7H9肉汤、Middlebrook 7H10琼脂、白蛋白/葡萄糖/过氧化氢酶(ADC)和油酸/白蛋白/葡萄糖/过氧化氢酶(OADC)补充剂均购自BD Biosciences (USA)。甲磺酸脱胺盐粉(DFO)、对苯二酚二磺酸二钠盐(BPS)、吐温-80、硝基醚、乙胺丁醇(EMB)和异烟肼(INH)购自Sigma-Aldrich公司(St. Louis, MO, USA)。2,2，联吡啶(2,2,BP)、溴乙啶(EtBr)、二硝基酚(2,4,DNP)和利福平(RIF)均购自印度孟买Himedia公司。二甲基亚砜(DMSO)、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、正磷酸盐氢二钠(Na₂HPO₄)、磷酸二氢钾(KH₂阿宝₄)、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘油和d -葡萄糖;甲醇是从默克公司购买的。

菌株和培养条件。m . smegmatismc²155在添加了0.05%吐温-80 (Sigma)、10%白蛋白/葡萄糖/过氧化氢酶(ADC;BD Difco)和0.2%甘油(Fischer Scientific)在100 mL烧瓶(Schott Duran)中培养，37℃，在添加10% (v/v)油酸/白蛋白/葡萄糖/过氧化氢酶(OADC;BD Difco)固体琼脂可在37°C下生长48小时。贮藏培养的对数期细胞保存在30%甘油和−80°C。

2．2.药敏测试

2.2.1。最低抑制浓度(MIC)

最低抑菌浓度是用肉汤稀释法测定的[17]，根据CLSI的指引[18］．简单地说,100年μ将Middlebrook 7H9肉汤的L置于96孔板的每孔，随后将药物与剩余的培养基一起添加，然后依次以1:2稀释。100年μL细胞悬液(用生理盐水注射至过量₆₀₀0.1)加入到平板的每个孔中。37℃孵育48小时。通过观察od值来评估MIC值₆₀₀在一个微孔板阅读器(丽莎·瑞德)。麦克风₈₀被定义为与对照相比，80%的生长被抑制的浓度。

2.2.2。现场试验

菌株的斑点分析是使用在其他地方描述的方法进行的[19，20.］．简单地说，为斑点试验，5μL的五倍连续稀释m . smegmatis培养(每个细胞都悬浮在生理盐水中，直到过量₆₀₀nm = 0.1)，在无(对照)和有药物的情况下，在Middlebrook 7H10琼脂平板上染色。37°C孵育48小时后测定生长差异。

2.2.3。膜透性试验

的β-内酰胺酶的渗透活性m . smegmatis是通过测量整个细胞对硝基酚的水解来确定的，如其他地方所述[21，22］．简单地说，细胞在37°C无(对照)和2,2,BP亚抑制浓度存在的情况下生长过夜，并持续振荡。然后用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(pH 7.4)平衡细胞。将最终浓度为0.25 mg/mL的硝化芬加入1X PBS (pH 7.4)中的细胞(2ml)中，并使用双光束分光光度计(VSI-501)在486 nm处监测水解的吸光度变化，直到60分钟。

2.2.4。透射电子显微镜

处理和未处理的细胞m . smegmatis用TEM (JEOL JEM-1011)观察细胞。0.1 od的细胞₆₀₀分别接种于含药和不含药培养基中，37℃孵育24 h。样品制备和分析采用其他方法[23］．简单地说，在室温(20℃)，用2.5%戊二醛和0.1%磷酸盐缓冲液固定1小时的磷酸盐缓冲液(PBS)中收集细胞，用0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)洗涤，用1%的OsO后固定₄在0.1 M磷酸盐缓冲液中保存1小时。用乙醇将细胞脱水，干燥，包裹金，放大15000X观察。

2.2.5。药物的被动扩散

EtBr的扩散是通过使用其他修改过的协议确定的[17，24］．简单地说，在缺铁(对照)和缺铁(2,2,BP)条件下，细胞生长到指数期。细胞成球，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗两次，作为2%的细胞悬液重悬。然后用外排泵抑制剂2,4,DNP (20μg/mL)，阻断外排泵的功能。将失能的细胞成球，洗涤，再以2%的细胞悬液(w/v)重悬于PBS中，加入终浓度为4的EtBrμg/mL, 25℃孵育45分钟。用EtBr处理平衡后的细胞，然后用2%的细胞悬液(w/v)在PBS中重悬。在指定的时间点取2ml的样品，10000 rpm离心1分钟。收集上清液，在285 nm处测定吸收。

3.结果和讨论

3．1.铁缺乏对分枝杆菌生长的影响

众所周知，缺铁会影响包括分枝杆菌在内的几种微生物的生长[5］．因此，在进行任何实验之前，我们需要通过评估的增长来排除这些担忧m . smegmatis结果表明，在本研究中使用的浓度下，2,2,BP足以螯合铁，但并不影响细胞的生长。因此，成长m . smegmatis细胞在2,2,BP(一种众所周知的铁螯合剂)存在下进行评估，该浓度随后用于研究。为了查明缺铁是否导致生长缺陷，采用了微量肉汤稀释法和斑点法。数字1(一)说明了……的增长m . smegmatis在40岁时完全抑制了吗μ2 g / mL 2日,英国石油公司;然而，当细胞生长到35时，生长没有明显的影响μ2 g / mL 2日,英国石油公司。这种亚抑制浓度也被在有无35的情况下的生长曲线所证实μg/mL 2,2, BP(图1 (b))．这些结果保证了2、2、BP的浓度高于35μg/mL引起的生长抑制，因此不能用于进一步实验。

３．２．铁损耗使m . smegmatis对一线抗结核药物更敏感

用微量肉汤稀释法和斑点法研究铁的消耗是否导致药物敏感性的变化m . smegmatis．首先，我们研究了三种已知抗结核药物(EMB、INH和RIF)在不缺铁的情况下的药物敏感性。我们发现MIC₈₀对上述药物单独观察为0.25μg / mL, 4μg / mL,和2μ分别为g / mL(图2(一个))．有趣的是，当细胞由于2,2,BP的存在而被剥夺铁时，所有抗结核药物(EMB, INH和RIF)的敏感性进一步提高到62.5 ng/mL, 1μg/mL, 62.5 ng/mL。现场检测也显示，与在充足铁条件下生长的细胞相比，在缺铁条件下(2,2,BP)的细胞明显更容易受到EMB、INH和RIF的影响(图)2 (b))．生长不受检查中使用的药物的相应溶剂的影响(数据未显示)。

验证观察到的药物敏感性是否增强m . smegmatis细胞不是螯合剂的特异性性质，只是由于铁的限制，我们在其他众所周知的铁螯合剂DFO (656μg/mL)和BPS (368μg/mL)。麦克风₈₀结果显示，与在充足铁条件下生长的细胞相比，在DFO或BPS存在下生长的细胞表现出更高的敏感性(图)2(一个))．麦克风₈₀结果也得到了现场分析的证实(图)2 (b))，它清楚地描述了缺铁情况下的敏感性增强。因此，我们确定了铁的缺乏导致了增强的敏感性m . smegmatis大多数常用的一线抗结核药物。

3．3．补充铁可逆转增强的易感性m . smegmatis抗结核药物

进一步验证药物敏感性是否增强m . smegmatis观察到的细胞仅仅是由于铁的限制，我们通过将铁补充回培养基进行斑点检测。值得注意的是，当这些细胞在FeCl的存在下生长时_3.，这三种药物(EMB、INH和RIF)在缺铁情况下的易感性增强可以被挽救(图)3.)．值得注意的是，由于不同的铁螯合剂有自己特定的铁结合能力，不同浓度的FeCl_3.用来拯救经济增长。因此，铁水平和药物敏感性之间的直接联系进一步建立，当发现药物敏感性表型在添加铁的生长介质中被逆转。我们的研究结果强化了铁在增强药物敏感性方面发挥着关键作用的事实m . smegmatis细胞及其作用机制有待研究。

3．4．缺铁影响膜内平衡m . smegmatis

细胞膜由于其复杂的脂质组成而成为最重要的屏障之一，因此是大多数常用抗结核药物的重要药物靶点[25］．因此，我们探索了铁剥夺对细胞膜的影响，这反过来可能会影响药物渗透细胞膜的能力，使生物体重新敏感。为此，我们首先进行了膜通透性测定响应的铁水解硝基酚水解。硝基醚是一种著名的显色化合物，其中含有头孢菌素类β-内酰胺抗生素。当这个β水解头孢菌素-内酰胺环β-内酰胺酶，它会从黄色变成红色。当膜的渗透性增强时，硝基醚很容易进入细胞内并被水解，在486 nm处测量吸光度变化。因此，随着分光光度法的描述，增加的水解表明膜的通透性增强。有趣的是，我们的数据显示(图4(一))，与对照组细胞相比，缺铁细胞显著地表现出更多的硝化芬水解()．这意味着缺铁导致细胞膜通透性增强，这可能是更多药物侵入细胞的原因。当用著名的破坏细胞膜的洗涤剂SDS对细胞进行染色时，进一步证实了这一点。我们的结果表明，在SDS存在的情况下，缺铁细胞比对照组细胞过敏(图)4 (b))．因此，我们可以建立铁缺乏导致膜稳态紊乱，铁水平和脂质代谢之间可能存在相关性。铁与脂肪酸合成所需的GroEL1蛋白存在关联，这一事实也支持了这一观察[26］．

铁的剥夺对膜完整性的影响从TEM图像中进一步得到了证实。为了分析由于缺铁而导致的分枝杆菌细胞包膜形态或形状的任何差异，进行了TEM实验，如本节所述2．我们观察到，与不含任何药物(对照)的细胞相比，亚抑制浓度(62.5 ng/mL, 1μg/mL和62.5 ng/mL)，单独去铁(2,2,BP)，细胞包膜光滑，去铁药物处理的细胞形态被篡改，可见细胞壁厚度减少和变形(图)5)．具体来说，EMB和INH处理的缺铁细胞结构完全扭曲，而在RIF细胞结构显示丝状结构，这是不规则或异常的细菌生长，它们不分裂，但继续伸长[27］．这些形态变化通常与接触抗生素、营养物质消耗和氧化应激(如ROS的产生和DNA损伤)有关，这些氧化应激可能会影响细胞分裂或DNA复制过程[28，29］．

3．5.缺铁导致药物被动扩散增强

因此，膜通透性的增强和形态的破坏促使我们进一步探索铁剥夺对药物通过细胞膜被动扩散的影响m . smegmatis．这是通过在缺铁和缺铁条件下估计细胞外EtBr浓度来实现的，如本节所述2．很明显6(一)2,2, BP孵育45 min后，上清显示细胞外EtBr浓度增加，提示增强(值< 0.05)脱铁后EtBr的被动扩散。接下来，我们确定铁剥夺下被动扩散的增强是否也会导致已知抗结核药物通过细胞膜扩散的增强，因为现在相同的RIF可以发挥更强的作用，因为铁剥夺它可以很容易地进入细胞。为此，在缺铁和缺铁条件下，估计了RIF处理的细胞的细胞外EtBr浓度。我们观察到，与单独RIF处理的细胞相比，缺乏铁的RIF处理的细胞显示细胞外EtBr浓度再次增加，这意味着被动扩散增强(图)6 (b))．这些结果证实了缺铁对人体的影响m . smegmatis与细胞膜功能紊乱有关。

3.6。铁对维持基因毒性压力是不可或缺的

分枝杆菌通常居住在巨噬细胞内，在那里它们复制和维持恶劣的环境。一种以产生NO(一氧化氮)和活性元素物种(RNI和ROS)为特征的免疫反应是由宿主进行的，以破坏感染源。RNI和ROS具有很高的毒性，因为它们能够对DNA、蛋白质和脂类等生物分子施加损害[30.］．分枝杆菌基因组中含有高G + C含量，使其DNA极易受到损伤。在我们的研究中，我们使用了EtBr，一种众所周知的DNA损伤剂，在没有显著生长缺陷的浓度下，证实了功能性DNA修复机制的存在。有趣的是，我们观察到缺铁细胞与对照细胞相比对EtBr过敏，这表明缺铁导致DNA修复机制的破坏(图)7)．此外，为了证实铁在应对遗传毒性方面的必要性，我们在培养基中添加了铁FeCl_3.并观察到EtBr的敏感性可以被挽救(图7)．这证实了铁的存在对抵御基因毒性压力至关重要，铁的缺乏阻碍了DNA修复机制;然而，精确的机制仍然需要验证。我们的结果也很好地证实了我们在缺铁情况下观察到的形态变化，这也与影响细胞分裂或DNA复制过程的DNA损伤有关(见上文)。

3.7。药物敏感性保持不变的碱性pH

众所周知，碱性pH值与缺铁相似。这一点尤其明显，因为在碱性pH下，大多数可得铁以不可溶铁形式存在，因此代表缺铁状态[4］．因此，在本研究中观察到的已知抗结核药物在缺铁条件下的药物敏感性增强，需要在碱性条件下进行类似的药物敏感性测试，这在人类的几个小生境中都存在。为了检验这一点，我们在碱性pH下进行了类似的斑点检测，所有测试的抗结核药物(EMB 62.5 ng/mL, inh1μg/mL和RIF 62.5 ng/mL)。有趣的是，我们的实验结果显示，在生理或碱性pH下生长的细胞没有任何差异(图)8)．这表明铁和pH调节回路不是由分枝杆菌中常见的调节器控制的。

4.结论

综上所述，我们的研究结果表明缺铁m . smegmatis细胞影响细胞膜的完整性，这反过来可能会让药物更快地进入细胞，从而增强药物敏感性。MDR、脂质生物合成和铁获取基因通过共同调控的可能性也可能存在，正如已经在几个实例中观察到的，但需要进一步验证。综上所述，铁对分枝杆菌药物敏感性的影响是一种新的机制，值得进一步研究。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

拉胡尔·帕尔和赛义夫·哈梅德对这篇论文也做出了同样的贡献。

致谢

来自新德里科学和工程研究委员会(塞尔维亚)的Zeeshan Fatima (SR/FT/LS-173/2010)和来自孟买核科学研究委员会(BRNS)的Zeeshan Fatima和Saif Hameed (2013/37B/45/BRNS/1903)的青年科学家奖的财政资助得到了深刻的认可。该报告的作者非常感谢新德里全印医学研究院的萨尔曼·辛格教授提供的信息m . smegmatismc²参考菌株作为慷慨的礼物。他们感谢新德里IARI的Jasvir Singh博士在TEM实验中的帮助。他们还感谢Amity生物技术研究所所长Rajendra Prasad教授的鼓励，并为研究所的研究安排了所有设施。

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