所有媒体化学品麦德布鲁克7 h9肉汤,麦德布鲁克7 h10琼脂,白蛋白/葡萄糖/过氧化氢酶(ADC)和油酸/白蛋白/葡萄糖/过氧化氢酶(OADC)补充购买的BD生物科学(美国)。去铁胺甲磺酸盐粉(柴油),bathophenanthroline二磺酸二钠盐(BPS),渐变- 80,nitrocefin,乙胺丁醇(EMB)和异烟肼(INH)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。2,2,联吡啶(2,2,BP),溴化乙锭(EtBr)、二硝基酚(2、4、DNP)和利福平(RIF)从Himedia购买(印度孟买)。二甲亚砜(DMSO),氯化钾(氯化钾),食盐(氯化钠),正磷酸盐氢二钠(Na₂HPO₄)、正磷酸盐二氢钾(KH₂阿宝₄),钠十二烷基硫酸盐(SDS),甘油,葡萄糖和得到费舍尔科学;甲醇从默克公司购买。

菌株和文化条件。m . smegmatismc²155年是生长在麦德布鲁克7 h9 (BD生物科学)汤补充0.05%渐变- 80(σ),10%白蛋白/葡萄糖/过氧化氢酶(ADC;BD Difco), 0.2%甘油(费舍尔科学)在100毫升玻璃瓶(Schott杜兰)和文化是在37°C和孵化麦德布鲁克7 h10 (BD生物科学)琼脂媒体补充10% (v / v)油酸/白蛋白/葡萄糖/过氧化氢酶(OADC;BD Difco)固体琼脂允许增长48 h 37°C。股票指数期的文化细胞保持在30%甘油和储存在−80°C。

众所周知,铁剥夺影响等微生物的生长分枝杆菌( 5]。因此,与任何实验之前,我们需要排除这些问题通过评估的发展 m . smegmatis细胞和证明,2,2,BP足以螯合铁在这项研究中使用的浓度,它并不影响细胞的生长。因此,的发展 m . smegmatis细胞是评估的2,2,英国石油(BP),一个著名的铁螯合剂,随后集中研究中使用。找出是否铁损耗导致缺陷的增长是通过两种不同的方法,即汤采用和化验。图 1(一)说明的增长 m . smegmatis完全抑制40岁吗 μ2 g / mL 2日,英国石油公司;然而,经济增长不明显影响细胞生长时35 μ2 g / mL 2日,英国石油公司。这subinhibitory浓度也证实了生长曲线没有执行,35的存在 μ2 g / mL 2日,英国石油公司(图 1 (b))。这些结果确保2的浓度,2,英国石油(BP)高于35 μg / mL引起生长抑制,因此不能用于进一步的实验。

汤采用和现场分析是用来确定铁损耗导致的任何更改在药物过敏性 m . smegmatis。首先,我们研究了三种不同的药敏类已知的抗结核药物(EMB、异烟肼和RIF)没有任何铁剥夺。我们发现麦克风_80年以上药物单独观察为0.25 μg / mL, 4 μg / mL,和2 μ分别为g / mL(图 2(一个))。有趣的是,当这些细胞被剥夺的铁由于存在2,2,英国石油公司,所有的抗结核药物的敏感性(EMB、异烟肼和RIF)测试是进一步提高62.5 ng / mL, 1 μg / mL,分别和62.5 ng / mL。现货化验还透露,细胞铁剥夺条件(2,2,BP)明显更容易EMB,异烟肼,RIF相比增长铁充足的条件下(图 2 (b))。增长没有受到相应的溶剂的存在的药物用于考试(数据未显示)。

确认是否观察到增强的药敏 m . smegmatis细胞不是特定财产和螯合剂是由于铁限制,我们执行类似的敏感性分析的其他著名铁螯合剂柴油(656 μ(368克/毫升)和个基点 μg / mL) subinhibitory浓度。麦克风_80年结果表明,细胞生长在柴油或BPS的存在显示增加灵敏度相比,这些铁充足的条件下生长(图 2(一个))。麦克风_80年结果也证实了分析(图 2 (b)),清楚地描述了增强铁剥夺下脆弱的感情。因此,我们建立了铁的不足导致增强的敏感性 m . smegmatis细胞的大部分常用的一线抗结核药物。

进一步确认是否增强药物的脆弱的感情 m . smegmatis细胞观察是由于铁限制,我们执行现场化验的补充铁回媒体。值得注意的是,当这些细胞被种植在FeCl的存在₃增强的所有三种药物的敏感性(EMB、异烟肼和RIF)测试铁剥夺可能获救(图 3)。值得注意的是,由于不同的铁螯合剂有自己的特定的铁结合能力,不同浓度的FeCl₃被用来拯救增长。因此,铁含量之间的直接联系和药敏进一步建立非表型被发现被逆转经增长媒体补充铁。我们的结果加强铁的事实确实发挥着至关重要的作用在提高药物过敏性 m . smegmatis细胞和其作用机制需要解决。

细胞膜是一个最重要的壁垒因其复杂的脂质成分,因此一个重要药物最常用的抗结核药物的目标( 25]。因此,我们探讨了铁剥夺对膜的影响,进而可能影响药物的能力渗透细胞膜resensitizing有机体。为此,首先,我们执行膜透性的测定,以应对铁剥夺nitrocefin水解。Nitrocefin是一个著名的显色一类含有头孢菌素的化合物 β - - - - - -内酰胺抗生素。当这个 β内酰胺环水解头孢菌素的 β内酰胺酶酶,它由黄色变为红色。当膜越来越渗透,nitrocefin很容易允许进入细胞,得到水解测量吸光度的变化在486海里。因此,提高水解描绘spectrophotometrically表明增强膜透性。有趣的是,我们的数据表明(图 4(一)),在控制细胞相比,铁剥夺细胞表现出更多的水解nitrocefin显著( P < 0.05 )。这意味着铁剥夺会导致增强膜透性可能是更多的因果原因入侵细胞内药物。这是进一步证实当细胞被发现SDS著名膜破坏的洗衣粉。我们的结果描述,在SDS、铁剥夺细胞高度敏感相比,控制细胞(图 4 (b))。因此,我们可以建立铁不足导致摄动膜体内平衡和铁水平可能存在相关性和脂质代谢。还支持这一观点的事实有一个协会的铁与GroEL1蛋白质所必需的脂肪酸合成( 26]。

铁剥夺影响膜完整性的TEM图像进一步明显。分析形态学中的任何差异或形状的分枝杆菌细胞被膜由于铁剥夺,TEM节中描述了实验 2。相比,我们观察到的细胞没有任何药物(控制)、药物(EMB、异烟肼和RIF)与subinhibitory浓度(62.5 ng / mL, 1 μg / mL,和62.5 ng / mL)和铁剥夺(2,2,BP)仅显示细胞被膜光滑,铁剥夺了药物治疗细胞显示破坏形态可视化的降低细胞壁厚度和变形(图 5)。特别是EMB和异烟肼治疗铁剥夺了细胞结构完全是扭曲而RIF的细胞结构显示丝状形成不规则或异常生长的细菌在它们不分裂而是继续延长( 27]。这些形态变化通常暴露于抗生素,营养消耗,和氧化应激ROS生成和DNA损伤可影响细胞分裂或DNA复制过程( 28, 29日]。

增强膜透性和破坏形态的影响因此促使我们进一步探索铁剥夺被动扩散的药物穿过细胞膜 m . smegmatis。这是通过估算细胞外EtBr浓度铁剥夺的缺失和存在条件中描述的部分 2。很明显,(图 6(一))45分钟后孵化2,2,BP浮层显示细胞外EtBr浓度增加,暗示增强( P 值< 0.05)下的被动扩散EtBr铁剥夺。接下来,我们确定增强被动扩散下铁不足也会导致增强扩散通过膜,因为目前已知的抗结核药物相同的RIF可以更强烈由于铁剥夺它可以容易进入细胞内。为此,细胞的细胞外EtBr浓度估计接受RIF没有和铁剥夺的存在条件。我们观察到,在细胞仅RIF治疗相比,铁剥夺了RIF治疗细胞显示增加细胞外EtBr浓度再次暗示增强的被动扩散(图 6 (b))。这些结果强化了假设的影响铁剥夺 m . smegmatis与摄动细胞膜的功能。

分枝杆菌通常驻留在巨噬细胞的复制和维持敌对的环境。的一种免疫反应,其特点是代没有(一氧化氮),和电抗元件物种(RNI和ROS)安装主机摧毁传染病。RNI和ROS毒性较高,原因是他们有能力实施损害生物分子如:DNA、蛋白质和脂质( 30.]。分枝杆菌DNA基因组包含G + C含量高使其极易受到伤害。在我们的研究中,我们使用EtBr,著名的DNA损伤剂,在浓度没有显著增长的缺陷确认功能的DNA修复机制的存在。有趣的是,我们观察到铁剥夺细胞高度敏感EtBr相比控制细胞表明铁不足导致废除DNA修复机械(图 7)。此外,确认不可缺少的铁应对基因毒性,我们用铁FeCl补充媒体₃和观察到的敏感性EtBr可能获救(图 7)。这证实了铁对生存至关重要的存在对基因毒性压力和铁缺乏是阻碍DNA修复机制;然而,精确的机制仍然需要验证。我们的研究结果也证实了我们观察的形态变化下铁剥夺也已知与DNA损伤影响细胞分裂或DNA复制过程(见上图)。

作为一个已知的事实碱性pH值模拟缺铁。这是特别明显的事实在碱性pH值最可用的铁存在于不溶性铁形式因此代表铁剥夺条件( 4]。因此,增强药物过敏性已知的抗结核药物观察下铁剥夺本研究需要测试相似的药物在碱性条件存在于人类脆弱的感情在几个领域。为了验证这一点,我们执行类似的现货化验下碱性pH值存在的上述检测抗结核药物(EMB 62.5 ng / mL,异烟肼1 μg / mL, RIF 62.5 ng / mL)。有趣的是,我们的研究结果所描绘的现货化验不显示任何区别的细胞生长生理或碱性pH值(图 8)。这表明,铁和pH调节回路不受常见的分枝杆菌的监管机构。