文摘

随着多药耐药性的出现,存在几个毒力因素enterococci是一个新兴的概念。本研究采取确定流行各种毒性因素的表型和遗传型的与多药耐药性enterococci和研究他们的协会。共有310个肠球菌的分离进行了研究,包括155年大肠都有效和155年粪大肠。抗菌药物敏感性试验是由阀瓣扩散和琼脂稀释法。溶血素、白明胶酶、生物膜生产、血细胞凝集检测表型和毒性的基因,也就是说,头饰,asa1 cylA, esp,hyl,被多重PCR检测。总额的47.41%隔离高水平耐庆大霉素(HLGRE)和7.09%耐万古霉素(VRE)。所有的毒性特征研究发现在不同的比例,与多数席位粪大肠()。强大的生物膜生产商拥有asa1或头饰基因。头饰沉默基因被发现在41.37% (12/29)。然而,增加阻力,大大降低毒性基因的表达或收购。此外,负责收购耐万古霉素是重要因素失去毒性特征。不过据推测,增加耐药与毒力增加,万古霉素耐药性的收购可能负责减少毒性特征的表达来满足有关VRE“生物成本”。

1。介绍

Enterococci共生体,病原体产生双重功能。体内时,它们能很好地适应生态复杂的利基在肠道、泌尿生殖系统,和口腔纯度较低的氧化还原电位(1]。为了发挥他们的致病作用,主要步骤是坚持特定的宿主组织,其次是入侵。这些需要几个交互和宿主防御机制在不利的环境中,因此需要表达各种肠球菌的特征,最终导致毒性。

毒性在enterococci说进化”模式和节奏”类似于其他生物的致病性血统进化,一个族群与增强或减弱毒性特征可能导致感染占主导地位和出现(2]。正如抗菌素耐药性是最好的特点大肠都有效毒性特征的表征一直是最好的了粪大肠。最近流行的毒性特征研究肠球菌的分离从各种来源和引人注目的存在被发现在河水中,临床样本,牙斑,食品等等3]。随着enterococci毒性特征的出现,一些有趣的事实已经进入前列。虽然一方面通常假定增加毒性与抗菌素耐药性的增加,另一方面,成本效益分析表明,抗菌素耐药性和毒性细菌细胞健康的是两个不同的方面,因此增加抗菌素耐药性并不总是与毒性(增加有关2]。相关研究假设已报告,但没有结论的确切协会抗菌素耐药性和毒性。

毒性因素enterococci从临床分离以及环境样品已经几乎完成了在印度,尽管肠球菌的感染的患病率一直在稳步增加(4]。然而,即使有限的文档等的广泛分布特征研究[5,6]。本研究确定的患病率进行各种致病因素的临床分离株中enterococci及其耐药性。

2。材料和方法

2.1。收集和研究隔离的识别

目前的研究是在美国进行的微生物学和1200个床位的三级保健医学科学研究所的大学医院,瓦拉纳西、北印度。本研究的持续时间从2010年9月到2014年3月。这项研究是由学院伦理委员会批准。相关样本收集病人参加不同的医院的门诊和住院服务主要是临床诊断尿路感染,败血症、化脓性感染。样本直接接种于血平板,MacConkey琼脂,和半胱氨酸乳糖电解液不足(cl)琼脂,按照样品的性质。宏观上观察菌落形态和文化特征。鉴定属肠球菌革兰氏染色法的基础上,完成文化特征和生理生化测试,即胆汁七叶灵水解,PYR水解,经济增长在6.5%氯化钠和pH值9.6 [7]。进一步的物种形成是由组标准的生化测试包括精氨酸dihydrolase测试、甘露醇、山梨糖醇、山梨糖、阿拉伯糖、棉子糖、乳糖、蔗糖(美国σ)和丙酮酸(嗨媒体,印度)发酵试验,根据Facklam柯林斯分类(8]。

2.2。抗菌药物敏感性试验

药敏测试是由改性Kirby鲍尔盘扩散法与下面的光盘呋喃妥英(NIT, 300年μg)仅供尿隔离,linezolid (LNZ 30μg)(嗨媒体、印度)。执行断点麦克风对氨苄青霉素(AMP)和环丙沙星(CIP)的尼古拉斯琼脂稀释法的临床分离株9]。耐万古霉素enterococci筛查(VRE)和高水平耐庆大霉素enterococci (HLGRE)在脑心浸液(BHI)琼脂包含6μg / mL万古霉素和500年μg / mL庆大霉素,分别由琼脂稀释法(9]。耐多药耐药性是指三个或三个以上不同类型的抗生素(10]。

2.3。表型检测毒性因子

表型检测毒性因素是由以前的出版物(如前所述3,11- - - - - -13]。简而言之,溶血素的检测,隔离条纹在BHI琼脂富含人体血液的5%。β溶血周围的细菌菌落,见过24小时孵化后37°C,被认为是指示性溶血素的生产。白明胶酶生产被认为托德·休伊特琼脂中以3%的明胶。经过48小时的潜伏期,透明的光环殖民地在洪水中看到积极的隔离板和弗雷泽的解决方案(HgCl 15%₂和20%盐酸)。血细胞凝集试验是通过铂环量的增长从BHI血琼脂和混合轻轻25μL 3%的人类红细胞悬液在磷酸缓冲盐(PBS, pH值7.4)96孔microtitre板(Tarsons、印度)。血细胞凝集被旋转盘子后5分钟,然后在室温下保持盘子30分钟。所有的隔离是由半定量的检测生物膜生产试验的坚持。一夜文化BHI进一步稀释2%的葡萄糖。此后,200年μL(这些细胞悬浊液被转移到一个微量滴定板和耗氧孵化37°C其次是洗涤和干燥24小时。增长1%与95%乙醇固定和染色结晶紫溶液,持续15分钟。光密度的测量在450 nm使用一个自动化的ELISA读者。井与无菌BHI仅被认为是消极的控制葡萄球菌epidermidis写明ATCC 35984年积极的控制。强大的生物膜生产商被认为在那些与OD值> 0.5。温和的生物膜生产被认为是那些OD值> 0.2 < 0.5。

2.4。基因型的毒力基因的检测

一百随机选择隔离容易受到高强度(HSG)和万古霉素和庆大霉素100随机选择HLGRE隔离VRE隔离都进一步研究毒性基因的存在。后基因编码毒力因子分析多重PCR按照先前的协议没有修改(14),asa1(聚合物质),头饰(白明胶酶),cylA(溶细胞素),esp(肠球菌的表面蛋白),hyl(透明质酸酶)。毒力基因的检测是基于先前标准化方法,没有积极的控制,但每个反应是重复三次。PCR扩增子从几个隔离被随机PCR测序验证。所有的试剂,但没有DNA模板作为负控制每组的反应。放大16 srdna (Forward-TTGGAGAGTTTGATCCTGGCC Reverse-ACGTCATCCCACCTTCTC)作为内部控制来避免假阴性结果。对PCR反应,大约60 ng的DNA是用来避免假阳性结果。

2.5。统计分析

物种患病率和生物膜生产协会与毒性特征被卡方检验分析和比较。毒力基因和耐药被克鲁斯卡尔沃利斯测试相比。进一步发现Mann-Whitney变化的来源测试应用。都是通过SPSS统计分析15版本,SPSS。

3所示。结果

共有313个肠球菌的分离收集从尿液(298),脓(10)和血液(5)。进一步研究的主要物种。总数的隔离,氨苄青霉素抗性更常见大肠都有效显示58.7%(91 155)155(58)抵抗38.4%粪大肠而近58.06% (90 155)大肠都有效155年,65.8% (102)粪大肠隔离是耐环丙沙星。此外,83年(53.54%)粪大肠和64年(41.29%)大肠都有效HLGRE和9 (5.8%)粪大肠和13 (8.3%)大肠都有效VRE琼脂筛选法探测到。没有抵抗linezolid隔离。

考虑所有的毒性特征被发现在不同比例的表型和遗传型的隔离,如表所示1和2和图1。表型的表达毒性特征和大部分毒性基因被发现粪大肠虽然没有明显的毒力因子和物种之间的联系肠球菌研究()。在毒力基因,如表所示2,asa1和头饰是最普遍的隔离而敏感吗头饰和hyl更常见的耐药隔离。然而,没有一个隔离怀有毒性基因和44隔离没有毒性基因,表型上虽然他们演示了溶血(22隔离),血细胞凝集(19隔离),和生物膜生产(15隔离)。10肠球菌的分离并没有显示任何的表型和遗传型的毒力因素。

毒力基因与强大的生物膜生产协会()进行了研究,如表所示3。大多数强大的生物膜生产商拥有asa1或头饰基因。多个毒力基因未见与生物膜的生产。温和的生物膜生产商(OD > 0.2 < 0.5)没有与毒力相关的基因。

与毒性分析隔离电阻剖面的特征,减少表达和拥有毒性基因被认为与增加的多药耐药性(MDR)(表4)。隔离与抗氨苄青霉素,环丙沙星,HSG但容易万古霉素和呋喃妥英表示比耐万古霉素的毒性因子。这种差异在电阻剖面和毒力基因的分离是重要的物种()。此外,Mann-Whitney组件显示采集的万古霉素耐药性以及MDR表型()是变化的来源。

4所示。讨论

肠球菌的感染是最重要的一个全球健康问题造成相当大的发病率一般人群。我们研究了两个主要的物种最相关的肠球菌的感染,也就是说,粪大肠和大肠都有效。而粪大肠是常见的物种,大肠都有效同样获得重要性和主要的孤立的物种在许多中心,在我们(15在这个研究。从流行病学的角度,增加耐药性在enterococci负责的出现大肠都有效作为优势种特别是VRE隔离。而且,毒性特征更突出大肠都有效比粪大肠(3]。然而,尽管毒性特征更频繁地出现在粪大肠在我们的研究中,没有明显毒性因子和肠球菌的物种之间的关系研究协会()。

细菌粘附宿主组织是一个十分重要的步骤,启动任何感染的过程。在这方面,enterococci有几个选项。大部分的毒性基因通常包庇,即esp,cylA,asa1,已经与依从性有关。通常这些基因位于基因组的指定区域,独特的标记为“致病性岛”(16]。Esp有助于坚持膀胱壁通过粘蛋白和uroplakin受体从而帮助肠球菌的殖民和毅力在尿路17]。同样的,asa1一直在坚持看到帮助肾细胞(16]。虽然溶细胞素表达式是并发溶血素生产,溶细胞素的不同组件包含五个基因操纵子(cyl1,cyl2,cylA,cylM,和cylB)已被归因于这种溶血18),不是一个。这是反映在我们的研究cylA基因只是出现在隔离而溶血素产量的5%被认为在39%的隔离。在另一项研究中,将近75隔离与溶血素活动都为阴性cylA基因显示可能的其他基因的作用在溶血素活性19]。此外这项发现强调了需要测试的表型和遗传型的毒力因素。

各种研究毒性因素enterococci目前报告了他们的广泛分布。相比我们的研究中,在最近的一项研究来自南印度,溶血素生产被认为在临床分离株的82%,而白明胶酶生产了40.6%的隔离(5]。甚至共生体隔离enterococci显示,44%溶血素生产和32%白明胶酶生产在另一项研究[20.]。

除了毒力基因,红细胞凝集属性是一个可预见的措施依从性(12]。血细胞凝集在隔离的21.93%。甘露糖和葡萄糖受体的尿路帮助粘附肠球菌的分离显示血细胞凝集活性。这是感兴趣的知道这些丰富的通常是可转让的其他菌株质粒的形式(21]。财产血细胞凝集enterococci毒力因子的研究较少,和总缺乏这一因素已经报道的上述研究牙髓学的隔离(22]。

enterococci中生物膜的形成是一个多个防御机制逃避行动持续感染的抗生素和帮助,特别是在留置导管(23,24]。有趣的是,大多数的强大生物膜生产enterococci孤立从泌尿道感染患者留置导尿管(29 62年生物膜生产商,46.7%),其中22个(75.86%)病人室内。留置导尿管、使用血管内设备和长期住院治疗研究是肠球菌的感染的重要危险因素(25]。更高的生物膜的形成率(86.6%)已报告来自印度的尿隔离enterococci [16),而另一项研究报告了生物膜的形成的牙髓学的肠球菌的分离(22]。

尽管所有的遗传因素,即头饰,特别是,和asa1,在enterococci与生物膜的形成,在这项研究中头饰单独或组合是最著名的毒性行列式在生物膜生产商。尽管所有白明胶酶生产商窝藏了头饰基因,相反的是不正确的。的检测头饰沉默的基因41.37%(12/29)的隔离可以由几个原因占由其他研究[26],它清楚地显示表达式头饰在对数生长期后期触发高细胞密度。他们的存在在临床分离株在最佳条件下同样重要,因为他们的表达在活的有机体内可能增加感染的严重性。对比研究证明esp相关的生物膜的形成(24),我们发现esp在大多数隔离的独立的生物膜的形成。

由于不断变化的流行病学,增加耐药性enterococci一直负责的出现大肠都有效作为优势种特别是VRE隔离。这样的一个事实是VRE的出现和迅速增加临床感染的程度大于25%的肠球菌的感染是由于VRE大肠都有效在我们ICU (27]。而且,没有观察到毒性特征更加突出大肠都有效比粪大肠(3]。毒力基因”esp”这是一种流行病克隆的标志大肠都有效,已经蔓延到整个国家28)不是很大程度上在本研究中发现。这可能是由于早期引入这个克隆复杂的设置。

环境研究肠球菌的分离从恒河水在瓦拉纳西,印度,我们的研究,显示多个肠球菌的物种的患病率和多种毒性特征的不同肠球菌种虫害从地表水(29日]。同样的研究也显示,河水VRE患病率的增加在网站有农业农场,密集的牲畜,和猪所在地农业和医院污水排放点。广泛传播的毒性标记河水可能是由于自然水平的毒性特征转移致病性enterococci从医院从而导致进化的耐多药和multivirulent enterococci [29日]。

抗生素抗性因素、溶细胞素毒素生产、白明胶酶生产、聚合物质,和肠球菌的表面蛋白的一些特质渗透到该物种在不同程度上,从而增加enterococci的致病性。随着大多数毒性基因plasmid-borne,他们很少拥有在不寻常的肠球菌的物种可能表明,新兴的物种尚未面临致命的决定因素的广泛传播的主要物种。这方面的另一个解释可能是这些新兴生物的健康成本,尽管新兴这些分离株的耐药性是充分足够的为了更好的生存,消除额外的毒性特征的要求。

以前一直认为,通常的假设是,增加抗菌素耐药性与增加毒性以及死亡率增加。但是因为研究表明,死亡率独立于电阻剖面特别是VSE VRE和MSSA MRSA病例,这是猜测,增加生存健身减少了其他的一个方面3]。在这种背景下,一个非常相关的发现应该提到。看到,在社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)的情况下,基因区域与β内酰胺阻力有关,即“SCCMecA,”小和可转换的医院相比获得耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(HA-MRSA)。因此,为了满足携带更大的“适应性”成本元素,HA-MRSA低毒素生产商或拥有者的其他毒性元素相比CA-MRSA [30.]。同样,它已经看到了enterococci严格监管的表达抗因素大大降低了有关VRE“生物成本”。这种类型的严格监管是更常见的在横向转移元素enterococci耐药性和毒性等因素(31日]。因此,电阻剖面可以增加与减少毒性,如图2。这可以解释为万古霉素耐药性的事实,表达对enterococci生物昂贵,所以这种机制是严格监管和获得只有当它对细菌的生存至关重要31日]。为了进一步降低健身成本,获得这些质粒补偿损失的毒力质粒。

虽然没有明确,上述事实可以证明在其他研究来自印度和其他地方类似的发现。在一项研究中,目的是确定毒性的差异表达的因素VRE VSE,这显然是发现溶血素生产和生物膜的形成等因素在VSE比VRE隔离,但差异无统计学意义(6]。同样的,在另一项研究中,观察到的存在hyl基因,以及同时存在的hyl和esp基因和细菌粘附维洛细胞,更比VRE VSE隔离,从临床和环境资源(32]。在试点研究肠球菌的泌尿道感染相同的中心,VRE隔离具有显著减少毒性因素比敏感隔离(33]。

应该注意的是,多数耐药因素enterococci和毒力基因plasmid-borne对此巨大的基因交换intragenically和能力(1]。因此获得一组质粒可能导致损失的其他由于不兼容或由于健身成本效益。这些猜测只能适用当进一步的研究在这些方面的毒性和enterococci完成。多少还有待揭示关于生存和耐药性和毒力因素之间复杂的相互作用。

5。结论

从这项研究中,我们得出的结论是,毒力因素已经广泛流行在临床来源肠球菌的分离。然而,似乎存在一个严格和复杂的调节机制的表达这些致病因素尤其是抗生素耐药性enterococci以便能以最小代价获得最大利益而发挥其对宿主细胞致病性的影响。本研究总结了观测协会的毒性和耐药性enterococci,强调需要进一步研究水平基因转移的作用和enterococci的防御机制。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。