没有多态性Plasmodium falciparum K13印度加尔各答临床分离物中的螺旋桨基因

摘要

与青蒿素抗性相关的分子标记疟原虫疟原虫尚未明确。最近的研究表明多态性K13基因与青蒿素抗性有关。本研究旨在了解螺旋桨区域的多态性模式K13五年法案实施后从城市加尔各答收集的临床分离株中的基因。我们收集了来自Urban Kolkata和Creamenced Propeller地区的59个临床分离株K13基因在51中成功分离。我们没有发现任何孤立的任何突变。所有患者都反应了该法，是Artesunate +磺酰胺 - 吡米胺的组合。药物方案在研究区仍然有效，并且没有通过野生基因型证明的抗蒿属植物的抗性的迹象K13所有分离物中的基因研究。

1.介绍

特别是抗疟药（AMDS）抗性的出现疟原虫疟原虫对抗疟疾是一个严重的问题。在20世纪90年代P. falciparum.在所有疟疾流行国家的所有疟疾流行国家中获得对氯喹（CQ）和磺基胺 - 吡米甲胺（SP）的抗性。世界卫生组织（WHO）推荐青蒿素组合治疗（ACT）作为一种治疗所有简单的第一线代理恶魔饼疟疾全世界。在引入行为并增加使用杀虫剂处理的床网（ITBNS）后，死亡率和发病率恶魔饼疟疾在全球减少[1包括印度在内的[2那3.]．不幸的是，在几年之内P. falciparum.抗蒿蛋白的抗性。青蒿素抗性由更长的寄生虫清除时间在体内疗效研究和体外环阶段存活测定中定义[4.-6.]．柬埔寨西部首次报告了青蒿素耐药性[7.那8.] 2009年。现在它已经遍布东南亚国家[6.那9.-13.]．

Act，Artesunate +磺基胺 - 吡米甲胺（AS + SP）的组合于2009年首次在印度引入，以治疗所有简单的恶魔饼案件。以前的行为仅在一些高风险场所，如纯粹的西孟加拉邦和墨西哥州墨西哥州墨西哥州。几项疗效研究表明，这种组合在国家的各个地区仍然有效[14.那15.]除了东北部[13.在+ SP已被替摩尔+ Lumefantrine取代。抗疟药药效监测每两年一次都可以预测耐药性的出现，如果有的话。虽然体内治疗疗效研究仍然是本用途的金标准，但分子标记也被验证为替代工具。单一突变，K76T.在Pfcrt.，是CQ抗性的标志[16.那17.]和一个Quintuple突变pfdhfr.和PFDHPS.基因与SP电阻强烈相关[18.]．最近在螺旋桨区域中的多态性P. falciparum.Kelch蛋白质（K13发现基因）已发现与青蒿素抵抗有关[19.]．多态性K13来自不同国家的基因已报告[9.那19.-26.]但印度的报告是稀缺的。最近，一份报告显示突变K13基因是有限的[27.]在从该国东北部隔离的菌株中。本研究涉及螺旋桨区域的多态性模式K13临床分离株中的基因在印度加州加尔各答，经过五年的法案实施。

2。材料和方法

2．1．研究地点和血液样本的收集

该研究在2014年1月至12月，加尔各答热带医学研究室的原生植物单位附加的疟疾诊所进行。在常规实践中，诊断通过显微镜染色后的厚薄血膜染色。报告和药物在同一天分发。所有待遇P. falciparum.患者被建议在第1、2、3、7、14、21、28、35和42天到诊所复查。显微镜下采集2 ~ 3 mL EDTA血样P. falciparum.在14岁以下的儿童患者/监护人的知情同意或同意后分发报告和医学患者。通过加尔各答，加尔各答加尔各答学院的制度伦理委员会审查和清除了研究议定书。

2.2。DNA孤立

P. falciparum.使用QIAAMP DNA血液迷你套件（Qiagen，Hilden，德国），从制造商的说明中与全血样品中分离出基因组DNA。将所有样品的提取DNA保存在-20℃下，并使用等分试样作为DNA源进行进一步研究。

2.3。嵌套的PCR和测序K13基因螺旋桨区域

螺旋桨域K13通过嵌套的PCR方法扩增基因，如Ariey等，2014,2014。所有扩增反应在20个最终体积中进行 μ.l为初级PCR和50 μ.L用于嵌套PCR。寡核苷酸引物和PCR条件总结在表中1．

在溴化乙锭染色后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物的质量和浓度。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN）纯化嵌套的PCR产物。测序从Amnion Biosciences PVT外包。Ltd.，班加罗尔，印度。

2.4。序列分析

使用自由软件BioEdit序列对准编辑器7.0.5.2分析序列，并使用在线序列对准工具Clustalw与PF3D7_1343700 Kelch蛋白质螺旋桨域的序列对齐。

结果

在研究期间，共有8877名发热患者参加了诊断和治疗的诊疗疟疾。其中1223年是阳性的P. Vivax.107是阳性的P. falciparum.．两者混合感染的存在P. Vivax.和P. falciparum.不能被排除，因为未进行确认的分子方法。107.P. falciparum.采集了59例患者的血样。虽然这不是一项疗效研究，但所有接受治疗的患者都进行了临床和寄生虫学随访，如前所述。59例患者均对AS + SP治疗有反应，即治疗后6周无复发记录。

在59个样品中，螺旋桨区域的测序K13基因在51个分离物中进行。在与PF3D7_1343700对准之后，发现所有51个序列完全从核苷酸编号1327-1927到1998（密码子443-666）对齐，即，从螺旋桨区域的刀片1到螺旋桨区域的叶片5K13基因。在叶片中，部分研究了6序列。所有菌株都是在基因的该区域中没有多态性的野生型。核苷酸序列K13基因P. falciparum.研究现场的孤立已经在加入号码KR779827.1下提交了Genbank。

4。讨论

与氯喹和硫代胺 - 嘧米甲胺抗性不同，抗氟脲抗性P. falciparum.尚未明确定义，因为除了化疗和环阶段存活测定后延迟寄生虫清除延迟寄生虫清除（RSA）[7.那9.]．这些参数是寄生虫对氨化蛋白衍生物的抗性出现的指示。WHO [28.]对疑似部分青蒿素耐药性的定义如下:10%/以上的患者在接受青蒿素单药治疗后第3天镜检发现持续的寄生虫血症，或存在耐药性相关突变K13在治疗后，至少5％的患者或寄生虫清除的基因在5小时内。确认的部分青蒿素抵抗被定义为存在K13至少5％的患者的抗性相关突变在第3天通过显微镜或寄生虫清除在治疗后≥5小时的寄生虫清除血症患者。为了保护青蒿素衍生物的功效，已经停止了这种药物的单药治疗，并建议使用另一种长的伴侣药物。因此，对任何行为的疗效研究并不是单独处理青蒿素的疗效。作为作用抗性的明确表型非常罕见，在标记基因中多态性与疗效结果非常难以相关。Ariey等，2014年[19.]，最近显示了四种多态性，C580y，Y493H，R539.T.和M476l在螺旋桨区域K13基因与青蒿素耐药性密切相关。在这一发现之后，一些工作人员报告了这个基因中的一些snp，特别是在世界不同地区的螺旋桨区域[9.那19.-26.]．

在本研究中，我们发现53例患者在第1天清除了寄生虫，其余6例患者在第2天清除了寄生虫。我们没有在基因的螺旋桨部分发现任何突变，这种突变的报道在这个国家也是罕见的[27.]．然而A578的突变S.毗邻C580y据报道，从邻近的国家孟加拉国报告了导致寄生虫清除率的主要突变[22.]和F446的突变一世来自缅甸[26.]．

5.结论

加尔各答在五年前就引进了ACT。由于我们在研究中没有考虑到寄生虫清除半衰期或环期生存试验，而且样本量也很小，所以很难评论对它的耐药性的出现。如果确定的snp与青蒿素耐药性之间的联系是正确的，那么这一基线信息表明，在加尔各答城市地区普遍存在这种情况恶魔饼人口对青蒿素仍然敏感。来自国家不同地区的类似研究及其与延迟寄生虫清除和RSA的关联将有助于确定蒿素抵抗的出现，如果有的话。四肢和Quintuple突变pfdhfr.和PFDHPS.来自国家的不同地区报道了基因[29.]．随着SP用作合作伙伴作用药物，应以两年的规则间隔监测这种组合的体内疗效研究。

利益冲突

作者没有关于本文报告的工作的利益冲突。

作者的贡献

Ardhendu K. Maji和Swagata Ganguly设计了这项研究;Moytrey Chatterjee、Swagata Ganguly、Pabitra Saha、Subhasish K. Guha和Nandita Basu对患者进行临床检查、招募和随访，并收集血液样本;Swagata Ganguly提供了治疗;Moytrey Chatterjee、Swagata Ganguly和Pabitra Saha评估了实验室诊断和分子研究。Moytrey Chatterjee、Pabitra Saha、Biswabandhu Bankura和Madhusudan Das进行了数据分析和解释。Ardhendu K. Maji、Swagata Ganguly、Moytrey Chatterjee和Nandita Basu准备了这篇论文。

致谢

作者感谢所有参与这项研究的患者，也感谢西孟加拉邦政府科技部对这项研究的财政支持。

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