证明原则实时病原体隔离媒体诊断:利用激光诱导击穿光谱区分细菌病原体和Antimicrobial-Resistant金黄色葡萄球菌菌株生长在血琼脂

文摘

激光诱导击穿光谱(LIBS)是一种快速、原位诊断技术,激光等离子体光排放形成样本用于分析允许自动分析结果可在几秒到几分钟。这个速度的分析加上很少或没有样品制备使库一个有吸引力的检测工具。在这项研究中,它是证明中可以用来区分细菌和细菌菌落菌株生长在血琼脂。一个歧视的算法是基于光谱数据的多元回归分析。算法是部署在一个模拟填词仪表系统演示使用6种歧视能力。转基因金黄色葡萄球菌菌株生长在英国航空公司,包括同基因的集收购只不同的突变增加梭链孢酸或万古霉素耐药性,也被歧视。该算法成功地确定在本研究中使用的所有13个文化在2分钟的时间。这项工作提供了证据的原则中仪器系统,可以为快速开发的歧视的细菌物种和品种展示相对较小基因组改变使用收集的数据直接从病原体隔离媒体。

1。介绍

这项工作的目的是评估激光诱导击穿光谱(LIBS)作为细菌的快速歧视文化的工具。填词是感兴趣的对于这个应用程序,因为它的速度分析,因为标准识别实践无法轻易区分所有细菌病原体的殖民地。在库,一个激光脉冲聚焦到样品蒸发和激发μg ng大量材料和生成微等离子体或激光火花。光的火花被收集和定向到光谱仪生产记录的光谱。光谱信号的频谱代表结合原子和分子的样本和周围的气氛。由于微等离子体是由聚焦的光线,通常不需要样品制备和,与自动分析,结果是可用的几秒至几分钟。幽默是一种分析技术,是原子发射光谱的结果大约在1860年,样本被放置在一个火焰和观察到的颜色被用于分析(1]。因为这些早期的实验中,等离子体激发来源如电极火花和电感耦合等离子体已经被开发出来。第一个报告使用激光脉冲的光谱化学激发出版于1963年(2]。自那时以来,激光火花已经被充分研究过的特点,和库进展从一个新奇的经过验证的分析技术。中已经应用在广泛的应用程序,包括工业加工、环境监测、煤分析,排序的金属和塑料,文化遗产的研究,检测水中的有毒金属,检测炸药,生物、化学材料、岩石和土壤分析,气溶胶分析和微量元素检测的新鲜蔬菜和食品粉末(3- - - - - -5]。中已经达到了技术接受的状态,甚至有一个LIBS仪器操作了火星表面(ChemCam)。大多数应用程序依赖于分析元素的发射谱线观测的LIBS光谱。最近,先进的最优化(6)或其他分析技术已经应用到填词光谱分类和识别复杂的材料除了传统的元素分析。幽默作为一种工具已被调查细菌属和物种歧视的菌株(7- - - - - -14]。中也被用于区分病毒(15]。

以前,区分细菌种类的能力,利用收集的数据直接从病原体隔离媒体使用最优化方法应用于LIBS光谱,已经证明(15]。在这里,我们将演示使用库歧视更复杂的细菌种类和品种比以前演示了使用最优化分析结合的方法构建LIBS检测算法适合部署在填词仪器(11,15,16]。这项工作与以前公布的工作被别人的不同之处在于,不依赖于库进行比较,分析和分析不依赖于个别元素的识别排放。给出的分析是将LIBS光谱的结果是指纹细菌物种和菌株的菌落形成血琼脂。选择这个研究是常见的致病细菌物种(鲍曼不动杆菌,大肠杆菌,肺炎克雷伯菌,铜绿假单胞菌,金黄色葡萄球菌),枯草芽孢杆菌和紧密相关金黄色葡萄球菌菌株生长在血琼脂,以及同基因的金黄色葡萄球菌菌株只有通过收购不同的突变导致增加梭链孢酸或万古霉素耐药性质粒。

2。方法

2.1。菌株建设、表征,和准备库分析

的菌株利用研究中所描述的表1。简单地说,金黄色葡萄球菌应变SH1000是一个标准的野生型实验室金黄色葡萄球菌用于基因操作和应变SH1000-1 SH1000梭链孢耐酸变异,选择了Mueller-Hinton琼脂(Difco实验室)板包含2毫克l⁻¹梭链孢酸。选择耐梭链孢酸后,梭链孢酸最低抑制浓度中等收入国家确定标准液体媒体如前所述[17]。金黄色葡萄球菌菌株LP9, MM61、MM66 MM66-4也被先前描述(11,17]。基于pulsed-field凝胶电泳染色体RFLP分析,MM61 hetero-vancomycin-intermediate高度相关金黄色葡萄球菌(hVISA)应变MM66 [17)和MM66-4 vancomycin-intermediate金黄色葡萄球菌(签证)MM66突变(17]。

比较基因组测序(CGS)由罗氏公司罗氏公司提供的服务。(美国麦迪逊,WI)是用于映射和全基因组突变突变基因测序,比较亲株MM66 SH1000 MM66签证突变MM66-4和梭链孢耐酸突变SH1000-1,分别。一个金黄色葡萄球菌瓷砖数组用于杂交试验(SH1000-1和MM66-4)和参考(SH1000和MM66)基因组DNA,和单核苷酸多态性在每个应变被确定基于先前定义的标准(23]。基因组的瓷砖数组金黄色葡萄球菌针对MM66-4和应变测试MM66上校金黄色葡萄球菌应变对SH1000-1 SH1000 NCTC8325测试。

野生型RN4220也是一个标准金黄色葡萄球菌实验室菌株用于遗传操作。RN4220 -fai1是由electroporating [24与质粒RN4220 pCL52.2::fai1,这是一个大肠杆菌- - - - - -金黄色葡萄球菌穿梭载体pCL52.2 [25)包含一个fai1(梭链孢酸诱导1或SACOL2347) [26克隆扩增子pCL52.2 HindIII-EcoRI网站的。的fai1基因编码一个公认的药物外排泵的函数是未知的,这是高度调节后SH1000梭链孢酸感应(26]。的fai1聚合酶链反应扩增子生成的利用SH1000染色体DNA孤立如前所述[27)与fai1引物,fai1- f (TTACTGTCGGGAATTCGTTGTTCCTGGAATGAACGCTGAAG)fai1- r (GGTAATAAAAAAGCTTATCGATAACCATATTTGGCACCGATACT)。这fai1扩增子的大小是2079个基点,包含整个fai1编码区(1932个基点)以及57基点上游,90基点downstream-flanking序列。

准备所有菌株库分析,细菌飞跑到新鲜Luria肉汤琼脂(LBA)板一夜之间被允许种植(37°C, 18小时)。单一的殖民地LBA板被飞跑到5%(卷/期)牛血琼脂(BA)板,然后一夜之间可以孵化。第二天早上,创建一个更大的表面积的细菌材料库数据收集,BA板上的殖民地被分布在整个表面的BA板使用ethanol-flame玻璃曲棍球棒。

2.2。填词光谱采集

试验装置用于库数据收集从未经变质处理的BA板和英航文化一直在前面描述的(15]。短暂,从q开关脉冲Nd: YAG激光(1064 nm 60 mJ /脉冲10 Hz)都集中在样品通过定向开板结束对激光和引发病原体英航覆盖。激光能量被选实验,火花导致LIBS频谱强劲的强度但不饱和了探测器可以生成表面的BA板从远处BSL-2罩外。数据收集与英航样本位于生物安全罩。等离子体光收集使用一个离轴抛物面镜和光纤,然后路由到一个双通道光谱仪/探测器系统(旅行车AvaSpec-ULS2048-2-USB2)。因为样品是手工移动前的激光目标病原体表面的英航和确保每个光谱的新鲜点,lens-to-sample距离数据收集期间发生了微妙的变化。抛物面反射镜上的一个洞允许激光脉冲的光路和光收集共线,消除视差的样本距离的变化。每个记录光谱的平均10单发光谱(检测器采集参数:1μ1.1秒的延迟,msec窗口)。共有100名平均光谱从每个样本收集。代表光谱大肠杆菌和金黄色葡萄球菌如数据所示1(一)和150 (b), 100年的光谱被用来建立识别模型和剩余的50被用来测试模型(验证光谱)。其他数字校准和验证的光谱可以选择光谱组,根据以往的经验,但每个都为本研究选择的50。

2.3。数据分析

这里使用的数据分析过程被描述之前(11,15]。短暂,区别样品或样本组,开发数学模型然后用于预测流基于顺序筛选[28]。歧视模型变量是基于偏最小二乘回归与主成分分析相结合。这种技术,称为请或部分最小二乘,尤其有用,当试图预测因变量集从一组非常大的独立变量。对于这个分析,因变量是样本,与样品相关的独立变量是每个波长的强度测量,也就是说,填词光谱,包括4096个频道从232年在波长1026纳米。一旦模型生成的示例类,其预测能力是评估使用验证光谱同时收集光谱用于构建模型。图1(c)显示了二维分数空间情节第一模型的两个主要组件(PC)。通常情况下,超过80%的建模可以解释观测到的仅使用这两个组件。通过模型运行的结果验证光谱预测价值(在这种情况下,通常是在0和1之间)用于匹配测试样本的样本类。预测价值以外的范围是0到1,表明某种程度的光谱建模和验证光谱之间的不匹配。对于这个实验,不匹配可能归因于波动的耦合激光脉冲为样本数据收集期间。改变脉冲和示例的耦合将导致光谱差异影响模型预测。然而,不匹配光谱仍然可以使用这种方法分类的所有重要的分类预测价值在于是否高于或低于差异化的价值选择。

的例子库分类集光谱,获得了样品和用作输入要创建PLS1回归模型,如图所示2各种细菌种类调查和图3为金黄色葡萄球菌菌株。起初,光谱似乎非常相似,但是仔细观察,元素成分差异清晰可见。对所有样本,排放的Mg, Na, N, O, Ca是观察到但有这些元素的光谱强度的差异相比整个样本光谱。这些元素线及其相关强度的差异有助于创建一个独特的4096年的变量设置为每个样本。

一个好的歧视模型被认为是导致一个足够宽的分离的预报值两组被歧视,这样可以画一条线以上所有预测值是可靠地与一个样本组相关联。验证样本预测最高的值将被视为匹配样本被歧视。样本预测较低的值会被视为匹配样品不被歧视。拥有这样一个分离的能力是至关重要的填词仪表上部署检测算法。图1(d)说明了这个过程。最好的模型有一个广泛的分离从验证光谱获得的预测价值。提高观察到分离,从个人光谱预测值平均为50(通常在某些情况下更少更少的光谱可用于测试模型性能时因为饱和光谱被排除在分析)。一旦创建一个好的模型,模型放置在算法流程,样品组歧视被歧视的过程,这个过程被重复区分剩下的样品,直到创建一个模型区别另一个样本组。重复此过程,直到所有的样本组标识创建整体检测算法。

它应该明白这里的执行类型的分析检测细菌在一定目标矩阵(如琼脂)和周围的气氛。所收集库谱是信号从三个来源的组合。改变了隔离在各种媒体或歧视隔离媒体需要发展的一个新算法,该算法包含了LIBS光谱数据从所有团体被歧视。此外,填词频谱的影响等参数测量激光脉冲能量、lens-to-sample距离和探测器时间参数。这里使用的lens-to-sample距离(30厘米),探测器时间参数(1μ1.1秒的延迟,msec集成周期)和脉冲能量(60 mJ)被选来生成一个强大的记录频谱不饱和排放特性。为了获得最佳性能,这些参数的值,用于记录光谱用于模型开发应该同意那些用来区分实际样品。当考虑填词仪表的开发病原体的歧视使用收集的数据直接从病原体隔离媒体,这些约束转化为歧视算法根据仪器及其使用计划。在这部作品中,能够识别不同样本在一组预定义的样品(污染物+矩阵)固定实验采样条件LIBS-based仪器的成功发展的关键。此外,提出的方法是非常有用的用于开发库工具为特定的应用程序中抽样条件可以是固定的,样品是歧视可以为特征,可变性和自然样品可以捕获检测算法。本研究中创建的特定算法仅适用的设备配置用于收集这些数据,只有检测血琼脂病原体分离矩阵的媒体选择。不过,不同的设备配置的检测算法开发方法或不同的病原体和/或病原体隔离媒体将是相同的。

3所示。结果

3.1。Antimicrobial-Resistant突变特征和敏感的同基因的菌株金黄色葡萄球菌

正如所料,金黄色葡萄球菌应变SH1000-1证明梭链孢酸增加麦克风(32毫克/升)比亲本菌株SH1000 (0.125 mg / L)。内的突变fusA编码梭链孢酸的目标,延长因子G,与梭链孢酸阻力金黄色葡萄球菌(29日]。CGS发现总共5产生的基因内的突变SH1000-1 SH1000相比(表2)。SH1000-1的突变是产生突变fusA(表2),以前决心传达梭链孢耐酸性金黄色葡萄球菌(29日]。四个额外的突变影响3密码子的基因编码一个假定的噬菌体蛋白也在SH1000-1发现,然而,任何角色这些突变可能对收购梭链孢耐酸性金黄色葡萄球菌需要进一步调查。

研究生院理事会确认MM66-4总共包含了8个染色体突变亲本菌株相比MM66(表2)。其中一个发生了突变,出现在yycFG编码一种监管体系控制细胞壁自溶(30.,31日),而改变yycFG转录已经涉及到签证的控制机制(32]。

3.2。创建一个歧视算法使用多元回归分析

使用上面描述的方法(识别一组样本,把它从分析,创建一个歧视模型区分下一组的样本,然后重复这个过程,直到所有样本已分化)可以创建一个歧视算法能够正确地识别所有样品包括在这项研究中。图4显示了算法结构。未经变质处理的BA(空白)是最容易辨别的样本。一旦样品被撤的歧视,这是那么容易分离金黄色葡萄球菌英航文化作为一个群体,随后,分别歧视。后金黄色葡萄球菌样本从分析集,下一个简单的示例歧视是铜绿假单胞菌,紧随其后的是答:baumannii,k .肺炎,枯草芽孢杆菌,大肠杆菌。最困难的样品研究小组的区别枯草芽孢杆菌和大肠杆菌就是明证歧视流的最后位置。参见图5情节的预测价值获得在这些模型使用验证谱进行了测试。为金黄色葡萄球菌样本组,最简单的示例从研究小组MM66-4歧视,而SH1000-1和RN4220是最难以区分与其他菌株之间下降。图6显示了预测块值获得光谱在这些模型进行了测试验证。

4所示。讨论

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是所有的院内传播感染的主要原因以及社区获得性感染(33,34]。答:baumannii,铜绿假单胞菌,k .肺炎还危及生命的卫生保健相关社区获得性感染的主要贡献者(35- - - - - -38]。

在这里,我们演示了使用库来区分这些细菌致病革兰氏阳性微生物物种和模型枯草芽孢杆菌,从样品生长原位BA板表面。金黄色葡萄球菌不形成孢子而枯草芽孢杆菌前孢子和细菌进化过程相关联而系统放置在细菌类群厚壁菌门(39]。a . baumannii铜绿假单胞菌,k .肺炎,大肠杆菌也系统相关的所有位于细菌类群Gammaproteobacteria [39]。自使用填词病原体歧视依赖元素发射激光产生的等离子体激发的元素在活着的细菌种类和英航增长表面,而不是进化亲缘进化关系没有重现。

所有的病原体在这项研究中已报告进行分析,以获得突变(s)或横向传播基因允许他们抵抗抗菌素的作用旨在治疗这些病原体引起的感染37,38,40- - - - - -42]。在过去的近60年,万古霉素仍严重感染的治疗选择乘antimicrobial-resistant耐甲氧西林所致金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)。万古霉素目标后期的革兰氏阳性菌的肽聚糖合成绑定的终端D-alanine-D-alanine残留预防细胞壁肽聚糖前体合成(43,44]。自1997年第一批签证隔离报告(45),源源不断的报告签证菌株已经出现在文献[46]。hVISA表达低级耐万古霉素,总体而言,然而在接触万古霉素,这些菌株产生选择签证细胞亚群(17]。hVISA和签证表型被归因于多种毒株特异性突变,包括基因影响肽聚糖的代谢,导致生产的肽聚糖层变厚,一个属性与签证相关机制(46]。MM66-4是一个签证MM66同基因的突变体不同的8点突变亲本菌株相比MM66。尽管很难确定哪些8的突变导致签证机制,我们怀疑突变yycG可能被证明是重要的万古霉素耐药性升高中观察到MM66-4 MM66相比。

梭链孢酸是一种新型抗菌药物使用类固醇在欧洲和澳大利亚,与利福平相结合,提供了一个选项用于治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染(47]。梭链孢酸干扰细菌蛋白质合成,防止延长因子的释放G-GDP复杂的核糖体(48]。SH1000-1的梭链孢耐酸突变亲本菌株SH1000港口5基因内突变,包括突变之前证明授予梭链孢耐酸性fusA,编码梭链孢酸目标延长因子G。

我们已经表明,填词结合最优化分析可以用来区分mutation-mediated抗药性突变体和家长的特点金黄色葡萄球菌种植在英航。应变对歧视使用库包括相关vancomycin-susceptible应变MM61 hVISA应变MM66;MM66和签证MM66-4;和梭链孢耐酸SH1000-1 SH1000。填词分析还歧视RN4220 RN4220——从改变同基因的压力fai1,港口pCL52.2::fai1将质粒编码功能,港口一个独特梭链孢酸诱导基因和编码四环素耐药性。

我们推测,独特的基因改变歧视从MM61 MM66 MM66 MM66-4,从SH1000-1 SH1000, RN4220 RN4220 -fai1导致细胞足够的调整元素成分和/或可能,能够降低血液在英航,填词分析现在可以区分这些菌株生长在英航紧密相关。很可能整个肽聚糖结构和代谢的改变相比MM61 MM66和MM66 MM66-4有助于元素改变,允许LIBS歧视这些菌株。

确定细菌病原体的身份和抗菌素耐药性表型,尽可能快,必须在确定抗菌疗法将最适合病人遭受感染引起的细菌性病原体。这项工作增加了增长LIBS-bacterial病原体歧视文学,那证明LIBS技术可以用来区分细菌物种生长在英航。它还演示了LIBS技术快速识别的潜在antimicrobial-resistant细菌敏感的生物原位在英航的增长。

利益冲突

所有作者宣称这种出版不存在利益冲突。

确认

所有作者要感谢Wanqin Yu的技术帮助完成这项研究。他们也希望承认之前来自美国国立卫生研究院的支持:SC1GM083882-01(约翰·e·Gustafson);R25 GM07667-30 (NMSU-MARC项目);S06-GM61222-05 (NMSU-MBRS-RISE程序),国家研究资源中心(5 p20rr016480-12),和国家综合医学科学研究所(8 p20gm103451) (NM-INBRE程序)。ARA内部研发资金也用于支持这项工作。

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