鼠疫enterocolitica和鼠疫的伪检测食品中

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鼠疫enterocolitica和y伪可导致人类和动物yersiniosis被认为是重要的食源性致病菌,是重要的食品安全卫生指标。致病性y enterocoliticaO血清型和生物型:3/4和3变种VP - O: 5, 27/2, O: 8/1b,和O: 9/2,全球已报告。y伪广泛分布低于y enterocolitica。隔离方法通常涉及选择性和恢复浓缩的食物样本随后镀上选择媒体,确认典型的殖民地和检测分离的菌株毒力的性质。最近,基于dna的方法,如PCR检测,开发了检测致病性y enterocolitica和y伪食品中更快速,灵敏度比可以通过传统文化的方法。本文综述商用常规和pcr进行病原的检测程序鼠疫在食物。这些方法是有效的隔离和检测方法针对致病性y enterocolitica和y伪在食物。

1。概述

食源性致病鼠疫(y enterocolitica和y伪)是兼性厌氧的革兰氏阴性肠杆菌科和隔离经常从土壤、水、动物、和食物1- - - - - -4]。y enterocolitica导致人类感染的症状包括腹泻、终端回肠炎、肠系膜淋巴结炎,关节炎,和败血症。y伪导致肠系膜淋巴结炎、腹泻、败血症。好寒性的生物,鼠疫能够生长在4°C,冷链食品可以提供一个潜在的食品安全危害3,5,6]。致病性y enterocoliticaO血清型和生物型:3/4和3变种VP - O: 5, 27/2, O: 8/1b,全世界已报告和O: 9/2 (7,8]。在日本,O: 3/3变体VP -是人类yersiniosis(最常见的原因8]。在美国,尽管发病率下降O血清型:8/1b感染,O: 3/4和O: 5、27/2感染增加(7]。在欧洲,O血清型:3和O: 9感染占90%以上y enterocolitica感染。y伪广泛分布低于y enterocolitica,虽然经常与动物,很少是孤立的从土壤,水,和食物9- - - - - -12]。

大爆发y伪感染被报道在日本(13,14]。在远东包括日本、y伪各种血清型(1 b、2 a、2 b 2 c, 3, 4, 4 b、5、5 b,和所有的)从患者孤立exanthematous发烧等全身感染,几乎菌株分离产生superantigenic toxin-designed雅普玛所著编码雅普玛所著基因(14- - - - - -16]。在欧洲,血清型(1 a、1 b和3)已经从胃肠的患者症状和孤立的极低频隔离(16]。

因此重要的分离和识别和区分食源性致病鼠疫从非病原的鼠疫菌株。隔离方法通常与浓缩的食物样本随后镀上选择媒体,典型的殖民地,确认和检测分离的菌株毒力的性质(17]。该方法是一种有效的方法可以采用鼠疫enterocolitica和y伪在食物。程序已经使用尤其是检测致病性y enterocolitica和y伪在日本。

2。程序目前量化和确认鼠疫sp.食品

的存在y enterocolitica和y伪食品可以被直接定量确定文化选择性琼脂板上。然而,确认测试要求低温浓缩、选择性富集和亚文化选择性琼脂板上。传统的协议的探测和识别y enterocolitica和y伪从食品如图1。可疑食物样本然而必须进行预处理,使成功的分析。

2.1。预处理的食物

与均质化食品样品预处理开始(25克)三角胸衣的2分钟225毫升的磷酸盐(PBS)或其他冷富集培养基(见下文)。由此产生的匀浆用于直接文化、富集培养实验。快速分离和浓度,25克食品样品和225毫升0.02%的渐变20-buffered蛋白胨水(BPW)塑料袋(Stomafilter P型;Gunze、东京、日本),包含一个聚四氟乙烯布(40目)内部和均质在三角胸衣2分钟18]。

2.2。枚举的鼠疫sp.通过直接培养法

对于这个过程,一个整除的匀浆接种到选择性琼脂板(见下文)治疗后的碱(9,19]。碱性治疗可以通过混合0.5毫升的匀浆和0.5毫升的0.72% KOH在0.54%氯化钠30秒。鼠疫是能够抵抗弱碱性治疗,此属性用于选择生物而抑制背景植物如假单胞菌、变形杆菌和沙雷氏菌属(20.]。据报道,y enterocoliticaO血清型:3:5日,27日,O: 8 O: 9y伪5血清型菌株在人工污染的猪肉样本显示相对高阻KOH,鼠疫菌株从污染的猪肉样本超过10²每g细胞直接KOH治疗后,没有浓缩(9]。然而,食物样本污染较低(小于10²细胞/ g)需要一个浓缩过程成功的复苏鼠疫。

2.3。寒冷和选择性浓缩康复的鼠疫sp.从食物样本污染较低水平

冷浓缩的接种培养基(例子所示)是在4°C的环境中发生三个星期。后1、2、3周,0.5毫升的媒介是接受KOH和接种到选择性琼脂板上。这个过程的浓缩是很有用的y enterocolitica和y伪。好寒性的,鼠疫可以生长在4°C。然而如果中选择性较低,环保鼠疫物种和其他细菌也可以用在浓缩(17]。碱处理的介质有助于减少这种非鼠疫背景植物。冷浓缩媒体用于检测鼠疫食物和水样本(1)磷酸盐(PBS;880毫升0.061 Na₂HPO₄120毫升0.061 KH₂阿宝₄,0.85%的氯化钠)[21),(2)PBS和1%甘露醇和0.15%胆汁盐(PMB) (22),(3)PBS蛋白胨0.5%和1%的山梨糖醇,0.15%胆汁盐(公安局)23),(4)PBS蛋白胨0.25%和0.25%甘露醇(PMP) [5),(5)缓冲蛋白胨水(BPW,默克公司,德国)。

替代冷浓缩是选择性富集。选择性富集包含抗菌药物使用媒体。几个选择性浓缩媒体隔离y enterocolitica在更高的温度下开发(17]。一般来说,冷浓缩收益率较高回收率的致病性y enterocolitica比选择性富集。此外,一个有效的选择性浓缩系统y伪还没有被开发出来,所以目前的选择性富集过程尤其低。

然而,在爆发的情况下,选择性富集程序隔离的致病性y enterocolitica可用于快速检测和确认的病原体。在这种情况下,9毫升Irgasan-ticarcillin-potassium氯酸(ITC,默克,达姆施塔特,德国)接种1毫升的介质从寒冷的浓缩和耗氧孵化25 - 30°C 48小时(22]。

2.4。快速分离和浓度鼠疫从食品样品细胞计数和PCR (18]

传统的协议快速分离和食品中食源性致病菌浓度样品使用过滤,离心,浮力密度离心(BDC)之前由活细胞计数量化和实时PCR如图2。25克食品样品与225毫升0.02%的渐变20-BPW混合在一个小塑料袋(Stomafilter P型)和均质在三角胸衣2分钟。大约220毫升的部分匀浆的过滤解决方案放在消毒350毫升玻璃管和离心1880 g×5分钟在室温下,用一个摇摆转子。上部是转移到消毒500毫升塑料管,然后在16000×g离心5分钟在室温下。然后颗粒悬浮在1.5毫升的0.15 M氯化钠和离心机在14500×g桌上型离心机在室温下为5分钟。合成颗粒收集并用于第二步。

第二步是浮选和沉降BDC食源性致病菌的净化。浮选试验,0.5毫升的部分样品悬浮液混合1毫升的1.050 g / mL Percoll解决方案(法玛西亚生物技术,瑞典)和离心机在4500×g在室温下15分钟。上部,包括食品矩阵,小心地删除。沉降试验,底部部分(约0.5毫升),包括生物、食物残渣,浮力密度最高的质量,均质,然后放在上面两层(0.6毫升的1.050 g / mL Percoll解决方案和0.6毫升的1.123 g / mL Percoll解决方案)在1.5毫升超小型电子管两个密度标记(1.033 g / mL橙色和绿色为1.098 g / mL)。准备在14500×g离心5分钟在室温下,然后用无菌1 mL吸量管,1毫升取自两个制造商和密度之间的界面分为两个样品。样本添加到1毫升的0.15 M氯化钠1.5毫升超小型电子管。

然后准备在14500×g离心5分钟。底部部分(0.5毫升)与1毫升的0.15 M氯化钠resuspended然后在14500×g离心5分钟。每个颗粒用于活细胞计数和DNA提取InstaGene矩阵(Bio-Rad)。一分的样本是解决50μL的0.15 M氯化钠,然后活细胞计数(CFU / g),由培养获得每个稀释(10μL)使用选择性琼脂板,确定这些BDC-lysate颗粒(50μL),另一部分是处理50μL InstaGene矩阵进行DNA提取实时qPCR之前使用游泳时底漆的致病性y enterocolitica和y伪。25克食品样品的总量减少到0.1毫升,和目标生物样本的理论集中在2小时250倍。

2.5。隔离鼠疫使用选择性琼脂媒体

隔离鼠疫和致病性鼠疫(致病性y enterocolitica和y伪)可以通过使用Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin琼脂(CIN琼脂,Difco Oxoid) [20.),包含0.1%七叶灵和0.05%柠檬酸铁CIN琼脂(修改后的毒性鼠疫enterocolitica琼脂(mVYE琼脂))(24]。

CIN琼脂有助于加快复苏y enterocolitica和mVYE琼脂毒性与无毒隔离(数字3和4)。特色深红色中心(“靶心”)和一个透明的保证金和直径2 - 4毫米的出现鼠疫殖民地在30°C CIN孵化24小时是重要的识别,由于甘露醇的存在。鼠疫中的甘露醇发酵培养基,产生一个酸性pH值使殖民地红颜色和外观“靶心”。

mVYE琼脂是致病的最大的优势y enterocolitica,形成红色的殖民地,很容易从最不致病的分化鼠疫生物和其他革兰氏阴性细菌,形成深红色的殖民地与黑暗的边缘区由于甘露醇发酵、七叶灵水解。y伪,形成暗销殖民地由于七叶灵水解,很容易从最不致病的分化鼠疫生物。

“靶心”殖民地在CIN琼脂和红色的殖民地mVYE琼脂是怀疑的毒性y enterocolitica(有时y kristensenii)。红销殖民地在CIN琼脂和深红色的销殖民地mVYE琼脂是怀疑y伪。

2.6。第一个殖民地从选择性琼脂媒体确认试验

殖民地表现出典型的形态在CIN和mVYE琼脂(至少四个殖民地从每个琼脂板)的选择。压力是根据表中所示的标准确认1。第一个确认测试是由接种尿素肉汤,TSI介质,LIM介质,Bile-esculin琼脂和孵化24小时30°C。

根据目标生物,殖民地被选中作进一步的检验。在的情况下y enterocolitica,殖民地,尿素是正面的;赖氨酸- LIM介质;没有气体形成的TSI介质;葡萄糖积极、蔗糖积极;乳糖-(黄色斜和黄色TSI中的琼脂列中)应该被选中。如果目标是y伪,y enterocolitica生物型3副总裁^{- - - - - -}和蔗糖- / O血清型:3,葡萄糖积极的殖民地,蔗糖负数,乳糖-(黄色和红色偏TSI中的琼脂列中)应该被选中作进一步的检验。应该注意的是,致病性y enterocolitica菌株(O血清型:3:5日,27日,O: 8 O: 9)七叶灵是负面的y伪压力和不致病的y enterocolitica1株(生物型/其他许多种血清型)七叶灵是积极的。

2.7。第二个确认测试从第一个确认测试

株疑似为致病性y enterocolitica和y伪第一个确认测试的第二选择确认测试(pyrazinamidase测试(25)和自身凝集试验(26])。对于pyrazinamidase测试,测试菌株接种到pyrazinamidase琼脂偏(见下文),在30°C 48小时孵化。对于自身凝集试验,压力是孵化Trypticase酱油汤(TSB;桶)(或MR-VP介质;Difco) 25°C和37°C 24小时。Pyrazinamidase测试琼脂。Trypticase大豆琼脂(Difco) (30.0 g)。酵母提取物(Difco) (3.0 g)。Pyrazinecarboxamide(默克公司)(1.0 g)。pH6 Tris-maleate(0.2)(1000毫升)。5毫升的部分培养基是热压处理过的和冷却,使偏。

pyrazinamidase测试是迄今为止染色体显性标准区分潜在的致病性和非病原的压力。致病性y enterocolitica和y伪显示消极反应,不致病的鼠疫菌株显示积极的反应,把褐色的粉红色的亚铁盐(图5)。自身凝集试验阳性的质粒鼠疫(毒性)- pYV——积极的菌株y enterocolitica和y伪孵化的37°C而不是25°C(图6)。亚文化的pYV失去压力,特别是在37°C,并存储,显示消极反应。

2.8。进一步的生化和血清学确认

纯粹的疑似菌株致病性y enterocolitica和y伪准备在血琼脂或其他营养琼脂。菌株进行氧化酶活动(负面),进行革兰氏染色法(负)。然后执行菌株生物型的y enterocolitica或基因的分组y伪根据表中所示的标准1。血清型是由幻灯片使用商业抗血清凝集O: 3 O: 5 O: 8 O: 9y enterocolitica(Denka Seiken、东京、日本)和抗血清O: 1, O: 2 O: 3 O: 4、O: 5和O: 6 (Denka Seiken)y伪。的血清型和subserotypey伪可能通过O-genotyping使用o抗原基因提供集群范围内进行pcr (27]。

以下参数可以用来区分y enterocolitica和其他鼠疫物种:蔗糖(积极的),鼠李糖(负面)、蜜二糖(负面),鸟氨酸脱羧酶(正面)和Voges-Proskauer (VP)阳性。然而,副总裁和/或sucrose-negative株y enterocolitica(18,28,29日)和melibiose-negative菌株y伪(16可能发生)。

y enterocoliticaO血清型:3 /生物型4分布世界各地,在西方国家是人类主要致病菌株。然而,O血清型:3副总裁/生物型3变体^{- - - - - -}是人类主要致病菌株在中国,台湾,日本,和O血清型:3 /生物型3副总裁^{- - - - - -}蔗糖- (S^{- - - - - -}在日本)也报道。O血清型:5,27日报道,在美国,中国,和日本,和O血清型:9,来自北欧国家、中国和日本,属于生物型2。来自美国和日本的O血清型:8属于生物型1 b。生物型1包括许多种血清型,没有与人类相关疾病,是常见的食品和环境。

y伪菌株属于基因1组1到6和血清型,1 b, c 1, 2 a、2 b, c 2, 3, 4, 4 b、5 a, b 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12、13、14和15所示。遗传组3(远东systemic-pathogenicity类型)/血清型1 b, c 1, 2 a、2 b, c 2, 3, 4, 4 b、5 a, b 5, 6, 7, 8日,10日和15的人类病原体在日本、中国和韩国。遗传组2(欧洲gastroenteric-pathogenicity类型)/血清型1 a和1 b和遗传组5 / O血清型:3是西方国家的人类病原体。尽管大多数的y伪蜜二糖积极、遗传组4 / O血清型:1,O: 5, O: 6 O: 7, O: 9 O: 10 O: 11日和O: 12(不致病的病毒株),分布在日本的环境,和遗传组5 / O血清型:3是蜜二糖- (16]。

2.9。通过PCR快速检测的分子检测y enterocolitica

用PCR、致病性y enterocolitica可以检测到样品快速、高特异性和敏感性17]。几个PCR化验检测pYV-positive已经开发出来y enterocolitica和y伪在临床、食品和环境样品。这些样品用引物瞄准游泳时或virF基因位于pYV。因为可能的质粒损失亚文化和存储(30.),PCR方法针对染色体毒性基因也已创建环境样品。的苦恼基因位于染色体的致病性y enterocolitica菌株,发票基因位于染色体的y伪菌株,是最常用的目标。多重PCR方法使用引物的混合物发票(5′-TAAGGGTACTATCGCGGCGGA-3′, 5′-CGTGAAATTAACCGTCACACT-3′),苦恼(5′-ACTCGATGATAACTGGGG AG-3′, 5′-CCCCCAGTAATCCATAAAGG-3′),和virF(5′-TCATGGCAG AACAGCAGTCAG-3′, 5′-ACTCAT CTTACCATTAAGAAG-3′) (31日设计了检测y enterocolitica和y伪在食物和水32]。

实时PCR是一种强大的进步的基本PCR技术。目前,最流行的实时PCR检测是基于“Taqman”和“SYBR绿色”方法。Taqman系统5′核酸酶测定,利用特定的杂交dual-labelled Taqman探针PCR产品。SYBR绿色系统是基于绑定SYBR荧光绿色染料的PCR产物(33]。染色体编码苦恼(34),yst(35基因,plasmid-borne游泳时基因(36,37)和一个鼠疫特殊区域的16 s rRNA基因(37,38)已被用于实时PCR。

致病性y enterocolitica和y伪菌株会产生积极的PCR产品游泳时基因(39]。使用SYBRGreen实时PCR分析,Tm值的游泳时引物对(yadA-F1757: 5′-ACGAGTTGACAAAGGTTTAGCC-3′和yadA-R1885: 5′-GAACCAACCGCTAATGCCTGA-3′)致病性之间也是不同的y enterocolitica(82.2°C)y伪(81.5°C)株(图7)。因此,该引物对被证实是有用的检测和分化两个致病鼠疫物种。

3所示。结论

鼠疫enterocolitica和y伪继续对食品安全非常重要。而鼠疫可以在许多类型的食物,没有太多的流行信息。本文涵盖了传统商用和pcr进行病原的检测程序鼠疫在食物。这些方法有效目标病原的检测方法y enterocolitica和y伪在食物。然而,需要快速测试方法的发展促进更加及时和有效的测试。

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