选择性显色板,YECA病原的检测鼠疫enterocolitica:特异性、灵敏度和检测致病能力y enterocolitica从猪扁桃体

文摘

YECA新的选择性显色板,检测其特异性、灵敏度和精度检测致病性y enterocolitica从猪扁桃体。我们测试了一组26个菌株相比YECA和PCA, CIN, YeCM媒体。检测致病性y enterocolitica进行50头猪扁桃体收集在一个屠宰场。浓缩是在公安局做和ITC的培养基配方。裸奔YECA和CIN是直接做的,ITC 24小时孵化后,48 h后孵化的公安局和ITC。所有的盘子都孵化在24小时。典型的殖民地CIN和YECA检查,和隔离是生物型。致病性y enterocolitica菌株表现出一个重要的增长与小和红樱红色YECA殖民地而生物型1表现出很少紫殖民地。浓缩在ITC 48 h提供了最佳的性能在致病性检测阳性样本y enterocolitica,YECA可以直接检测致病性y enterocolitica菌株(2、3和4)。使用YECA结合ITC生成一个节省时间给一个积极的测试在72 h。

1。介绍

y enterocolitica是一种常见的急性肠炎在温带和冷国家在世界范围内,包括法国。人类yersiniosis的主要症状是腹泻、发烧和腹痛。细菌通常留在肠道,但也可能入侵宿主,导致器官和脓肿败血症患者的基础疾病(1]。

yersiniosis是在2009年,连续第六年,第三个最常报道人类人畜共患病的欧洲,共有8354例确诊病例2]。y enterocolitica是最常见的鼠疫物种在人类病例报告在欧洲国家,占所有确诊病例的93.8% yersiniosis [3]。

致病性y enterocolitica菌株属于b生物型1,2,3,4,5,而生物型1菌株是不致病的和广泛的环境中4]。在法国和其他国家在世界范围内,从人类分离出来的生物型4是最普遍的生物型(69%),其次是生物型2(30%)和生物型3例(1%)(1]。

人类感染最常发生在散发病例或小顾家的爆发(1]。y enterocolitica主要通过粪-口途径传播,其主要水库是动物。猪被认为是主要的储层类型y enterocolitica对人类致病性,尽管其他动物物种,如牛、羊、家禽、鱼、鹿、小型啮齿动物,猫和狗,也可以携带致病生物型(4- - - - - -9]。被污染的饮用水也报道生物型1 b的来源鼠疫感染(10]。

的发病率yersiniosis由于猪肉消费在人类最近估计为每年每100000人2.8例在欧洲(11]。这种细菌是第二个最常见的污染物猪产品,沙门氏菌(3.3)和前弯曲杆菌(2.1)。猪不开发临床症状,但他们所做的y enterocolitica口腔,舌头和扁桃体,在淋巴结和排泄这种细菌的粪便(12,13]。Bioserotype 4 / O: 3是最常见的致病Bioserotype孤立从猪(14- - - - - -20.]。

检测Yersiniosis是由使用ISO 10273 - 2003方法(21]。该方法建议食品和猪扁桃体分析(22),但包括耗时浓缩步骤其次是选择性电镀媒体(23]。这种方法就是在两种培养基配方浓缩蛋白胨山梨糖醇胆汁(公安局)汤,和氯酸irgasan-ticarcillin-potassium (ITC)汤,紧随其后的是两个板块的裸奔,cefsulodin-irgasan-novobiocin琼脂plateand (CIN)Salmonella-Shigella钠deoxycholate-calcium氯(SSDC)琼脂板,分别。此外,孵化公安局汤需要5天。最近,作者提出修改的方法,以简化的检测y enterocolitica。范Damme et al。(2010)20.]表明,使用一个为期两天的潜伏期在25°C,而不是5天,公安局肉汤导致更高的回收率鼠疫。Fondrevez et al。(2010)24)表明,裸奔到CIN琼脂板从ITC肉汤,恢复更多的积极的样品比ISO方法。此外,Weagant (2008) (25开发了一种显色培养基,鼠疫enterocolitica显色培养基(YeCM),为特定的致病性检测y enterocolitica。然而,困难遇到分离出致病性y enterocolitica在非殖民地y enterocolitica殖民地当使用YeCM浓缩后一步。为什么一个方法涉及从ITC肉汤CIN琼脂板上裸奔,紧随其后的是典型的裸奔y enterocolitica殖民地到显色培养基,YeCM Fondrevez et al。(2010)提出的24]。这种方法允许分离y enterocolitica菌株进行致病性生物型(红牛's-eye-like YeCM)从非生物型,1(蓝紫色YeCM),但一个附加的步骤然后需要24小时。

其他替代方法使用PCR (8,26)检测鼠疫enterocolitica从食物或扁桃体已经出版。PCR可以用于快速检测疑似阳性样品,只有培养法使恢复隔离。

在这项工作中,我们测试了一个新的选择显色板,YECA,其特异性和敏感性。我们测试了其准确性检测致病性y enterocolitica从猪扁桃体y enterocolitica成为一个关注欧洲猪生产。

2。材料和方法

2.1。YECA:鼠疫Enterocolitica Agar-Selective显色培养基为致病性鼠疫Enterocolitica筛选

YECA由AES Chemunex (Combourg、法国)被描述为显色板允许隔离专门致病性鼠疫enterocolitica;典型的殖民地是小和红樱红色。这颜色是由于颜色指示器的存在揭示了糖发酵。desoxycholate的存在提高了红樱红色颜色的致病性y enterocolitica殖民地。显色底物和色氨酸在媒体上允许致病性分化y enterocolitica从非病原的菌株y enterocolitica菌株(1型)和大多数肠道菌。

2.2。特异性YECA

YECA的特异性测试26株列入表中1。这些菌株被鼠疫enterocolitica,鼠疫例如,非鼠疫。下面的菌株,摩根氏菌属morganii,假单胞菌sp。,沙雷氏菌属liquefaciens,后被从历史中获得殖民地隔绝CIN猪扁桃体拭子浓缩在ITC Fondrevez et al .(2010)的研究(24]。每个菌株培养5毫升的拨款肉汤和孵化温度为24小时。

文化都调整到4麦克法兰,对应的浓度为10⁸到10⁹细胞每毫升。裸奔被执行在CIN琼脂板(1)(鼠疫选择性琼脂基地和鼠疫选择性的补充,Oxoid贝辛斯托克,英国),(2)YeCM介质(在实验室准备如Weagant所述25),(3)YECA (AES chemunex、Combourg、法国)。

我们测量的特异性筛选的预期结果鼠疫enterocolitica紧张了,小而光滑的殖民地,红色的中心和一个半透明的边缘,在CIN,红牛's-eye-like殖民地的致病性y enterocolitica和蓝紫色不致病的殖民地y enterocoliticaYeCM,小(< 1毫米)红樱红色菌落致病y enterocolitica和小(< 1毫米)紫不致病的殖民地y enterocoliticaYECA。此外,如果观察细菌的生长板,我们指出增长的重要性在一个范围从1到5;1当我们观察到一个应用5殖民地在盘子里,5当殖民地覆盖所有的盘子。

2.3。的敏感性YECA

鼠疫enterocolitica1株从生物型(IP124), 2 (IP383), 3 (IP29228)和4 (IP134)(从巴斯德研究所购买、巴黎、法国)孵化在5毫升的脑心浸液(嗨,AES Chemunex、Combourg、法国)汤在24小时30°C。隔夜文化都调整到4 Mc Farland对应的浓度为10⁸到10⁹细胞每毫升。对于每一个生物型,然后在胰蛋白胨盐稀释10倍。100μL 10−−5的稀释扩散在PCA, CIN和YeCM板块,和100年μL 10−−1的稀释扩散在YECA盘子。所有的盘子都孵化24小时30°C和枚举的殖民地被执行。

3所示。检测致病性鼠疫enterocolitica从猪扁桃体

进行测定50猪扁桃体收集屠宰场的5倍(10扁桃体/访问),和文化的方法已经呈现在图1。从每个扁桃体,10 g被切成小块,放入一个袋子,袋子里装有90毫升公安局肉汤(准备在实验室,如ISO 10273:2003所述方法)。膀子后,10μL有直接到YECA和CIN盘子,和1毫升转移在9毫升ITC肉汤。公安局和ITC孵化25°C 48小时,第二个裸奔到YECA, CIN。此外,ITC浓缩的肉汤后24小时,额外的裸奔YECA和CIN。所有的盘子都在30°C孵化24小时。

存在典型的殖民地在CIN(小而光滑的红色中心和半透明的rim)和YECA(小和红樱红色)检查。至少有两个典型的殖民地每板YeCM条纹,这些板块在30°C孵化24小时。这一步在YeCM允许快速区分致病性y enterocolitica(红牛's-eye-like殖民地)不致病的y enterocolitica(蓝紫色殖民地)。确认然后生物型是通过生化检测,如ISO 10273:2003标准所述。

4所示。结果

4.1。特异性YECA(表1)

的菌株鼠疫enterocolitica在CIN和YeCM显示预期的特点,也就是说,所有的生物型的重要增长,CIN,小殖民地,红色的中心和一个半透明的边缘,YeCM,红牛's-eye-like殖民地生物型2,3,4 1非生物型和蓝紫色殖民地。

YECA,三个致病性y enterocolitica显示一个重要的增长和许多小红樱红色殖民地而不致病的生物型YECA 1有一个很小的增长。只有5紫色殖民地YECA上可以观察到这种生物型而裸奔是文化包含至少10⁸细胞每毫升。YECA因此表现出较高的抑制剂影响非生物型的增长1。

在CIN、7的鼠疫——压力增长与半透明的红色菌落边缘公平的数量。只有鼠疫ruckeri被抑制。类似的结果指出YeCM抑制鼠疫ruckeri和良好的增长历史殖民地的其他菌株即使他们成长。

缺乏增长也指出鼠疫ruckeriYECA。另一个鼠疫喜欢菌株能够增长YECA但是殖民地的数量非常小,表明YECA不得不高抑制剂影响他们的成长。这种抑制是有用,因为我们看到的殖民地鼠疫aldovae的殖民地鼠疫mollaretii有相似的特征YECA比鼠疫enterocolitica,小红樱红色。这两个殖民地可能是观察因为裸奔是一个文化丰富的细胞,大约10⁸细胞每毫升。

14 non-Yersinia菌株,我们观察到CIN, YeCM, YECA没有增长或者增长,但不会对这些媒体特点的殖民地。

这些结果表明,有可能在YECA区分三个致病性y enterocolitica面板的菌株进行这项工作。

4.2。YECA(表的灵敏度2)

的敏感性YECA反对的四个生物型鼠疫enterocolitica一获得PCA相比,CIN, YeCM连续使用10倍稀释的四株。

YECA的敏感性与PCA、CIN,和YeCM致病生物型;枚举是可能的,直到稀释−8。

但对于生物型1,殖民地YECA只能列举在稀释−1−2−3在PCA, CIN和YeCM,可以计算这个生物型的殖民地直到稀释−8。

这些结果表明,YECA有相同的灵敏度比选择性和非选择性的媒体。YECA允许的检测y enterocolitica菌株携带致病生物型,特别是。

4.3。从猪致病性检测鼠疫enterocolitica扁桃体

50扁桃体的致病性y enterocolitica分别在CIN和YECA发现了从17日和15日扁桃体后直接裸奔,从21和22扁桃体ITC-24小时后,从28日和28日扁桃体ITC-48小时后,从8和5 PSB-48小时后扁桃体。

这项工作表明,浓缩在ITC 48小时导致样品的回收率明显高于阳性致病y enterocolitica相比直接裸奔,裸奔后ITC-24 PSB-48小时后小时裸奔。其次,从CIN结果之间的一致性,YECA高;相同数量的积极的扁桃体ITC-48小时后恢复。

共收集141株YECA和生物型,ITC浓缩后12公安局浓缩后和129。在141株,135年被确定为生物型4从公安局和123年从ITC(12),两个生物型3和4个生物型2。这个结果表明,YECA能够检测这些3致病生物型自然污染猪扁桃体。

5。讨论

在这一天,ISO 10273 - 2003标准(21是孤立的参考方法鼠疫enterocolitica从食物。这个方法是猪还建议扁桃体分析(22]。然而,它包括耗时浓缩步骤紧随其后的选择性电镀媒体(23]。这种方法就是在两种培养基配方浓缩公安局和ITC,紧随其后的是两个板块的裸奔,CIN和SSDC板块,分别。

冷浓缩在公安局汤主要是用于临床、食品和环境样品。冷浓缩的主要缺点是孵化的长期不适合食品分析。柯南道尔和Hugdahl (1983) [27]表明,孵化在公安局的解决方案在1到3天25°C是一样有效的浓缩在几周4°C。这是最近证实了范Damme et al。(2010)20.)表明,使用一个为期两天的潜伏期在25°C,而不是五天,公安局肉汤,导致更高的回收率鼠疫。

“et al。(1988)28)开发了一个浓缩汤(ITC),来自修改Rappaport,补充在Irgasan羟基噻吩青霉素和氯酸钾。同一作者在公安局表示,浓缩肉汤给更好的结果不致病的病毒株,而浓缩为致病性菌株ITC肉汤给更好的结果。然而,这汤被证明是有效的bioserotype 4 / O: 3株,但抑制bioserotype 2 / O: 5, 27株(29日,30.]。De Zutter et al。(1994)31日)修改ITC公式是为了有一个更好的复苏bioserotype 2 / O: 9株减少氯钾的浓度和孔雀石绿。

作为ISO 10273:2003标准表示,鼠疫enterocolitica殖民地在CIN琼脂通常小而光滑,带有红色中心和一个半透明的边缘,当与斜透射光检查时,他们是noniridescent和细颗粒。SSDC琼脂,鼠疫enterocolitica殖民地通常是小的和灰色的,模糊的边缘,noniridescent非常细颗粒时斜透射光下检查。

SSDC琼脂是修改SS琼脂desoxycholate钠和氯化钙,以增加其选择性[28]。鼠疫容忍高浓度的盐(32]。此外,氯化钙增强的致病菌株的选择y enterocolitica、钙依赖,尤其是bioserotype 4 / O: 3株(28]。这夏甲二字是很大程度上使用,因为它的选择性和其商业可用性。然而,这种媒介并不总是允许区分鼠疫从干扰植物等摩根氏菌属,普罗透斯,沙雷氏菌属,和气单胞菌属。

这是Schiemann (1979) (33)开发中CIN (Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin)的检测y enterocolitica。中CIN高度选择性,特别是反对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌,和变形杆菌。菌落形态加上甘露醇发酵允许歧视的y enterocolitica从大多数革兰氏阴性细菌,可以生长在这个媒介。几个比较研究表明,CIN琼脂是最选择性培养基鼠疫spp。34- - - - - -36]。微生物发酵甘露醇,鼠疫在CIN,产生典型的殖民地后24小时(小而光滑的殖民地,有一个红色的中心和一个半透明的rim)。但枸橼酸杆菌属freundii,肠杆菌agglomerans,的物种气单胞菌属,和克雷伯氏菌生产殖民地相似的形态(37,38]。然而,用户在CIN琼脂更容易认识到检测y enterocolitica相对更多的菌落形态特征在这个媒介(典型的“靶心”外观)相比SSDC [20.,24]。然而,Fondrevez et al。(2010)24)建议使用CIN在ITC浓缩后汤。测试900猪扁桃体棉签,作者表明,这种方式恢复更多的积极的样品比ISO 10272:2003程序:14.0%的扁桃体与新方法检测呈阳性,而只有9.1% ISO方法与修改。

这些媒体,CIN和SSDC,而且缺乏区分潜在的能力强y enterocolitica不致病的病毒和其他鼠疫。只有面板的生化测试(七叶灵水解、吲哚生产和发酵木糖和海藻糖)按照ISO 10273:2003方法允许识别生物型。

最近,Weagant (2008) (25)开发了一种显色培养基(YeCM)特定的致病性检测y enterocolitica。这个琼脂包含纤维二糖可发酵糖,显色底物,和选择性抑制剂抑制集落形成的植物竞争。在这个媒介,致病性y enterocolitica菌株生长为红牛's-eye-like殖民地,而不致病的y enterocolitica随着蓝紫色殖民地。

直接使用这显色琼脂浓缩汤后一步是困难的,因为许多殖民地历史进程干扰的可视化典型的殖民地。这就是为什么Fondrevez et al。(2010)24]提出了使用后CIN一步快速区分不致病的病原生物型的生物型。再多一天添加的检测,该方法耗时少于ISO 10273:2003过程,使用YeCM,降低生化测试确认和生物型的必要性。

欧洲监管有关人畜共患病的食物来源位于指令2003/99 /考虑做一个监控的主要代理负责食物的起源人畜共患病,其中包括鼠疫enterocolitica。在过去的年,许多国家越来越感兴趣y enterocolitica流行病学在养猪17- - - - - -19,39,40]。这种细菌的各种研究也显示一个真正的利益提出其他方法来检测它。其他替代方法使用PCR (8,26)检测鼠疫enterocolitica从食物或扁桃体已经出版。虽然PCR可以用于快速检测疑似阳性样品,只有培养法使恢复隔离是必要的研究从农场到人类的传播细菌。最近,欧洲食品安全署和小组成员的工作鼠疫enterocolitica(2009)(41提出了国家计划监测鼠疫enterocolitica在猪身上。它成为必要简化检测方法也可以直接目标致病性生物型人类yersiniosis负责。

在本文中,我们测试了一个新的选择显色板,YECA,特异性,敏感性,我们测试了其检测致病性的能力y enterocolitica从猪扁桃体。

YECA在这个研究显示一个真正的忙致病性的增长能力y enterocolitica(生物型2、3和4)与典型的殖民地,小,红樱红色。1生物型的增长大大缩减了紫色的殖民地。没有增长或者光观察历史殖民地的经济增长鼠疫例如压力和非鼠疫压力测试在这工作。此外,记数的纯培养y enterocolitica菌株对YECA类似进行主成分分析,CIN和YeCM,除了观察高抑制1型。我们发现YECA展品抑制剂对增长的影响鼠疫——菌株在众多殖民地观察到显色媒体YeCM由Weagant (2008) (25]。这很有趣,因为没有其他干扰物质对媒体的菌群允许快速可视化存在与否的致病性y enterocoliticaYECA。

当测试从自然污染猪扁桃体,我们观察到一个最佳性能检测阳性样品浓缩后在ITC比在公安局,我们获得的相似比例的正样本CIN和YECA之间在ITC浓缩后48小时。这个结果是一致的结果“et al。(1988)28),这表明在公安局浓缩肉汤给更好的结果不致病的病毒株,而浓缩为致病性菌株ITC肉汤给更好的结果。这个结果也是一致的工作Fondrevez et al。(2010)24后),这表明使用CIN ITC恢复更多的积极的样品比CIN在公安局的使用和使用后SSDC ITC。

在这篇文章中,隔离被确认鼠疫和生物型生化检测,如ISO 10273:2003标准所述。这一步是必要的分离致病菌株不致病的病毒株。CIN并不区分1生物型致病生物型而YECA可以直接检测致病性y enterocolitica菌株。这表明使用YECA降低生化测试确认和生物型的必要性。

从自然污染猪扁桃体,它有可能隔离三个致病生物型2、3和4在YECA ITC浓缩;生物型4代表95.7%的隔离。研究Fondrevez et al。(2010)24),最普遍的生物型也是生物型4(80.2%的隔离),其次是生物型3(19.4%的隔离)。但未发现生物型2菌株的研究可能是因为ITC肉汤和CIN盘子都支持生物型的增长4 (31日,42]。我们研究的结果似乎提出YECA可以有一个更好的检测能力比CIN生物型2株,但这被证实在更高数量的样品。

在三天内,可以检测致病性y enterocolitica病毒从猪扁桃体当使用YECA ITC。因此,ITC浓缩和YECA检测生成一个节省时间的给予积极的致病性试验鼠疫enterocolitica在72小时。

总之,我们已经描述了一个简化的方法,有效地检测致病性y enterocolitica在猪扁桃体,耗时少于ISO 10273:2003标准。

在这项研究中,我们使用这种方法对猪扁桃体鼠疫enterocolitica成为欧洲猪生产的关注,但研究进行了测试食物从动物或植物的起源。此外,显色媒体可能是测试人类yersiniosis人类粪便样本检测。

确认

这项工作是支持Valorial财政支持。我们要感谢大肠Carniel博士的巴斯德研究所(法国巴黎)提供人类的菌株和屠宰场的经理同意参与这项研究。

引用

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