水杨酸治疗的枣棕榈根的结构和生化变化攻击Fusarium oxysporumF。sp。Albedinis.

摘要

进行组织化学和超微结构分析，以评估用水杨酸（SA）预处理的枣棕榈根的结构和生化变化，然后接种Fusarium oxysporumF。sp。Albedinis.（FOA）。在通过FOA攻击后，在SA治疗植物的根组织中揭示了黄酮类化合物，诱导蛋白和过氧化物酶活性。这些反应与植物抗性密切相关。在接种SA处理的植物后诱导的宿主反应包括堵塞细胞间隙，在病原体渗透的部位沉积电子致密材料，以及对真菌细胞的几个损伤。另一方面，未处理的接种植物显示出显着的细胞壁降解和全细胞质紊乱，表明在处理植物中由水杨酸提供的保护作用。

1.介绍

镰刀菌菌在经济上是重要的土壤传播疾病，导致自然生态系统的显着作物损失和损害。Bayoud是一种血管枯萎Fusarium oxysporumF。sp。Albedinis.（FOA），它是威胁北非棕榈种植园的最严重的真菌疾病，特别是在摩洛哥。仅在几个枣棕榈中发现对病原体的抵抗力，不幸的是产生质量差的水果[1]．

减少疾病的有希望的策略是基于抗辩生品植物诱导抵抗的诱导。植物防御机制由许多结构和生物化学变化表示，例如植物嗜碱合成[2]，调用沉积[3.]，细胞壁瘫痪[4.[和发病相关（PR）蛋白质诱导[3.]．然而，这些反应并不总是与疾病预防相关的相关性。其中，已知水杨酸（SA）参与调节植物防御[5.那6.]．虽然在所有作物中，SA介导的植物防御的机制尚未完全理解，但其在植物防御中的核心作用是很好的[6.-8.]．SA的积累已被证明对PR蛋白的表达至关重要[9.]具有抗微生物活性并被认为参与植物抵抗力。其中，对植物防卫描述了过氧化物酶对抗病症和生物养殖病原体[10.]．过氧化物酶可以产生物理屏障，以防止病原体渗透到宿主组织中;它催化了h₂O.₂-依赖的细胞壁组分交联导致细胞壁木质化[11.]．

在DALP-FOA Pathosystem中，第一份报告证实SA在植物防御中的参与是Dihazi等。[12.]，他的研究表明，SA的应用激活了酚类化合物的代谢，并诱导了一些羟基肉桂酸衍生物的生物合成，后来称为芥子酸衍生物[13.]．

在与抗性结果的相互作用中，植物细胞壁中也检测到黄酮类化合物[14.[Clover Roots响应于感染，它们的浓度显着增加茄子Ultimum.[15.]．在日期，Ziouti等人已经在根部中描述了黄酮类化合物。[16.]并与枣椰子愈伤组织防范相关[17.]．

鉴于枣棕榈植物根系的复杂性，很难理解上述防御反应的作用，而不会对其原位的微观分析进行显微分析。因此，本文的目的是有助于研究涉及SA诱导的防御反应的机制的细胞学调查。我们调查了在用SA治疗后赋予迄今为止棕榈栽培的抗枣棕榈栽培的结构和生化变化。这些包括诱导的酚醛（即黄酮类）以及过氧化物酶的诱导活性。此外，进行超微结构分析，目的是为了阐明SA在涉及枣棕榈倾向FOA抗性的事件中的作用。

2。材料和方法

2．1．植物接种Foa和SA处理

我们使用6个月大的枣椰树幼苗，这些幼苗来自于对Foa枯萎病高度敏感的品种Jihel。它们在温室中生长(16小时光周期)，然后注射10μ.Foa分生孢子悬浮液L (孢子·ml.^-1）进入根源。使用已知其侵略性的菌株扎格制备接种物[18.]．用SA处理幼苗（100 μ.M)通过将其根浸泡在SA溶液中三天，然后与接种物浸润。考虑接种(TI)和未接种(TU)两组处理植株。对照处理为未接种(UI)和未接种(UU)植株。接种后15天，当疾病症状明显时，从坏死病灶区域收集植物材料。

2.2。蛋白质染色

根在一夜之间固定°C在2％戊二醛，2％多聚甲醛，1％咖啡因和0.2M磷酸盐缓冲液（pH7.2）的溶液中。将组织脱水在梯级乙醇系列中并嵌入树脂（Technovit7100）中。部分（3. μ.m）在元素酸 - 席夫（PAS）试剂和萘酚蓝黑（NBB）中是双染色的。可溶性和储备蛋白在深蓝色中染色，NBB [19.PAS污渍淀粉储量和细胞壁粉红色[20.]．通过常规光学显微镜检查图像。

2.3。过氧化物酶活性

2.3.1。过氧化物酶活性的组织化

过氧化物酶活性的组织学染色使用Gahan描述的方案进行[21.]．枣椰树根组织切片在4%多聚甲醛中，0.2 M磷酸钾缓冲液pH 7.2中固定1小时。切片在0.05 M, pH 7.6的Tris-HCl缓冲液中孵育 M diaminobenzidine (DAB), 2% H₂O.₂（1％）和10^-1 M 3-amino-1,2,4-triazole. Images were examined using conventional light microscopy.

2.3.2。sds - page的氧化物酶

过氧化物酶的SDS-PAGE检测采用Baaziz[30-0.8]所述的丙烯酰胺-双丙烯酰胺凝胶[22.]．酶提取采用含4%聚乙烯吡咯烷酮的磷酸钾缓冲液(pH为7.2)。在每次处理中，从坏死区域收集3株幼苗的根组织(鲜重200 mg)，然后在1ml缓冲溶液中均质。匀浆10 000 g离心30 min，取上清作为酶提取物。所有步骤都在4°C下运行。二十μ.将L酶提取物进行电泳。在60mA的恒定电流下进行电泳分离，2-3小时。电泳缓冲液是Tgs（Tris-甘氨酸-SDS）pH8.1。使用二氨基苯甲酸和H在凝胶中可视化过氧化物酶活性₂O.₂在0.2M乙酸盐缓冲液中，通过除去基材并用水冲洗凝胶来终止反应。重复SDS-PAGE实验两次以确认该方法的再现性。

2.4。酚类化合物的组织化

枣椰树的一小段根被3%琼脂糖包埋。横向部分(30μ.使用冻结阶段的切片切割M厚度。用不同的试剂染色后，将部分安装在试剂溶液中。使用配备有420nm励磁的蓝色过滤器和515-560nm屏障滤波器进行了一部分的光学显微镜。Neu的试剂[23.[酚类化合物的标准试剂被使用。将横截面在绝对甲醇中浸入1％2-氨基 - 乙基乙基硼烷（Fluka）中浸入2-5分钟，然后安装在甘油 - 水（15/85，V / V）溶液中并使用荧光显微镜检查。在Neu的试剂存在下，咖啡酸衍生物和黄酮类化合物的荧光分别在蓝光下变成绿色黄色和亮橙色。

2.5。电子显微镜

在透射电镜(TEM)中，样品以3%戊二醛(v/v)快速固定于0.1 M cacody酸缓冲液pH 7.2中，室温下12 h保存。用固定碳酸氢钠缓冲液冲洗三次后，在室温黑暗条件下，用碳酸氢钠缓冲液制备的1% OsO4固定2 h。然后将样品在一系列100%的乙醇溶液中脱水，渗透并嵌入到Spurr公司的低粘度环氧树脂中[24.]．使用Reichert-ultracut S切片机对样品进行处理。切片在黑暗中分别与醋酸铀酰和柠檬酸铅进行30分钟对比。分析采用透射电子显微镜(Jeol 100 EX(东京，日本))进行。

2.6。统计分析

UU、UI、TU、TI 4组，每组13个切片，实验重复2次。计算蛋白质、类黄酮和过氧化物酶活性的切片百分比;TI处理与UU处理间差异显著α.= 0.05使用Chi-Square测试进行适合的良好（SPSS统计17,0）。

结果

3.1。SA治疗和症状学

将SA处理和非生成的植物接种Fusarium oxysporumF。sp。Albedinis.确定它们对真菌攻击的敏感性。典型的疾病症状，主要是在对照植物中接种（D.A.I.）后，在感染性触点的部位上形成褐变的褐变的褐变疼痛的形成。相比之下，100 μ.M SA导致疾病发展得多，而不是在非生命的日期棕榈植物。处理的接种植物通常开发有限的坏死病变，其反映了病原体宿主植物的延迟（图1）.

3.2。感染的日期棕榈根组织的组织学观察（图2（b））

对接种了Foa的未处理植物的根标本的横切面观察表明，除厚壁组织外，所有组织都被病原体大量入侵，而厚壁组织很少定植。通过病原体菌丝穿过皮层、内皮层和维管中柱可见，根组织定植强烈。

3.3。SA诱导的防御反应的组织化学特征

3.3.1。诱导蛋白质的染色

组织化学分析证实了接种或未接种Foa的sa处理植物中诱导蛋白的表达(图2（c）和2（d））.在围绕木质血管的细胞层中强烈地表达蛋白质（染色蓝蓝色染色），并在内胚层附近的一些实质细胞中表达。对照植物有蛋白质生产受损（图2（a）和2（b））.

3.3.2。过氧化物酶活性

在DAB染色后发现的棕色沉积物的过氧化物酶活性在SA处理的植物中注意到（85％）和未致密的（60％），并且在未处理的接种（70％）中。将这种活性定位在细胞壁中，并在皮质实质细胞和验卸组织的间细胞间空间中定位（图3（b）那3（c）， 和3（d））.在来自对照植物的根部中，这种活性相当较低（23％）（图3（a））.此外，SDS-PAGE分析（图4.)证实此结果;两种过氧化物酶同工酶的MM值分别为150和142 kD。这些同工酶在未接种的植物中存在，在sa处理和sa处理和接种的植物中明显减少。有趣的是，另外两种MM值为32和28 kD的同工酶仅在SA处理和接种的植株中表达，这表明SA对过氧化物酶的激活在感染植株中更为明显。

3.3.3。酚类化合物的组织化学染色

Neu试剂是许多酚类化合物的标准组织化学试剂。它将黄酮类化合物和咖啡酸衍生物分别染成亮橙色和绿色。它与这些酚醛化合物形成复合物，然后发出特定的荧光。在用Neu试剂处理的椰枣根对照中，在蓝光下观察到厚壁组织、内皮层和维管薄壁细胞的黄绿色荧光。这些咖啡酸衍生物可能参与了木质化过程。当植物接种Foa时，观察到这种特异性荧光减弱，位于木质部导管附近的细胞出现褐色(图)5（b））.当用SA处理植物并受到FOA挑战时，在木质血管附近的血管 - 妥善血管壁中诱导（75％）（明亮的橙色荧光）（图5（d）)，可能位于潜在病原体侵入的位置。它们的存在可能与它们参与植物防御有关。

3.3.4。感染的日期棕榈根的超微结构特征和SA诱导的防御反应

仔细检查受感染的根超微结构的超微结构表明，血管骨骼的病原体进入与经常降低到囊泡残留的细胞质的广泛血管骨质和显着的细胞改变（图6 (d)）.殖民化的特征在于细胞壁的显着劣化，导致其完全溶解（图6（c））与未征收的根部中的保存的细胞壁相比（图6（a））.在所有情况下，观察到的真菌定植和宿主细胞紊乱的模式恰好沿着根部的宏观可见症状发生，导致严重的植物萎缩，最终植物死亡。真菌生长主要是细胞内的，但它也可以通过直接宿主壁渗透而异细胞发生。通过缺乏二级壁材料的坑场的凹坑越过跨越宿主细胞壁的种生殖器尝试发生6（b）和6（h））.

在SA处理的植物中，通过FOA的定植显着不同于对照植物中观察到的。降低真菌生长，在主根系的组织中很少见到菌丝。与对照组相比，在SA治疗植物中观察到最醒目的变化之一是阐述包括与细胞壁密切相关的电子密集材料沉积的几个宿主防御反应（图6 (f)）.这种材料在血管腔内形成涂层（图6（g））在切割它们的间细胞间隙的地方（图6 (e)）最终改变入侵菌丝（图6（h））.在病原体入侵的地点也观察到墙壁环容（图6 (f)）.这些结构与真菌细胞壁的变形、质膜的破裂和细胞质的明显致密有关(图)6（h））.它们可能意味着加强宿主壁并防止病原体蔓延。

4。讨论

我们之前描述了SA通过引发新的酚类化合物的合成来增强FOA感染的日期棕榈植物的生存[12.]鉴定为羟基氨基酸衍生物[13.那25.]．对我们的知识治疗，这是第一个报告，显示SA对掌上棕榈 - FOA相互作用中根组织的细胞化学变化的影响。这些结果表明，SA诱导蛋白质在接种和未征收的植物中合成，尤其是在木质血管周围的细胞层中，并且还在位于内胚层附近的血管薄壁细胞中，并且在一些皮质实质细胞壁中。响应SA处理诱导的蛋白质在无症状的日期棕榈植物中强烈表达，并且可以在抵抗力中发挥作用。在非生成的接种植物中，存在这些蛋白质，但不足以阻止病原体的扩散，并注意到有几个组织改变的迹象。

与早期研究一致[12.[目前的结果证实，在真菌挑战后，SA治疗植物中的防御反应更加明显。此外，我们已经表明，SA治疗的植物和感染的植物均表达了高过氧化物酶活性，其接种植物中的两种同工酶（150和142kD），其在SA治疗的植物中消失，两种新的同工酶（32和28 KD）。仅在SA治疗和接种植物中表达。仅在接种和SA治疗的植物中仅表达这些新同工酶可以构成枣棕榈植物的一种“初步”朝向其病原体。

这使得与过氧化物酶活性相关的与FOA相关的其他发现进行了相关的结果[26.-28.]．事实上，Jaiti等人。[28.已经表明，茉莉酸在FOA感染后枣棕榈植物中的过氧化物酶活性增加。过氧化物酶经常响应SA或茉莉酸[29.]并且众所周知，它们在宿主植物防御中发挥着核心作用[10.]．过氧化物酶可以参与底物分子的过氧化，导致高毒性化合物的积累，这可能通过其抗真菌电位有助于耐受性[30.]．有趣的是，在酚储存细胞中检测到高过氧化物酶活性，特别是sa处理的椰枣根。

此外，已知水杨酸可以抑制一些茉莉酸途径相关的防御机制[31.那32.]．这可以解释接种植物中同工酶的存在，然后在SA治疗后不存在。为什么诱导一些过氧化物酶的同种型，而其他物质被压抑仍然确定。

此外，组织化学分析表明，黄酮类化合物仅在sa处理和foa接种的植株中积累，并充满维管薄壁细胞壁。这证实了SA在致敏椰枣植物中对其病原体反应更快的含义。黄酮类化合物在植物防御反应中的参与已被充分证明[33]．这些酚类物质不同于在椰枣根对照中发现的咖啡酸衍生物。黄酮类化合物被认为是植物细胞壁在抗性相互作用中检测到的重要酚类化合物[14.]．它们的积累仅发生在接种病原体的抗性棉花品种中Xanthomonas Axonopodis.pv。malvacearum.[14.]．最近，Carlsen等人。[15.]表明，对于感染的含量，黄酮类异酮素和DaIdzein的浓度显着增加茄子Ultimum.。迪克森[34]确认黄酮类化合物在植物真菌病原体防御反应期间的抗微生物作用。Mcnally等[35]， 使用podosphaera xanthii.c -糖基黄酮类化合物在抗性植物中的生产也已定位。最近，El Hadrami等人[36]表明芦丁参与在马铃薯和地区之间的相互作用中verticillium dahliae.。

在日期的棕榈 - FOA病理系统中，在枣椰子根中以痕量的量检测到黄酮类化合物[16.]并有人建议在枣棕榈愈伤组织防范中发挥作用[17.]但是先前公布的研究均未报告SA涉及触发与枣棕榈植物防御有关的黄酮类化合物的积累。我们的数据表明，在与木质血管紧密相关的血管妥善细胞的细胞壁中表达了黄酮类化合物，其中尤其是在坏死区周围的组织中，这与植物抗性有关。Dai等。[37]有报道说，坏死的形成可能是由于过氧化物酶在木质素化过程中对类黄酮的作用。

为了探讨观察到的生化变化是否与结构修饰相关，在超微结构水平处检查枣棕榈根组织。在非生成的日期棕榈植物中，所有根组织被FOA强烈地殖民。病原体进入血管中的血管骨架的特征在于严重的宿主细胞改变，包括细胞壁劣化和细胞质的改变，其经常降低到囊泡残余物。这可能表明真菌产生细胞壁水解酶，即水解宿主组分并导致真菌扩散到根组织中。此类酶以枣棕榈 - FOA相互作用暗示，与疾病发展有关[38]．

在SA处理的枣棕榈植物中对FOA的保护与电子密集材料的沉积，宿主细胞中的壁相，以及受损的真菌细胞增加。这种电子致密材料与细胞间隙密切相关，已知是用于病原体的战略性位点。这种宿主反应显然是为了停止病原体进入，从未见过控制植物。真菌细胞在这些电子致密材料附近经常混乱，表明该材料产生的菌丝毒性环境[39]．该材料的性质尚未确定。其对四氧化锇的反应性表明这些化合物可能是酚类性质[40]．宿主细胞壁中酚类化合物的积累可能有助于提高这些防御屏障的机械强度。根据我们的细胞化学观察，在SA处理的根组织中形成的电子致密材料可包括黄酮类化合物。有趣的是，在由线虫袭击的香蕉根radopholus similis.，电子致密材料与先前通过组织化学分析检测的黄酮类化合物浸渍有关的细胞壁[41]．在感染的棉花叶中发现了相同的结果Xanthomonas Campestris.pv。malvacearum [14.]．在SA治疗后形成的壁环素的性质也尚未确定，但由于在这些墙壁附近的真菌细胞被改变，因此对病原体攻击的参与进行了证明。几份报告表明，墙壁环容含有核糖和纤维素，如细胞化学分析所揭示的[42]．这种细胞变化导致了一些障碍，防止病原体在根组织中扩散。

结论

在这项研究期间，获得了确凿的结果。他们提供了证据表明SA治疗促使枣棕榈根的结构和生化变化响应于真菌感染。皮质和血管薄壁细胞是涉及SA诱导的反应的主要细胞，导致黄酮类化合物和其他酚类化合物的积累，以及诱导过氧化物酶的新异构体。这证实了SA在对其病原体触发日期棕榈防御时可能的含义，并赋予了有效控制Bayoud病的有希望的策略。

致谢

这项工作的财政支持由PRAD 11-05-Egide no.提供。24172UL, PRAD 06-02, Protars II号P15/14, AI (France-Maroc) 01/23;ARP-AUF没有。D2092RR707和AI(突尼斯-马洛克)24/02。感谢DMK (Deutsch-Marokkanisches Kompetenznetzwerk)。

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