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骨质疏松杂志
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骨质疏松杂志/2015年/文章

临床研究|开放获取

体积 2015年 |文章的ID 802694年 | https://doi.org/10.1155/2015/802694

Elena诉Tchetina卡琳娜a . Maslova米哈伊尔•y维多瓦莱里·a . Myakotkin, ”协会的骨质流失的Upregulation Survival-Related基因的差别和伴随的对这些哺乳动物雷帕霉素靶和成骨细胞Differentiation-Related基因外周血的晚绝经后女性骨质疏松性”,骨质疏松杂志, 卷。2015年, 文章的ID802694年, 8 页面, 2015年。 https://doi.org/10.1155/2015/802694

协会的骨质流失的Upregulation Survival-Related基因的差别和伴随的对这些哺乳动物雷帕霉素靶和成骨细胞Differentiation-Related基因外周血的晚绝经后女性骨质疏松性

埃琳娜诉Tchetina,1,2 卡琳娜a Maslova,1,3 米哈伊尔·y维多,1 和 瓦莱里·a·Myakotkin1

1遗传学部门Nasonova风湿病研究所,115522年莫斯科,俄罗斯

2临床免疫学,Nasonova风湿病研究所,Kashirskoye Shosse 34, 115522年莫斯科,俄罗斯

3詹森强生制药公司,多伦多,加拿大

学术编辑器:Hans van Leeuwen
收到了 2014年2月02
接受 2014年12月11日
发表 2015年2月10

文摘

我们旨在确定骨相关标记的骨质疏松(OP)患者外周血指向分子机制晚绝经后骨质疏松。全血从22日晚绝经后OP患者和26名健康受试者被检查。骨矿物质密度(BMD)被测定仪测量。p21蛋白水平的p70-S6K, MMP-9 TGFβ1,caspase-3被ELISA量化。使用实时rt - pcr基因表达测定。OP注册由低BMD指数在绝经后晚期病人与重大upregulation自噬相关蛋白ULK1、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21,金属蛋白酶MMP-9血液中基因表达与健康对照组相比的差别明显对这些mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶),RUNX2,ALPL基因表达,而表达的组织蛋白酶K, caspase-3转化生长因子(TGF)β1,白介素-(伊尔-)1β,肿瘤坏死因子α(TNFα)没有明显影响。我们还观察到一个积极的关系TGFβ1和RUNX2表达和BMD在这些患者的股网站。因此,晚绝经后骨质疏松OP患者相关的一个重要upregulation survival-related基因(ULK1和p21),MMP-9的差别,以及对这些mTOR和成骨细胞differentiation-related基因(RUNX2和ALPL)外周血与健康对照组相比。

1。介绍

骨质疏松症(OP)的特点是低骨量、骨质量差,断裂倾向增加。骨质疏松性骨折,常与减少骨矿物质密度(BMD),是一个老龄化的主要公共卫生问题(1]。然而,OP的分子机制相关的骨破坏目前还无法完全理解。最近有人建议,这些机制涉及改变成骨细胞和破骨细胞的分化和功能(2]。

过度OP的骨骼退化被认为源于吸收破骨细胞活动的增加,金属蛋白酶等表达蛋白酶(MMP-9)和组织蛋白酶K .组织蛋白酶K, papain-like半胱氨酸蛋白酶,被认为是一个关键球员在骨吸收的过程3,4]。破骨细胞分化和功能受肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子α),核因子k B受体激活剂配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(csf)。这三种细胞因子可以促进破骨细胞生存信号通过哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)作为一个共同的目标(5]。mTOR被认为是一种进化保守中心协调者的基本生物过程涉及细胞周期进展,平移控制,核糖体生物起源,转录控制和自噬6]。事实上,最近的动物研究表明,mTOR能够调节osteoclastogenesis, mTOR减少破骨细胞的差别而对这些生产活动(7,8]。

Differentiation-related在成骨细胞表型的改变包括特定的基因表达的变化和相应的蛋白质合成过程中增殖,细胞外基质成熟和矿化9,10]。最初,积极增殖细胞表达细胞周期和细胞生长调控基因等Runt-related转录因子(RUNX) 2,成骨细胞转录监管机构,也控制着主要骨基质蛋白基因的表达(11]。成骨细胞成熟与生产定期的骨基质和胶原原纤维密集和高矿化。在这个阶段,机械性能和骨基质的组成是由转化生长因子(TGF)β1 (12]。增殖活动的减少伴随着增强CDK抑制剂p21的表达(CIP1 / WAF1) (p21)和碱性磷酸酶(9,13]。p21 caspase-3衬底,生理的负责观察到许多细胞系凋亡活动,包括成骨细胞(14]。

改变mTOR信号也可能参与成骨细胞表型转换(15,16]。它已经表明,upregulation mTOR信号与BMP2的增加,RUNX2, TGFβ表达preosteoblasts [17]。相比之下,通过差别mTOR对这些雷帕霉素抑制成骨细胞增殖和分化,减少RUNX2,唾液蛋白,osterix基因表达,碱性磷酸酶活性,和矿化能力18]。

mTOR伴随着增加差别此外,对这些基因的自噬在许多细胞类型(19]。自噬是一种细胞生理机制,降解和回收蛋白质保持一个适当的氨基酸水平的生存目的。它涉及胞质双层膜囊泡的形成(自噬小体)与upregulation ULK 1 - 15 (hATG)基因的表达。Hyperautophagic条件能够促进caspase-dependent凋亡细胞死亡(20.]。最近,自噬在OP开发和发展的重要性是描述21,22]。特别是,自噬的规定(ROA)通路与手腕和手臂BMD相关显著(23]。此外,自噬蛋白对破骨细胞的生成至关重要的折边边界,其分泌功能,和骨吸收24]。

合成代谢和分解代谢的因素的相互作用,参与主要代谢途径和骨质疏松性骨质流失,目前不清楚。临床研究可能有助于澄清这个问题。然而,骨标本绝经后OP患者主要是不可用。另一方面,它是良好的基因同时表达,在不同的细胞类型组织在发育相关。免疫和骨细胞起源于中胚层和骨的形成和自适应免疫系统密切相关的系统,这些系统可能涉及相同的监管细胞因子和生长因子(25]。此外,最近建议,外周血单核细胞(PBMCs)含有大量的淋巴细胞,它能够产生促炎细胞因子il - 1、TNFα,这可能是绝经后骨质疏松(参与26,27]。

这里,我们将相关的基因的表达与骨细胞分化和骨吸收(RUNX2, TGFβ1、ALPL TNFα,il - 1βMMP-9,和组织蛋白酶K),负责全球的基因的细胞生存和功能p21 mTOR,,caspase-3,ULK1在绝经后晚期OP患者的外周血和健康的话题。我们观察到的一个重要upregulationp21 ULK1,,MMP-9血液中的基因表达的OP妇女与健康对照组相比。这是与一个以上的差别明显对这些相关联mTOR,RUNX2,和碱性磷酸酶(ALPL)基因表达,而表达的组织蛋白酶K, caspase-3, il - 1β,和肿瘤坏死因子α没有比健康受试者明显不同。我们还观察到一个积极的关系TGFβ1和RUNX2表达和股网站在这些患者的骨密度。我们得出的结论是,晚绝经后骨质疏松症有关的upregulation细胞生存的差别以及对这些细胞生长增殖和成骨细胞分化/注册功能相关的基因表达外周血细胞。

2。患者和方法

2.1。道德

研究协议是经当地伦理委员会批准的人类研究和知情同意是获得所有科目。

2.2。病人

这项研究包括22个连续,不相关,绝经后晚期,俄罗斯女性特发性骨质疏松症的人参观了门诊Nasonova研究所的风湿病。OP患者的平均年龄为66.1±7.2岁,与一系列53 - 76岁。更年期平均持续时间为18.0±4.8年,射程10 - 30年。个人障碍导致骨代谢异常,包括糖尿病、肾脏疾病、风湿性关节炎、甲状腺、甲状旁腺、和其他内分泌系统疾病,被排除在研究之外。女性已经药物,如雌激素、孕激素、糖皮质激素,磷酸盐,和alfacalcidol也排除在外。

26与绝经后健康志愿者(平均年龄63.0±12.2年,一系列49 - 78岁)没有任何严重的疾病,包括骨关节炎,并没有采取药物影响骨和钙代谢也在莫斯科地区招募了。研究协议是经当地伦理委员会批准的人类研究和知情同意是获得所有科目。这项研究是进行完全符合当前版本(2008)的《赫尔辛基宣言》。

2.3。测量BMD

腰椎BMD (L1-L4)、股骨颈、股骨转子,股intertrochanter,病房三角形,总股骨测量了双能x线吸收仪(DXA对)使用qdr - 4500 w仪器(美国Hologic) Nasonova风湿病研究所。骨质疏松症的诊断是基于世界卫生组织推荐的标准(28),其中包括 分数 −2.5 SD。根据这个测试,所有OP科目检查在本研究中被诊断为骨质疏松症(表1)。
健康对照组 分数 OP患者 分数
( = 26) ( = 22)
腰椎
L1-L4		 1.052±0.06 0.064±0.62 0.712±0.06 −3.07±0.60 < 0.001
股骨颈 0.857±0.06 0.064±0.59 0.584±0.08 −2.407±0.71 < 0.001
转子 0.765±0.11 0.633±1.08 0.531±0.07 −1.703±0.74 < 0.001
Intertrochanter 1.163±0.10 0.525±0.70 0.830±0.16 −1.696±1.05 < 0.001
沃德三角形 0.727±0.10 −0.042±0.91 0.378±0.07 −2.839±1.24 < 0.001
总股骨 1.156±0.12 0.533±0.70 0.700±0.11 −1.853±1.11 < 0.001
表1
平均骨密度值(±SD)对绝经后骨质疏松妇女和健康受试者。
2.4。外周血单核细胞(PBMC)隔离

外周血(10毫升)收集在真空采血管管含有乙二胺四乙酸(EDTA)(英国BDH)。血液采集标本以标准化的方式在早晨(早上07:00至上午09:00)。全血分离进行了使用聚蔗糖密度梯度。在离心分离外周血单核细胞(PBMCs)位于相间收集和清洗两次磷酸盐(PBS) [29日]。获得细胞分数被冻结,保持在蛋白质提取之前−70°C。

2.5。p70-S6K量化,p21、MMP-9 TGFβ1,Caspase-3蛋白质水平

的浓度总p70-S6K (KHO0571)、p21WAF1 / Cip1 (KHO5421) MMP-9 (KHС3061),活跃caspase-3 (KHO1091)(表达载体、打击士气、钙、美国),和TGFβ1 (BMS249/4) (eBioscience,维也纳,奥地利)测定在孤立PBMCs使用商用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒根据制造商的指示。mTOR蛋白表达,我们评估的水平p70-S6K,磷酸化mTOR的直接目标,作为读出mTOR活动(30.,31日),mTOR ELISA试剂盒在俄罗斯并不可用。

每一个表达的结果µg蛋白测量的PBMC溶解产物。PBMC的溶解产物得到使用细胞提取缓冲区包含10毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4,100毫米氯化钠,1毫米EDTA, EGTA 1毫米,1毫米氟化钠,20毫米Na4P2O7,20毫米Na3签证官4特里同x - 100年,1%,10%甘油、0.1% SDS, 0.5%脱氧胆酸盐(美国表达载体,打击士气,CA)补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒(美国圣路易斯Sigma-Aldrich, Inc .)和1毫米PMSF(美国圣路易斯Sigma-Aldrich, Inc .)根据制造商的指示。总蛋白浓度的细胞溶解产物量化使用布拉德福德的方法(32]。

2.6。总RNA隔离和逆转录酶反应(RT)

检测基因表达总RNA是孤立的从100年µL(全血后立即退出使用Ribo-zol-A工具包(InterLabService,莫斯科,俄罗斯)按照制造商的建议。总RNA的260/290> 1.9。RT执行反应使用Reverta工具包包含M-MLV逆转录酶,随机hexanucleotide引物,根据制造商的建议总RNA (InterLabService,莫斯科,俄罗斯)。

2.7。实时定量聚合酶链反应

以下半成品引物和探针用于TaqMan化验(美国应用生物系统公司,培育城市,CA):mTOR(Hs00234522_m1),Unc-51-like激酶1(ULK1)(Hs00177504_m1),p21WAF1 / Cip1(p21)(Hs00355782_m1),caspase-3(Hs00263337_m1),肿瘤坏死因子α(Hs00174128_m1),TGFβ1(Hs99999918_m1),RUNX2(Hs00231692_m1),ALPL(Hs00758162_m1),组织蛋白酶K(Hs00166156_m1),MMP-9(Hs00234579_m1),il - 1β(Hs00174097_m1)。β肌动蛋白作为一个内生控制。

基因表达的量化进行了使用7300实时PCR系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)如前所述[33]。简单地说,1μL RT产品受到的实时PCR在15μ7.5 L总反应混合物μL TaqMan普遍PCR反应混合液(应用生物系统公司),900 nM和反义引物,50纳米探针,模板的互补。单步后50°C 2分钟和10分钟的初始活化在95°C,反应混合物受到40放大周期(15 s在95°C的变性和1分钟退火和延伸60°C)。

相对mRNA表达决心使用δCT方法,按照制造商的详细指南(应用生物系统公司)34]。δCT值减去计算CT管家的值β肌动蛋白从C基因T为每个样本值。δCT当时计算价值减去δCT的价值控制δC(每个健康的病人)T每个OP患者的价值。每个PCR进行复制。三个“没有”模板控制不断为每个反应消极。

2.8。统计分析

Kolmogorov-Smirnov正常测试显示,根据高斯分布数据分布曲线。因此,对于统计评估,皮尔森的秩相关性和未配对的学生的 以及用于比较对照组和OP患者。我们将只有一个控制样本与OP样本在每个基因的情况下,不执行任何多个测试,没有修正多个测试。定量数据被表示为平均数±标准差。Statistica 6软件(美国StatSoft,塔尔萨)是用于所有统计分析。P值小于0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。全血基因表达

检测基因表达的OP患者的全血透露mTOR RUNX2,和ALPL基因健康受试者(图相比显著下调1)。相反的表达p21,autophagy-relatedULK1,和MMP-9基因显著调节OP患者相同。没有观察到显著变化的表达式caspase-3,肿瘤坏死因子α,il - 1β,TGFβ1,组织蛋白酶K。


图1
相对表达ALPL RUNX2的TGFβ1、组织蛋白酶K MMP-9, TNFα,il - 1β,ULK1 mTOR caspase-3,和p21基因与参考β肌动蛋白基因相比,22岁绝经后OP患者的外周血26岁健康女性骨盆控制(控制)。每一个点代表了平均数±标准差。显著差异和控制用星号表示。
3.2。p21蛋白水平的p70-S6K, MMP-9 TGFβ1,Caspase-3分离PBMC

进一步研究的临床意义p21 mTOR,,MMP-9, TGFβ1,和caspase-3OP患者的全血基因的表达情况,我们分析了总p70-S6K丝氨酸/苏氨酸激酶的蛋白质含量(mTOR磷酸化的直接目标30.,31日]),p21、MMP-9 TGFβ1,积极caspase-3 PBMC分数。这些研究表明,OP患者表现出显著降低p70-S6K蛋白质浓度PBMCs健康受试者相比(图2)。同时,p21和MMP-9蛋白质含量显著增加,而没有改变观察大量的活跃caspase-3和TGFβ1在PBMCs OP患者,而健康的病人。

(一)”name=
(一)
(b)”name=
(b)
图2
p21蛋白的浓度p70-S6K, (a), MMP-9 TGFβ1,caspase-3 (b)以ELISA PBMCs从OP患者( )与对照组( )。星号表示从健康对照组显著差异。
3.3。协会与弹道导弹防御基因的表达

双变量相关性的分析使用皮尔逊相关系数的表达式检查表明,基因mTOR, TGFβ1、RUNX2 TNFα摘要意思,β组织蛋白酶K, caspase-3和p21积极的( < 0.05)与对方(表2)。然而,之间没有相关性观察ULK和ALPL基因表达和其他基因。
mTOR TGFβ1 RUNX2 肿瘤坏死因子α il - 1β Caspase-3
RUNX2 0.768 0.768
(P< 0.001) (P< 0.001)
肿瘤坏死因子α 0.664 0.504
(P= 0.005) (P= 0.03)
il - 1β 0.424 0.696 0.496 0.494
(P= 0.06) (P< 0.001) (P= 0.01) (P= 0.03)
Caspase-3 0.666 0.481 0.519 0.867 0.637
(P= 0.003) (P= 0.03) (P= 0.01) (P< 0.001) (P= 0.002)
p21 0.580 0.868 0.680 0.715 0.675 0.715
(P= 0.009) (P< 0.001) (P= 0.001) (P= 0.002) (P= 0.001) (P= 0.001)
TGFβ1 0.632
P= 0.004
组织蛋白酶K 0.542 0.516
(P= 0.03) (P= 0.07)
腰椎
股骨颈
转子 0.548
(P= 0.01)
沃德三角形 0.516
(P= 0.02)
总股骨 0.524 0.605
(P= 0.02) (P= 0.005)
表2
相关系数及其意义( )所示为细胞生长和differentiation-related基因的表达与BMD在绝经后女性骨质疏松性。

一些研究基因的表达还与OP患者BMD显著相关(表2)。指出之间的正相关关系TGFβ1和RUNX2基因表达与股骨BMD的总及其隔间(转子和沃德三角形)检查OP患者。

4所示。讨论

最近,骨骼和免疫系统被认为比此前认为的相互作用,这种相互作用(主要包括监管方面35]。此外,T -淋巴细胞被认为是破骨细胞和成骨细胞形成的主要监管机构,寿命,和活动(26]。因此,我们认为,基因和蛋白质表达的变化在骨质疏松性患者的外周血细胞也可能与疾病相关的代谢变化观察到骨细胞有关。在这里,我们使用的PBMCs绝经后晚期OP患者和健康对照组进行调查的差异基因的表达与骨细胞分化和骨吸收的调节。

我们表明,破骨细胞的分化和功能相关基因的表达是不变的(组织蛋白酶K,肿瘤坏死因子α,和il - 1β)或调节(MMP-9)的外周血检查OP女性健康受试者相比。先前的研究还指出,骨质疏松性女性血清il - 1β水平与正常对照组相似(36]。此外,没有区别的频率肿瘤坏死因子α表达观察骨组织的OP与健康妇女(37]。Upregulation的MMP-9基因和蛋白质表达的PBMCs检查OP女性支持他人的原位杂交结果,显示的增加MMP-9信使rna在骨质疏松性骨组织与正常对照组3]。然而,一些研究也报道减少MMP-9表达式在绝经后的骨质OP患者[38]。虽然MMP-9表达调节研究OP的PBMCs妇女,其在破骨细胞的蛋白水解活性不变的表达可能是有限的组织蛋白酶K,作为蛋白酶都需要同样表达了组织蛋白水解作用[39]。同时,破骨细胞的蛋白水解活性可能不是直接追求在外周血中我们没有观察到任何相关检查了破骨细胞的分化和功能相关基因与BMD指数。

相比之下,成骨细胞的差别明显对这些differentiation-relatedRUNX2和ALPL基因表达的PBMCs OP女性健康年龄组相比,以及积极的协会RUNX2基因表达与BMD股网站,可能表示显著减少骨形成在绝经后晚期相机会之前,下降RUNX2和ALPL表达式也观察骨组织的OP患者相比,健康受试者(38,40]。此外,较低的RUNX2表达和随后增加骨质疏松治疗后观察啮齿动物与骨吸收药物,如罗格列酮(41]。因此,在晚绝经后骨质疏松OP可能与骨形成与骨吸收增加,而不是减少活动。

我们的研究还表明,绝经后骨质疏松与后期改造的non-tissue-specific外周血基因和蛋白质表达。时许多人类疾病发生的精确调控细胞生长(细胞质量/体积)和扩散(细胞分裂率)被破坏42]。因此,以上的差别明显对这些mTOR相关基因的表达,降低成骨细胞分化和功能相关基因的表达(RUNX2和ALPL)在绝经后晚期的PBMCs OP女性健康受试者相比并不令人感到意外。支持我们的观察以前的观测的upregulation mTOR信号与骨形成增加活动在老鼠和人类osteoblast-like细胞培养43,44]。相比之下,系统性管理mTOR抑制剂引起的吸收FK506戏剧性OP在动物45,46的差别),伴随着对这些RUNX2表达式[47]。此外,免疫抑制剂吸收FK506治疗导致严重的骨质疏松和骨折发生率的增加在65%的病人48]。此外,积极的相关性mTOR成骨细胞基因表达和基因(RUNX2和TGFβ1)和破骨细胞(组织蛋白酶K,肿瘤坏死因子α,il - 1β协会)相关的分化和活动表明骨质疏松在OP一般偏差检查细胞生长和增殖活动的女性。

重要的upregulation autophagy-relatedULK1基因表达研究OP女性可能包括增加电池维护,随着自噬已被证明是与增加生存在许多细胞类型(49]。事实上,增加破骨细胞生存以前观察到与快速在激素性骨质疏松OP在动物研究50]。其他动物研究表明,抑制自噬导致的差别,对这些MCPIP(锌指CCCH-type包含12个)诱导表达监测标记单核细胞的破骨细胞前体(51]。因此,增加破骨细胞生存研究OP患者可以解释的骨质大量流失没有upregulation破骨细胞分化和活动相关的基因,如组织蛋白酶K和肿瘤坏死因子α。

的upregulationp21,在协会mTOR抑制,这是观察到的PBMCs检查OP女性,也是在培养细胞从各种血统mTOR抑制剂治疗后,雷帕霉素(52]。另一方面,mTOR的upregulation信号以响应振荡剪切应力与表达下降有关p21在人类osteoblast-like细胞(44]。此外,我们的观察下降RUNX2相关基因表达p21支持upregulation OP患者血液中的一项研究表明p21启动子镇压RUNX2的成骨细胞谱系细胞(53]。其他研究也表明p21之间的关联upregulation和抑制成骨细胞增殖和分化,增加单核细胞分化为破骨细胞前体(54- - - - - -56]。

5。结论

在这里,我们表明,外周血细胞的绝经后女性展示的重要upregulation OPULK1,p21,MMP-9基因。这是与一个以上的差别明显对这些相关联mTOR, RUNX2,ALPL基因的表达。虽然外围水平的细胞因子和其他因素调节骨代谢水平并不总是反映了观察骨内的相关性TGFβ1和RUNX2基因表达与BMD表明,这些基因的表达与骨组织可能同样受到影响。因此,骨吸收在绝经后晚期OP可能与骨形成减少和增加骨骼退化细胞的生存。应该执行进一步的实验来确认我们的观察。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

这项研究是由俄罗斯基础研究基金会(项目号。15 - 04 - 00546 - 12 - 04 - 00038 a Elena诉Tchetina)。

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