局部滴注苯扎氯铵诱导兔干眼模型的优化

抽象的

目的．为优化苯扎氯铵(benzalkonium chloride, BAC)外用诱导的兔干眼模型，可通过将BAC浓度从0.1%提高到0.2%来缩短原模型的灌注时间。材料和方法．对10只雄性新西兰大白兔进行实验性、前瞻性、随机研究，分为两组，两眼均考虑:对照组5只(N= 10)， 5只家兔经0.2% BAC处理(N= 10)。盐溶液（对照）和0.2％BAC连续5天滴加，每日两次。在治疗前后测量治疗前后测量撕裂和没有麻醉，撕裂时间，泪滴，角膜染色，结膜充血，粘蛋白细胞，粘膜云的高度和转录水平。结果．经0.2% BAC连续灌注5天后，无麻醉时泪液分泌明显增加 ，角膜染色 ，结膜充血 ，和IL-6 mRNA的水平 与对照组相比。相反，有麻醉撕裂分泌物减少 ，眼泪分手的时间 ，眼泪渗透性 ，杯状细胞密度 ，粘蛋白云的高度 ．结论．局部灌注0.2% BAC连续5天，每天2次，是诱导兔干眼模型的合适步骤，与原始模型(14天)相比，减少了灌注天数。

1.介绍

2017年，TFOS DEWS II将干眼定义为“一种眼表多因素疾病，其特征是泪膜失去内稳态，并伴有眼部症状，其中泪膜不稳定和高渗压、眼表炎症和损伤以及神经感觉异常起病因学作用“(1]. 干眼症影响世界上大部分人口的生活质量[2)，在5%至50%之间，视乎地理位置和用于诊断疾病的方法而定[3.］.

新的诊断生物标志物和干眼症治疗方法的发现需要使用动物模型。根据干眼症的病因和分类，多年来已经建立了不同的动物模型[4，5］.在兔子中，干眼症已经被许多程序（如Dacryoadencecectomy）诱导[6]，女性和男性阉割[7，8]，干燥应力[9]，诱导自身免疫性Dacryoadenitis [10]，泪腺与伴刀豆球蛋白A注射[11]，引流管道的伤害[12，神经去神经支配[13，局部滴注阿托品[14]或苯扎氯铵[15］.当前出版物的重点是BAC的局部滴注。

BAC是一种防腐剂，其掺入眼药水和隐形眼镜溶液的配方中。它经常用于青光眼药物。由于其毒性和刺激性，BAC可以对这些患者的眼表面产生不希望的副作用16，17］.商业配方中使用的BAC浓度在0.005%至0.02%之间，会溶解角膜上皮细胞的膜[18］.BAC还会损害泪膜成分的结构[19]角膜神经支配[20]和结膜细胞[21］.因此，局部灌注BAC已被用于建立家兔干眼模型[15]还有老鼠[22］.

基于局部给药的动物模型允许评估与泪液质量、眼表损伤和炎症相关的不同干眼标志物。在兔子身上，一些研究使用这个模型来评估不同含透明质酸滴眼液的疗效[23，24]，聚维酮[23表没食子儿茶素没食子酸酯[24，25，病毒灭活血清[26]，羧甲基普鲁兰多糖[27]，或环孢素A[28］.该模型也被用于评估使用药物传递系统的新治疗方法，如用抗炎药物修饰的纳米颗粒[29或表没食子儿茶素没食子酸酯/透明质酸[30]与环孢素A洗脱隐形眼镜[31］.其他作者研究了鞘内注射壳聚糖的水凝胶的干细菌治疗疗效[32]及干眼症对青光眼滤过手术的影响[33］.

由Xiong等人开发了由Bac的局部滴注诱导的原始兔子干眼模型。［15建议连续2周，每日2次，灌注0.1% BAC。此外，他们评估了较高浓度的BAC(0.2%、0.3%、0.5%和1%)，这是不安全的，但他们没有报告这一事实的结果。其他作者使用了这个模型，通过向三个[334 [24，26，30]连续几周。在小鼠中，原始干眼症模型由Lin等人开发[22每天2次，1周内滴注0.2% BAC，时间缩短一半。这种小鼠干眼模型已被其他作者有效地使用[34，35］.

目前的研究专注于减少诱导兔子干眼模型的滴注时间来诱导兔子干眼模型的想法，从增加0.1％至0.2％。

基于先前的研究，本研究的目的是优化局部滴注BAC诱导的原始兔干眼模型[15]，减少滴注的天数。为此，连续5天滴注0.2%的BAC，每天两次（最后一天除外）。评估与泪液质量、眼表损伤和炎症相关的干眼症症状。

2.材料和方法

2.1。研究设计

根据ARVO关于在眼科和视力研究中使用动物的声明以及欧洲议会和理事会关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63/EU，进行了一项实验性、前瞻性和随机研究。

所有试验均在盐水溶液（西班牙马德里Avizor）滴注前（前）和滴注后（后）进行，作为对照，0.2%BAC（德国达姆施塔特默克公司）滴注。两次滴注35 μL每天连续5天进行每天进行：在早上（上午10点）和晚上（下午6点），从周一到星期五。在最后一天，早上只有一次滴注，1小时后测量。总共含有9次滴注。基于以前的试验研究的结果选择BAC的浓度和滴注的天数。试验的顺序如下：撕裂渗透压，撕裂分泌物，没有麻醉，狭缝灯检查，结膜细胞学，以及局部麻醉的撕裂分泌物。在完成其余测量的情况下，滴注评估撕裂分泌的局部麻醉。

2.2。动物

研究中使用了10只雄性新西兰白兔，考虑两只眼睛(N眼睛= 20），随机分为两组：5只兔子作为控制（N= 10)和5只BAC 0.2%的家兔(N= 10)。家兔体重在2.0 ~ 2.5 kg之间。兔子被关在笼子里，可以自由获得食物和水。实验条件为光照-暗循环12 h，温度18℃，湿度30%。实验前，这些兔子被关在笼子里7天，以使它们适应新的居住条件。

２.３.试点研究

进行初步研究以建立BAC的最终浓度（0.2％）和滴注的天（5天）的数量。不希望的迹象，例如角膜溃疡，新血管形成，和瘢痕的存在，评价随时间与裂隙灯VX75（Luneau技术，沙特尔，法国）。八只兔中使用：2只兔子接受盐溶液，2只兔子接受0.1％的BAC，2只兔子接受0.2％的BAC，及2只兔子接受0.3％的BAC。所有的治疗都灌输，连续2周，每天两次，做周末在两个清洗期。

桌子1指定角膜溃疡，新生血管化和随着时间的推移疤痕的存在，而且具有不同浓度的BAC，而图1显示了在兔子中产生的角膜溃疡和瘢痕的代表性图像。

2.4。泪液分泌、破裂时间和渗透压

用Schirmer’s strip (Lenticon, Madrid, Spain)测量泪液分泌5分钟。被泪水浸湿的带子每一毫米对应1μl.将纸条置于颞下眼睑，测量时闭眼，避免反射性眨眼。测量采用表面麻醉和不采用表面麻醉。麻醉测量时，两滴含5 mg/ml盐酸丁卡因和0.5 mg/ml盐酸萘唑啉(Alcon Cusí，西班牙巴塞罗那)的商业滴眼液，两次滴注间隔5分钟。最后一次灌注后5min进行测量。

在裂隙灯检查时测量泪液破裂时间。对其评价，5μ商业2％荧光素钠（爱尔康卒死，巴塞罗那，西班牙）的L的灌输在眼表面。测量是一个带有计时器手动强制两个连续闪烁给兔子后。

用医疗器械（Tearlab Corporation，San Diego，California，United States）测量渗透渗透渗透渗透渗透镜，这是一种分析50 NL的泪膜的电阻抗。所有测量均在18°C的同一个房间中拍摄。双眼连续测量，首先右眼，然后是左眼。

2．5．裂隙灯检查

通过使用相同的商业2％荧光素钠，用狭缝灯VX75评估眼表面损伤的迹象，用于测量撕裂时间。efron分级尺度用于量化角膜染色和结膜充血的严重程度，将迹象分析为正常（0），痕量（1），轻度（2），中等（3）和严重（4）[36］.

此外，评估角膜溃疡、新生血管和瘢痕，以确认0.2% BAC灌注的安全性。

2.6。结膜细胞学

使用EYEPRIM (Opia Technologies, Paris, France)医疗设备进行结膜细胞学检查，收集浅表结膜细胞。取每只眼球结膜上、下象限的细胞学。

优异的细胞学在96％乙醇中在4℃下固定在96％的乙醇中24小时。然后，用苏木精酸席夫（PAS）程序染色样品。的goblet cells of the conjunctiva were evaluated by using the confocal microscopy Axiovert 200 M (Zeiss, Oberkochen, Germany). The density of goblet cells (Figure2)在每个样品的5个不同区域进行了定量分析。每个样本中15个不同细胞的粘蛋白云高度，包括细胞厚度被量化。样本可视化和测量都是通过使用LSM图像浏览器软件(蔡司)完成的。样品的苏木精在488 nm波长下被激发，其信号在505 ~ 530 nm范围内被过滤。另一方面，PAS的激发波长为543 nm，信号经过560nm滤波。的Z-对瞳孔大小为180的三维细胞进行叠加可视化 μM，堆栈间隔为0.25μm。所有这些程序是根据Peral的和平托尔[做37］.

在RNAlater (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) 4°C下进行24小时细胞学固定。然后，去除RNAlater，将样品保存在−80°C进行后处理。

2.7。RNA分离、cDNA合成及定量PCR

以下步骤的目的是量化结膜细胞中白细胞介素6 (IL-6) mRNA的水平。

使用QIAshredder和RNeasy Mini Kit (Qiagen，马德里，西班牙)按照制造商的说明从低等细胞学中分离总RNA。

第一链cDNA合成从22中进行 μL的总RNA，采用高容量cDNA逆转录试剂盒和随机的六聚体引物（赛默飞世尔科技）。定量PCR（qPCR）中的溶液使用cDNA，所述的QuantiTect SYBR Green试剂盒（Qiagen公司），和IL-6的特异性引物一式三份进行（5'-GCCTCACAAACTTCCTGGAG-3'/ 5'-GATGGTGTGTTCTGACCGTG-3'）一QuantStudio 3的系统上（赛默飞世尔科技）。的T.hermal cycler program was 15 min at 95°C, followed by 40 cycles of 15 s at 94°C, 30 s at 55°C, and 34 s at 72°C (data collection step). Nontemplate and nonreverse transcribed controls were included in all the experiments.

熔融曲线分析证实了PCR的特异性和引物二聚体的缺失。以HPRT1基因(5 ' -CTGGCAAAACAATGCAGACCT-3 ' /5 ' -GTCCTTTTCACCAGCAGGCTT-3 ')为内对照，经qPCR验证后，将mRNA相对表达归一化。内控基因验证和qPCR数据分析由2^−ΔCt和2^−Δ∆Ct方法分别证实，IL-6 / HPRT1引物对的扩增效率相似并接近值2。

2.8。统计分析

使用SPSS Statistics 23软件(IBM, Chicago, Illinois, United States)进行统计分析。每个分布的正态性使用夏皮罗-威尔克检验进行评估。在基线测量(PRE)和治疗灌注后(POST)之间的统计比较使用学生的T.- 在正常分布的情况下，在正常分布的情况下配对样本，在非正常分布的情况下，威尔克逊签名秩检验。另外，使用学生的每种治疗效果之间的统计比较T.-检验独立样本，在正态分布的情况下，和曼-惠特尼U检验，在非正态分布情况下。统计学意义为95% 在所有的测试中。

研究参数包括无麻醉下的泪液分泌、麻醉下的泪液分泌、泪液破裂时间、泪液渗透压、角膜染色、结膜充血、杯状细胞密度、粘蛋白云高度和IL-6mRNA水平。结果显示为平均值 ± SD。

结果

0.2% BAC连续5天没有在任何兔子中产生角膜溃疡、新生血管或瘢痕，证实了该程序的安全性。数字2从角膜染色和杯状细胞密度来看，显示0.2% BAC灌注引起的眼表损伤。

桌子2总结了在连续5天滴注0.2％BAC和盐溶液（对照）之前和之后的研究中的所有参数的值。

3.1。泪液分泌、破裂时间和渗透压

从两组之间的比较开始，图3.显示两种治疗对泪液参数(泪液分泌、泪液破裂时间和泪液渗透压)的标准化影响。关于泪液分泌，表面麻醉和不麻醉有不同的结果。在无麻醉的情况下，注入0.2% BAC后，与对照组(29.41±14.43%)相比，有统计学差异(85.42±22.51%)。 ；组间比较）。相反，在麻醉状态下，下降了30.30% ± 与对照组相比，0.2%的BAC组为5.33%，无统计学差异 ．

在撕裂破裂时间方面，两组均有统计学差异，但注入0.2% BAC后撕裂破裂时间(70.47±18.86%)高于对照组(22.47±8.01%)。 ．Finally, there was a statistical decrease in tear osmolarity of 5.40 ± 0.21% after the instillation of 0.2% BAC compared to the control group ，统计增幅为7.46% ± 0.30%.

3.2。裂隙灯检查

数字4显示对角膜染色，结膜充血这两种治疗的效果。因为它们是离散变量这些值不归比例。After the instillation of 0.2% BAC, there was a deterioration in the score of both corneal staining (2.60 ± 0.70) and conjunctival hyperemia (3.10 ± 0.74) compared to the control group ，没有统计学差异。

3.3。结膜细胞学

数字5显示了两种处理对杯状细胞相关参数（杯状细胞密度和粘蛋白云高度）的归一化效应。滴注0.2%的BAC可使杯状细胞密度降低（64.32%） ± 19.92%）和粘蛋白云高度（43.15%） ± 与对照组相比，为1.72% 显示没有统计差异。

3.4。定量PCR.

数字6显示了两种处理对IL-6 mRNA水平的影响。结果根据HPRT1信号(内部控制)和基线条件下IL-6 mRNA水平(PRE)归一化。对照组IL-6 mRNA水平(fold change)无统计学变化，BAC为0.2%时IL-6 mRNA水平升高44.87±42.70 ．比较两种处理的效果，灌注0.2% BAC产生了24.52倍的增长。

4.讨论

目前的研究报道了基于局部灌注BAC来减少诱导兔干眼模型所需时间的可能性。Xiong等人的原始模型有可能从14天缩短这一时间[15通过将BAC的浓度从0.1％提高至0.2％，达到5天。连续5天滴注0.2％，每天两次，两次干燥的皮眼迹象如撕裂时间，荧光素角膜染色，结膜充血，杯状细胞密度，粘蛋白云的高度，以及IL-6 mRNA的水平。．相反，这种滴注增加了撕裂分泌和降低的泪膜渗透压，这可能与下面讨论的不同因素相关联。

在安全性方面，连续5天灌注0.2% BAC未产生角膜溃疡或新生血管。在我们之前的初步研究中，观察到在第二周灌注0.2% BAC会产生角膜溃疡(见表)1），伴有新生血管和疤痕。Xiong等人。［15]评估了高于0.1%的BAC浓度(0.2%、0.3%、0.5%和1%)、不同的灌注频率(每天1-4次)和不同的治疗长度(1-4周)以优化他们的模型。他们证实，浓度高于0.1%的BAC可导致角膜溃疡、新生血管形成和瘢痕形成，持续时间为2周。然而，他们没有报告关于这一事实的数据，甚至在评估的第一周。由于我们的结果对眼表没有任何不良影响，连续5天滴注0.2% BAC可以被认为是诱导兔干眼的合适方法。与我们的结果一致，其他作者滴注0.2% BAC 1周以诱导小鼠干眼[22，34，35］.需要考虑的是，家兔和小鼠的解剖生理不一样，但小鼠的角膜比家兔的角膜还要薄[38，39］.

从该干眼模型的安全性来看，由于连续5天滴注0.2% BAC后，兔子的眼睛均无不良反应，因此该模型的成功率可视为100%。疗效方面，100%的眼因麻醉、泪液破裂时间、角膜染色、结膜充血、杯状细胞密度和粘蛋白云高度等因素导致泪液分泌恶化，80%的眼IL-6 mRNA水平升高。

关于泪液分泌，需要注意的是，在有或没有表面麻醉的情况下，灌注0.2% BAC的效果是完全不同的。在没有麻醉的情况下，0.2%的BAC产生的泪液分泌比对照组增加了约36%(见图)3(一个))，与缺水干眼症的预期效果相反[1］.这种高分泌与灌注该化合物后的眼部刺激有关[16，17]，这可能是产生反射泪花化。相反，随着麻醉，与对照组相比，预期撕裂分泌减少了34％（见图3 (b)). 我们在麻醉方面的研究结果与不同的研究结果一致，这些研究发现，使用两种局部麻醉都可以减少泪液分泌[15[全身麻醉[24，26，27，30- - - - - -33］.因此，使用麻醉，有必要在这一干眼模型来评估泪液的分泌。泪液分泌的麻醉通过这些提及的干眼症模型得到的值分别为3和10之间 μ五十、 进行Schirmer试验5年 闵[15，24，26，27，30，31，33］.

正如预期的那样，与对照组相比，滴注在48％约48％的滴度后减少了撕裂时间（见图3 (c))．这种严重的泪膜不稳定是干眼症病理生理学的一部分，它是由眼表的炎症和损伤引起的(见图)4- - - - - -6) [40］.据我们所知，只有Choi等人[31应用该模型评价0.1% BAC灌注2周后的撕裂破裂时间。他们发现与对照组相比减少了约73%。直接将泪液破裂时间值与其他研究进行比较应谨慎，因为这些值取决于不同的因素，如灌注荧光素的体积和浓度[41］.

泪液渗透压是另一个参数，其结果与干眼症模型中的预期不符[1］.在目前的研究中，与对照组相比，注入0.2% BAC使泪液渗透压降低了约13%(见图)3 (d)). 科学文献中未发现评估干眼模型泪液渗透压的研究。这种泪液渗透压的降低可能与无麻醉情况下泪液分泌的增加有关，因为在无麻醉情况下也可测量渗透压。泪液体积的增加会稀释泪液中的离子化合物，降低其渗透压。这一理论基于泪液渗透压和泪液分泌之间的负相关关系 在本研究的样本中。此外，Kim等人[42]发现两个参数之间存在负相关关系 在原发Sjögren综合征患者中。

对照组滴注生理盐水5天后，除麻醉时泪液分泌外，所有泪液参数均恶化(见表)2). 由于盐水溶液不会对眼表产生任何不良影响，这些变化与环境因素有关。

相对于眼表面的损坏，所有的兔子达到0.2％BAC的滴注后的最大得分角膜染色（见表2)．这种角膜损伤在结膜充血方面伴有结膜损伤（见图4 (b)与对照组相比，杯状细胞的密度降低了57%左右(见图)5（a）)．此外，这些杯状细胞的功能受到了影响考虑相比于对照组在其粘蛋白云高度的降低，约40％（见图5（b）)．这些标记物的严重程度提示0.2% BAC灌注是一种快速诱导眼表损伤的方法。在原始兔干眼模型中，Xiong等[15]发现0.1％BAC的滴注2周相比，目前的研究后的下角膜染色评分，但是杯状细胞的更高的损耗。正如预期的那样，其他作者发现了类似的眼表面的损伤[23- - - - - -33］.此外，它们中的一些报道在上皮角膜厚度的减小[24，29，30，这是另一个可以在这个动物模型中进行评估的标记。

另一方面，0.2% BAC灌注后，结膜细胞中IL-6 mRNA的高水平证实了眼表炎症的存在(见图)6)．应注意，0.2％BAC处理基团的标准偏差类似于其平均变异。这是因为两只眼睛显示出较低的IL-6 mRNA水平而不是其基线测量。其余的眼睛表达了比其基线测量高9.69％至99.80倍的表达水平。滴注0.1％BAC后，一些研究还发现IL-6表达水平的增加[24，30，31]和结膜细胞中的其他分子生物标志物，如IL-1β［30，31，33]，IL-8 [24，30], TNF -α［24，30，31]. 其他作者报告了杯状细胞在MUC5AC表达水平方面功能的降低[15，29］.

本兔干眼模型已被用于测量不同滴眼液和药物输送系统治疗干眼的疗效[23- - - - - -32］.一些研究应用于他们的治疗，而BAC正在灌输[23，27- - - - - -29，31]和其他研究在培育中滴注后，在干眼模型的可逆性期间[24- - - - - -26，30，32］.李等人[43]研究了Xiong等人的原始模型的稳定性[15]，确定干眼症状在最后一次滴注0.1%BAC后2至3周内持续。考虑到这两种替代方案都是有效的，在注入BAC的同时应用治疗是合乎逻辑的，以节省实验时间。然而，考虑到如果干眼症在较短的时间内诱发，与Li等人的研究相比，临床症状的恢复可能有所不同，因此在未来的研究中应考虑两种替代方案之间的比较[43］.

目前的研究存在一定的局限性，可以在未来的研究中加以改进。考虑到在没有麻醉的情况下，滴注0.2%后泪液渗透压降低，且与泪液分泌量呈负相关，本干眼模型的泪液渗透压测量可能需要表面麻醉。此外，如果在先导研究期间每天对家兔进行评估，灌注的天数还可以进一步减少。

5.结论

总之，连续5天局部滴注0.2％，每日两次，是诱导兔子干眼模型的适当程序，与原始模型相比，减少瞬间的天数（14天）[15]. 此外，强调在未来的研究中必须使用表面麻醉或全身麻醉来评估泪液分泌。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

致谢

这项研究发表是为了纪念于2019年4月2日去世的Jesus Pintor。这项研究是自费的。

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