评价Intrastromal核黄素浓度在人类角膜后三个角膜交联自吸过程:一个试点研究

文摘

目的。比较三个角膜后基质浓度核黄素交联(CXL)自吸过程:标准(EpiOff) transepithelial角膜(EpiOn)和iontophoresis-assisted技术(Ionto)用0.1%磷酸低渗的核黄素。方法。随机开放试点临床研究。十二个眼角膜/ 12先进圆锥角膜患者随机分为4组CXL ()。与标准核黄素EpiOff眼角膜进行了自吸和增强核黄素溶液(RICROLIN +) EpiOff, EpiOn,电离子透入疗法技术。此后,深前板层角膜切除术手术治疗之后,获得的去除掉角膜组织被冻结了。最大intrastromal核黄素含量测定的高效液相色谱/质谱(微克/ dg)。结果。核黄素的平均基质浓度微克/ dg EpiOff组,微克/ g在EpiOff-RICROLIN +集团微克/ dg EpiOn-RICROLIN +组,微克/ dg电离子透入疗法RICROLIN +组。7倍降低intrastromal核黄素浓度观察比较EpiOn-RICROLIN +和EpiOff-RICROLIN +组。结论。目前的初步研究表明,两种transepithelial CXL技术结合低渗的增强核黄素配方(RICROLIN +)仍低于标准CXL技巧;然而,更大的临床研究还需要进一步的验证结果和进展。

1。介绍

圆锥形角膜(KC)是一种进步,检测不到发炎的迹象角膜变薄疾病由于组织的变化和基质角膜胶原纤维的结构1]。这种疾病通常体现在生活的第二个十年与一般人群患病率相对较高(1 1750年在欧洲白人10-44岁)(2]。在大约20%的keratoconic眼中,角膜移植是需要恢复视力2]。

2003年,与同事Wollensak推出第一个可用的治疗选择阻止疾病进展的化学修改胶原纤维和增加角膜生物力学强度和稳定性3]。利用紫外(UV)光和核黄素作为光敏剂,他们诱导胶原纤维之间的共价交联键3]。自那以后,大量的临床研究和出版物显示角膜胶原交联的疗效和安全性(CXL)技术在减慢或停止KC进展。目前,CXL已经成为一个标准的,进步的KC low-invasive,和安全的治疗选择,标准epithelium-off技术上的变化一直在寻求避免角膜上皮清创术,从而增加病人的安全和舒适1]。然而,当角膜上皮不去除,核黄素渗透进入角膜基质减少,降低手术的疗效[4]。因此,不同的策略等不同的核黄素配方,将提高其渗透通过完整的上皮细胞,以及延长自吸时间,被用来克服这个问题。然而,imbibition-time延长暴露眼角膜过度脱水和变薄。此外,深入渗透核黄素可以导致角膜内皮对UVA毒性的易感性(5]。

缩短自吸时间,最近推出了一个新的交联技术使用iontophoresis-assisted核黄素政府(I-CXL)。由于核黄素的分子量小,水溶性,负电荷,电离子透入疗法(这是一个很好的候选人6]。最近,术后1年的第一个初步结果报告表明I-CXL的功效在稳定的发展CK (7]。此外,一个新的hypoosmolar指控核黄素溶液(RICROLIN +;SOOFT意大利公司。,Montegiorgio, Italy) dextran-free that uses EDTA 0,1% and trometamol 0,05% as enhancers was introduced to optimize riboflavin stromal penetration by iontophoresis with fewer side effects [4,5]。

但是,没有比较临床研究核黄素渗透功效比较transepithelial技术标准epithelium-off技术和新核黄素溶液(RICROLIN +)进行了更新。

因此,目前的试点研究,旨在确定角膜基质中核黄素含量的差异后三种类型的自吸过程(标准EpiOff、EpiOn iontophoresis-assisted管理局)的0.1%提高核黄素溶液相比,标准程序在人类角膜切除在深前角膜成形术(DALK)执行。

2。材料和方法

2.1。试点研究设计

随机开放的试点研究是由党卫军Giovanni e保罗的眼科医院(意大利威尼斯)在2014年2月和3月之间。在入学之前,书面知情同意是获得所有的病人的临床研究。飞行员临床试验的目的是比较的功效核黄素渗透到角膜基质使用前三角膜交联自吸技术取代前角膜组织使用深与供体角膜前由于先进的圆锥形角膜板层角膜移植术。

主要结果测量指标是最大的角膜基质核黄素(微克/ dg)浓度。

2.2。病人的选择

12例(12个眼角膜)和先进的圆锥形角膜被选为角膜交联过程之前接受前角膜成形术(DALK)。

DALK的迹象是定义在临床和keratotopographical圆锥形角膜被确认的进展。

每个病人有一个预处理和术后标准眼科检查,其中包括未调整的距离视力(UDVA),距离矫正视力(CDVA)屈光计检查,角膜地形,pachymetry,内皮细胞计数和共焦显微镜使用,裂隙灯活组织镜检查。

只有年龄在18岁到60岁的病人进入了这项研究。的年龄上限是60年由于疾病的性质8]。排除标准包括角膜厚度小于400μm,角膜瘢痕,先前的折射或其他角膜手术、化学烧伤、严重感染、角膜基质营养不良,自身免疫性疾病,戴隐形眼镜不到四个星期前登记。

2.3。治疗

DALK被执行之前,12个符合条件的患者随机分为四组:EpiOff集团(金本位或对照组),EpiOff-RICROLIN +集团EpiOn-RICROLIN +集团和Ionto-RICROLIN +组(表1)。

EpiOff设计作为对照组(黄金标准组)和包括三只眼睛()。核黄素吸入了根据传统的胶原蛋白交联协议(9]。简而言之,局部麻醉滴剂后,中央角膜上皮被使用软抹刀直径9毫米。标准核黄素0.1%眼药水(Ricrolin;SOOFT意大利公司。,Montegiorgio, Italy) were applied to the denuded cornea 1 drop every 1 to 2 minutes for 15 minutes. In EpiOff-RICROLIN+ group, after conventional corneal epithelium removal three corneas ()收到RICROLIN +(低渗的0.1%核黄素溶液与增强子dextran-free[依地酸包括钠、氨丁三醇、bihydrate磷酸氢钠,磷酸和bihydrate钠二元的);SOOFT意大利公司每1到2分钟)1下降15分钟。EpiOn和Ionto组,眼角膜收到通过transepithelial核黄素自吸的方法。在EpiOn-RICROLIN +集团三个眼角膜()收到RICROLIN + 30分钟,每下降1到2分钟。尽管RICROLIN +设计的增强剂,使更好的核黄素渗透通过完整的角膜上皮,角膜基质较长的自吸时间被用来报道在以前的协议(9]。三个眼角膜Ionto-RICROLIN +组浸泡RICROLIN +使用电离子透入疗法系统(IONTOFOR-CXL;之前报道的SOOFT意大利公司)Mastropasqua et al。9]。电离子透入疗法,两个电极连接到发电机是必要的。一个电极(正极)放在病人的前额,而主要的负电极是包含在一个橡胶圈直径10毫米,这是应用于角膜表面和随之而来常数核黄素溶液管理过程中。离子电渗疗法是使用1 mA /分钟执行强度为5分钟。

核黄素浸泡后,深前角膜成形术(DALK)开始取代80%的前部分病变角膜健康前角膜移植。

后立即手术切除前间质组织,从EpiOff组冰冻切片,在EpiOn Ionto集团完整的上皮被冻结之前防止上皮对核黄素浓度测量的影响。

2.4。核黄素浓度测量

核黄素在每个角膜基质组织样本的浓度是由高效液相色谱/质谱(HPLC / MS)均质化后(Ultraturrax)和提取50:50 (v / v)乙腈:水。提取被离心机15分钟10000转4°C。样本提取与初始流动相稀释100倍(10:90 100毫米甲酸铵缓冲溶液pH值3.2:乙腈),和一个5整除μL是注入高效液相色谱柱(Kinetex C8, 50×2.1毫米,2.6μ米)。样本然后使用安捷伦6410三重四质谱仪分析(三重四重MS)与电喷雾电离(ESI)源(美国安捷伦科技)。所有数据都采用安捷伦6410年收购定量分析版本B.01.03分析师数据处理软件。获得的校准曲线与核黄素的标准储备溶液溶解在50:50 (v / v)乙腈:水来获得一个精确的最终浓度为1μ克/毫升。目标校准范围是0.676 - -1.690 ng / mL (LOD 0.676 ng / mL)。权力平等主义的流量被设定为0.1毫升/分钟的3分钟每个试验的持续时间。核黄素是积极的电离条件下电离。主要主要ESI光谱的峰值核黄素(M-H-H对应₂O)⁺离子在377年,第二个峰值检测m / z 243。色谱是集成并绘制的校准曲线的峰面积核黄素。决定系数()是0.999。

2.5。统计分析

我们的试点研究的局限性包括小样本大小,禁用一个可靠的统计分析。因此,给出的结果意味着核黄素±SD浓度。个人数据绘制散点图(图1)。核黄素的初步试验结果比较不同浓度四个治疗组被克鲁斯卡尔-沃利斯非参数检验测试加上Dunn的多重比较检验。

3所示。结果与讨论

3.1。结果

招聘飞行员试验于2013年完成了三个月后,12眼随机分为4组包含3个眼角膜,每个EpiOff, EpiOff-RICROLIN + EpiOn-RICROLIN +, Ionto-RICROLIN +组。组平衡对供者年龄和术前角膜厚度值。然而,EpiOff治疗组的一个角膜失去因为技术问题进行分析。

总的来说,意味着核黄素浓度切除前角膜片核黄素吸入后使用这三种CXL技术报告在表2。

核黄素的平均基质浓度微克/ dg ()EpiOff组(金本位集团),微克/ dg EpiOff-RICROLIN +组,微克/ dg EpiOn-RICROLIN +组,微克/ dg电离子透入疗法RICROLIN +组。初步研究结果证实iontophoresis-assisted核黄素吸入浓度达到更高的核黄素intrastromal EpiOn技术相比,但仍核黄素吸入的疗效不如EpiOff标准技术。

然而,由于试验样本量小,由于一个意想不到的高变异性之间的两个样品处理标准核黄素和EpiOff过程,一个可靠的统计分析不能被执行,需要更高的病人。

然而,EpiOff-RICROLIN +组更好的和一致的intrastromal核黄素浓度被注意到。此外,增加了7倍intrastromal核黄素浓度观察比较EpiOff-RICROLIN +集团和EpiOn-RICROLIN +集团(微克/ dg和微克/ dg, resp)(图1)。因此,这些初步研究结果表明,增加自吸时间(从15分钟到30分钟)不能克服核黄素渗透率的降低由于完整的上皮细胞。相反,电离子透入疗法组角膜epithelium-dependent抑制核黄素渗透可以部分地克服iontophoresis-assisted技术虽然自吸时间减少到5分钟,如果相比标准EpiOff组。

3.2。讨论

经过十年的临床和实验研究中,众所周知,足够浓度的核黄素在角膜基质获得角膜的生物力学效应至关重要CXL [4,9]。因此,由于核黄素无法穿透完整角膜上皮由于其化学性质,中央角膜上皮是机械地去除掉在当前标准CXL (EpiOff)技术,允许足够的核黄素基质自吸(5]。然而,除上皮引起各种副作用,包括内部和术后疼痛以及视觉过程后的前三个月下降。此外,它可以使病人严重的角膜感染和角膜透明度的损失由于异常角膜基质瘢痕过程(5]。因此,近年来已投入开发新的高效transepithelial核黄素渗透技术。不同的策略进行了研究提高transepithelial核黄素渗透,比如增加核黄素自吸时间和新的核黄素溶液配方,以促进其transepithelial渗透。出于这个原因,提出了一些增强剂,Ricrolin TE (SOOFT, Montegiorgio、调频、意大利)配方被研究最多的一个,没有共识关于研究临床疗效相比标准CXL技术(5]。另一个策略来提高核黄素渗透通过完整的角膜上皮是最近推出了电离子透入疗法技术(10]。这是一种非侵入性技术,使整个组织转移的带电小分子通过低强度的电场(11]。的速率带电分子可以渗透到组织可以另外增加与改变解决方案的特点是在核黄素的解决方案。特别低渗的核黄素溶液配方(RICROLIN +)开发iontophoretic药优化核黄素吸入通过完整的角膜上皮。这进一步支持缩短治疗时间,最近所示5分钟电离子透入疗法自吸技术(9]。此外,最近的一项研究Mastropasqua等人已经比较了transepithelial (EpiOn和Ionto)技术与标准EpiOff核黄素基质渗透技术,显示更大的和更深入的普及率的核黄素iontophoresis-assisted transepithelial技术使用;然而,核黄素含量仍低于标准EpiOff技术实现。此外,这项研究是在人类尸体眼角膜不适合移植(9]。到目前为止,没有临床比较研究评估这三个CXL吸入技术是先进圆锥形角膜的眼睛。

因此,在我们最近的试点研究我们想比较这三种类型的核黄素自吸过程使用一个低渗的0.1%提高核黄素溶液配方(RICROLIN +)与先进标准CXL程序keratoconic眼睛立即深前角膜成形术(DALK)之前执行。由于先前的报道显示,在中间和后没有明显的统计学差异角膜基质核黄素集中在这三个测试CXL技术(4),根据这一事实DALK移除病变的角膜组织的80%,我们可以获得足够的角膜基质材料进一步核黄素浓度使用高效液相色谱分析。此外,为了避免影响角膜上皮的transepithelial CXL集团,眼角膜被deepithelized之前冻结。然而,由于试验样本量小,目前试点研究是有限的和可靠的统计分析结果。因此,虽然我们的初步试验研究数据显示没有统计上的显著差异意味着基质核黄素浓度观察transepithelial技术和标准CXL之间的技术,这可能是由于一个意想不到的高变异性之间的两个测试样品在标准对照组;因此,小心结果解释和需要大量临床研究。

正如所料,核黄素普及率最低的是观察到的被动EpiOn-RICROLIN +和稍微更好的渗透是电离子透入疗法组中观察到,达到大约50%的intrastromal浓度标准EpiOff组的结果。重要的是,最高的核黄素含量仍发现EpiOff集团,初步研究结果是类似于之前报道的研究(4]。事实上,当我们比较EpiOn-RICROLIN +组EpiOff-RICROLIN +组,我们观察intrastromal核黄素浓度下降了7倍。这些结果说明也在我们的试点研究提高自吸时间(从15分钟到30分钟)不能克服核黄素的完整的角膜上皮的屏障功能渗透,尽管使用增强的核黄素方案制定(4]。最近的一项研究表明,兔子的眼睛已经transepithelial核黄素渗透率增加当使用增强剂,如0.01%苯扎氯铵和0.44%氯化钠dextran-free;在我们的初步研究,我们也证明了iontophoresis-assisted技术结果更好EpiOn组相比,但仍不如deepithelized CXL技术。初步研究结果可能表明,角膜epithelium-dependent抑制核黄素渗透可能至少部分成功克服iontophoresis-assisted技术,如果使用低渗的增强核黄素配方,即使自吸时间减少到5分钟。然而,我们鼓励试点研究结果应该进一步评估在较大的临床研究,已经在进步。

另外有趣的是,我们观察到一个更好的和一致的渗透EpiOff-RICROLIN +组标准核黄素组相比,表明进一步的改进(如intrastromal核黄素含量高或短时间治疗)也可以取得EpiOff黄金标准技术组。

4所示。结论

总之,目前的初步研究表明,两个transepithelial CXL技术结合低渗的增强核黄素配方(RICROLIN +)仍低于标准CXL技术。此外,最高的核黄素浓度观察EpiOff-RICROLIN +组,表明进一步的改善也可以取得EpiOff黄金标准技术组。此外,我们表明,延长自吸时间被动核黄素产量不足增加渗透组(EpiOn组)。相反,如果由iontophoresis-assistance核黄素,自吸时间从30分钟缩短到5分钟可以观察到。尽管如此,由于小样本大小,一个可靠的统计分析是不可能的,这些初步研究结果符合之前报道的数据(4,9在人类捐赠眼角膜。然而,额外的大型临床研究需要进一步验证这些结果和的长期疗效transepithelial CXL相比标准CXL协议。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

硼砂Lužnik是勃林格殷格翰集团旅游资助的接受者。

引用

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