炎症和血管生成蛋白质检测的人工玻璃:仪珠化验

文摘

介绍。评估仪珠的临床可行性和再现性试验(CBA) nondiluted玻璃样品的患者老年性视网膜黄斑性病变(ARMD)、糖尿病性黄斑水肿(测距装置)和视网膜中央静脉阻塞(CRVO)。方法。12个病人从一个诊所天胜任intravitreal注射(老年性视网膜黄斑性病变,测距装置,CRVO),并进行了核心玻璃体切除术联合治疗包括单23个指标也产生了一个体积为0.6毫升每个病人未稀释的玻璃。白细胞介素- 6 (il - 6)、血管内皮生长因子同种型(VEGF-A),和单核细胞chemo-attractant蛋白1 (MCP-1)评估当天直接从0.3毫升(新鲜的样品)。评估再现性在−0.3 ml被冻结了60天80°,CBA的重复(冷冻样品)。结果。新鲜的样品il - 6在CRVO最高(平均il - 6 55.8 pg / mL) >测距装置(50.6)>老年性视网膜黄斑性病变(3.1)。CRVO VEGF测量最高(447.4)>测距装置(3.9)>老年性视网膜黄斑性病变(2.0)。在CRVO MCP-1最高(595.7)> AMD(530.8) >测距装置(178)。CBA再现性冷冻存储检查后对MCP1(最精确的)> VEGF ()> il - 6 ()。结论。CBA是一个创新的、快速确定和可靠的技术来分析蛋白质的液体,像未稀释的玻璃,这是非常重要的,以便更好地理解眼病理生理学和药理学。没有间断的影响存储在80°−CBA的再现性。

1。介绍

眼部炎症和血管生成细胞因子的测量已经成为越来越重要的时代intravitreal药物治疗在许多视网膜疾病,主要是老年性视网膜黄斑性病变(ARMD),糖尿病黄斑水肿(测距装置)和视网膜静脉阻塞(RVO) [1- - - - - -3]。在眼科领域,临床和临床前研究主要依据的是最新的ELISA(酶联免疫吸附试验)结果,已利用广泛理解的表达细胞因子的眼部组织(视网膜脉络膜、视网膜色素上皮细胞)。单因素分析的定量分析,然而,需要为每个测量约0.4毫升的液体和实验室360分钟的时间。一个新的创新技术,仪珠数组(CBA)技术,提供了相反的多个标记的定量分析各种标本,需要一个更小的样本体积,是时间和成本效益4]。它是基于流式细胞术,这是一个分析工具,允许歧视不同的颗粒大小和/或颜色的基础上。

早些时候已被证明,使用血清或血液样本,CBA和ELISA结果相关性好(5]。它是有争议的问题,但是,如果CBA和ELISA值未稀释的玻璃相媲美的各种临床和实验室条件下在眼科。直到今天,迈尔等人是唯一证明玻璃和血清细胞因子的浓度,包括血管内皮生长因子(VEGF),由CBA表现出很强的相关性与衡量ELISA先进的糖尿病性视网膜病变,患者必须接受三端口玻璃体切除术(6]。此外还不清楚,从实验室的角度来看,如果CBA结果重现间歇存储后−80°C,这常常发生在临床和实验室常规。而且有趣的是评估CBA技术检测炎症和proangiogenic细胞因子的病人将有资格获得一个intravitreal注射vegf,类固醇,或联合治疗药物由于视力损害黄斑水肿。大部分数据来源于水样品到目前为止(7),这是重要的水样本应该关联的玻璃样品,但细胞因子在两种液体的绝对浓度显著差异(8]。之前建立一个新方法如CBA在眼科,重要的是评估与玻璃液的临床可行性和再现性。

在这项研究中浓度的白细胞介素- 6 (il - 6)、血管内皮生长因子(VEGF)和单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)分析了稀释,减少玻璃样本年龄相关黄斑变性患者不易患上老年性视网膜黄斑性病变(ARMD),糖尿病黄斑水肿(测距装置)和视网膜中央静脉阻塞(CRVO),能胜任intravitreal注射在临床的一天。

2。方法

2.1。研究人群

12个患者纳入本研究:六老年性视网膜黄斑性病变(ARMD)患者(年龄年)与一个活跃的神秘脉络膜新生血管形成和平均中心黄斑厚度为368±45μm以光谱光学相干断层扫描(OCT;10月3 d - 2000;Willich Topcon德国,德国),三个糖尿病黄斑水肿患者(测距装置;66.8±10.5岁),意味着中央黄斑厚度508±108μ米,和三个病人()和视网膜中央静脉阻塞(CRVO)历史的11周±3周CRVO和中央黄斑厚度557±125μm。治疗的适应症是视力降低黄斑水肿坚持我们的联合疗法的概念(9,10]。

排除标准为本系列的患者眼内手术、急性眼感染、葡萄膜炎、创伤、玻璃体出血、视网膜脱离。

收集的样本进行当地的完整的伦理委员会批准后(57/08)按照欧洲良好的临床实践指南和《赫尔辛基宣言》。从每个病人开始之前获得知情同意的疗法。

2.2。统计分析

数据分析使用偏见软件(版本8.3.8,ε,达姆施塔特,德国)的窗口。所有测试都是在一个错误的5%水平。大卫的测试用于检查分布的数据。间歇性的影响来确定存储的非参数Wilcoxon-matched pair-test使用包括Hodge-Lehmann指标,比较测试结果的方差的95%置信区间。

2.3。样本收集和准备

有限的核心术后玻璃体切除术是使用单23日规执行vitrector(美国佛罗里达州Intrector,了解仪器,斯图尔特),两个独立的愿望和注入渠道。结膜位移斜巩膜切开术后进行照亮的尖端vitrector耳机和放大28度透镜mid-vitreous腔。助理然后吸气总共0.6毫升稀释和削减中期和玻璃质的外科医生的指示,他们控制临床相关围手术期肌张力减退。因此最小样本容量为0.3毫升玻璃是用于“新鲜”直接CBA分析在同一天和0.3毫升“冻结”样本用于存储在−80°C测试CBA再现性。最后有限的核心玻璃体切除术后后续isovolumic替换平衡盐溶液(BSS,爱尔康,弗莱堡,德国,0.3毫升),1.25毫克(0.1毫升)贝伐单抗(阿瓦斯丁,基因技术公司,旧金山、钙、美国),和0.8毫克(0.2毫升)地塞米松(Dexa-ratiopharm,乌尔姆,德国)坚持注射联合治疗的概念在这些视网膜疾病(9,10]。

2.4。细胞因子

2.4.1。il - 6

白细胞介素- 6 (il - 6)是一种调节蛋白在炎症过程和B细胞的成熟。产生的蛋白质主要是网站的急性和慢性炎症,它分泌到血清和诱发转录炎症反应通过il - 6 receptor-alpha,这与VEGF表达(11]。在眼科中描述的各种炎症反应疾病临床上可以被视为一个黄斑水肿在测距装置和RVO [1,3,12]。

2.4.2。VEGF

血管内皮生长因子(VEGF)在正常生理条件下表达的RPE视网膜新陈代谢和平衡的开窗法和营养choriocapillaris [13]。VEGF的过度表达,然而,在视网膜细胞主要是由缺氧诱导,il - 6和导致血管通透性增加11),像脉络膜新生血管形成,糖尿病性视网膜病变,最远方的视网膜静脉阻塞(14]。看起来,VEGF的表达与缺血性视网膜的总面积15]。

2.4.3。MCP-1

单核细胞的趋化蛋白1 (MCP-1)是一个成员的CC趋化因子(Cystein-cystein趋化因子)。免疫细胞如单核细胞,被MCP-1的表达。它是由视网膜内皮细胞和牵连leukostasis视网膜缺氧引起的,因此可以VEGF (16,17]。以前的数据推测MCP-1博士的增殖阶段作为一个潜在的因素(18]。

2.5。仪珠试验(CBA)

大量的VEGF-A、il - 6和MCP-1测定使用仪珠阵列系统(BD,海德堡,德国)。实验进行了生产后的说明书。总之,50μL的玻璃体样本孵化1 h和适当数量的检测珠子,每个调查的具体因素。之后,样品被孵化2 h和检测试剂,这是为每个使用特定检测珠。样本在流式细胞仪测量第二章(BD、海德堡、德国)和分析FCAP阵列软件(BD,海德堡,德国)。VEGF、il - 6, MCP-1计算使用特定的标准曲线(pg / mL)。CBA在论文重复样本,手术过程中获得和存储−80°C的60天。

3所示。结果

3.1。CBA

新鲜的样品白介素CRVO最高(平均il - 6 55.8 pg / mL;95%置信区间12.2 - -149.1)>测距装置(50.6;-89 - 3.5)>老年性视网膜黄斑性病变(3.1;2.4 - -60.2)。VEGF在CRVO测量最高(447.4;-454 - 51.8)>测距装置(3.9;3.6 - -46.5)> AMD (2.0;1.5 - -4.1)。在CRVO MCP-1较高(595.7;463.1 - -2397.8)> AMD (530.8; 38.3–768.3) > DME (178; 147.5–339.8; Table1)。

在冷冻样品il - 6在测距装置最高(55.7;4.4 - -99.1)> CRVO (51.7;9.9 - -237.7)>老年性视网膜黄斑性病变(4.8;3.2 - -114.3)。VEGF是CRVO组最高(414.7;38.6 - -421.1)>测距装置(4.6;4.4 - -54.5)>老年性视网膜黄斑性病变(2.2;1.3 - -3.9)。MCP-1 CRVO最高(601.2;482 - 2055年)>老年性视网膜黄斑性病变(306.7; 42.1–1115.3) > DME (164.4; 164.4–363.7).

参数化的数据分布(大卫的测试)。

3.2。CBA再现性

新鲜和冷冻的值值未达到统计上的显著水平,因此可比对所有三种蛋白质测试和最精确的对MCP1 ()> VEGF ()> il - 6 ()。此外,Hodge-Lehmann的差异,这表明特定蛋白质含量的总体平均偏差,证明因子水平没有显著差异(表后存储2)。一般来说,没有变性玻璃il - 6, MCP-1和VEGF由于存储60天的−80°C。

4所示。讨论

本研究的目的是评估仪珠的可行性和再现性试验(CBA)设置常规诊所和实验室的一天。不是为了测量细胞因子水平/疾病,作为本研究的主要限制是小样本大小。我们演示了可行性评估未稀释的玻璃样品12早上通过执行手术的病人,吸入0.6毫升/病人,并分析0.3毫升的探针直接当天三小时后。我们观察到细胞因子水平RVO和测距装置按照文学。就我们所知到目前为止,没有证据表明在眼内细胞因子的水平未稀释的玻璃样品在AMD。理论上,更多的新鲜AMD样品的基础上可以很容易地获得我们的协议从一天的手术程序。在临床常规,然而,问题如果有足够多的新鲜样本可以获得,因此间歇存储需要评估。其他0.3毫升的探针被冻结在−80断断续续的存储后测试结果重现性好。我们不能发现任何统计显著退化细胞因子(il - 6;VEGF;MCP-1),并得出结论,存储的玻璃样品并没有改变之前的细胞因子水平,结果立即存储和分析样品具有可比性。

有大量的证据表明细胞因子调节血管生成和脉络膜的炎症过程,RPE,视网膜,il - 6、VEGF, MCP-1,导致老年性视网膜黄斑性病变的发病机理,RVO和测距装置7,19,20.]。另外它可以证明,在玻璃样品合格的病人三端口术后玻璃体切除术,由于增生性疾病转换,这些血管生成因子的浓度增加,这是证明了大多数情况下与ELISA (1,3]。然而,我们知道,这个小系列的患者样本没有对照组,并不能得出结论这些疾病的细胞因子。相反,我们可以证明仪珠试验(CBA)是一个时间和具有成本效益的工具在ELISA-a相比强大的技术来分析大量的样本在不同视网膜疾病。ELISA相比只有一个细胞因子可能是样本容量的分析在我们的研究中,将会生成更多的时间,并将因此更昂贵。

5。结论

在AMD、测距装置和RVO频繁的临床重要性intravitreal vegf或类固醇治疗,这是画在临床观察与10月或荧光素血管造影并不是直接的生物反馈机制,保证新的分析技术,如CBA的评价。

利益冲突

作者都没有冲突的主题。

承认

阿道夫·梅塞尔集团基金会Konigstein,德国,支持研究小组。

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