文摘
骨髓间充质干细胞(bmsc)已被确认为一个潜在的治疗方法的几种疾病。在这里,我们表明,BMSC-derived液促进FOXP3表达和诱导CD4的转换+T细胞CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞,免疫抑制活性具有重要意义。我们发现mir - 181 a - 5 - p是调节在BMSC-derived液,可以转移到CD4细胞+T细胞。在CD4+细胞,mir - 181 a SIRT1的直接目标,抑制其表达。此外,表达下调SIRT1增强FOXP3通过蛋白质乙酰化作用。总之,我们的数据表明,BMSC-derived exosomal mir - 181 a免疫耐受的维护是至关重要的。此外,我们的研究结果显示,BMSC-derived exosomal mir - 181 a诱发CD4的生产+CD25+FOXP3+通过SIRT1 /乙酰化/ FOXP3 Treg细胞。
1。介绍
胰腺移植广泛用于治疗糖尿病(1,2]。然而,复发性自身免疫和传统胰腺移植异体排斥是重大障碍(1,2]。学会宽容是免疫系统的一个标志,和诱导免疫耐受被认为是一种很有前途的方法来改善胰腺移植的成功(3,4]。
msc多功能基质细胞,在免疫反应中发挥重要作用通过免疫抑制(5]。张等人显示,免疫血小板减少症(MSC-mediated免疫抑制的作用6]。Mounayar等人建议PI3kα和STAT1调节免疫抑制活动msc (7]。液是一种膜微泡大约40 - 150 nm直径(8)参与Treg细胞发展(8,9),可以调节细胞通讯,microrna邻近细胞(10]。研究表明,液可能是干细胞治疗神经退行性疾病的新策略(11]。此外,越来越多的证据表明,MSC-derived exosomal microrna免疫抑制监管至关重要。杜等人表明MSC-derived细胞促进调节性T细胞在哮喘的免疫抑制12]。Shahir等人表示,MSC-derived液能诱导小鼠耐受性树突状细胞(13]。此外,MSC-derived exosomal microrna在免疫抑制功能(14]。MSC-derived液可以将小分子核糖核酸(microrna)受体,随后影响免疫内稳态(15- - - - - -17]。
此外,以往的研究发现,在诱导msc似乎发挥重要作用FOXP3-expressing Treg细胞(18,19]。表达CD4 Forkhead盒蛋白3(具体)+CD25+Treg细胞免疫耐受维护至关重要,例如,Nemo-like kinase-enhanced FOXP3参与Treg细胞介导免疫耐受(20.]。FOXP3+通过neuropilin-1 Treg细胞促进移植耐受(21]。维护FOXP3 POH1导致免疫耐受+Treg细胞(22]。越来越多的证据表明,维护FOXP3表达对Treg细胞发育和功能至关重要。张成泽等人表示,Hhex抑制Treg细胞通过抑制FOXP3 [23]。陈证明失调FOXP3损害Treg细胞功能(甲基化24]。具体还在免疫耐受中起着核心作用;因此,稳定FOXP3的表达可能会提供一个可接受的方式来维持免疫耐受和改善胰腺移植的成功25]。研究人员已经证明,FOXP3表达和活动可以控制的转译后的修改。此外,FOXP3的转译后的修改导致Treg细胞功能(26]。Kagoya等人表示,FOXP3起着关键作用的精氨酸甲基化抑制Treg细胞活动(27]。林等人认为,山柰酚促进Treg细胞的抑制功能通过抑制PIMI-mediated FOXP3磷酸化(28]。此外,FOXP3的脱乙酰作用sirtuin蛋白1 (SIRT1)也在Treg细胞功能调节29日- - - - - -31日]。据报道,FOXP3的乙酰化调节CD4细胞的抑制作用+CD25+FOXP3+Treg细胞(29日,30.]。张等人表明miR-23a-3p-mediated FOXP3乙酰化作用可以诱导Treg函数(32]。在腹主动脉瘤(AAA), SIRT1-regulated FOXP3的乙酰化调节Treg函数(30.]。表达CD4 Forkhead盒蛋白3(具体)+CD25+Treg细胞在免疫耐受中发挥重要作用的维护(33]。持续FOXP3的表达是最具体的描述CD4的标志+CD25+FOXP3+Treg细胞(23,34]。因此,FOXP3的规定可能会提供一个潜在的免疫抑制的方法。表观遗传调控,如乙酰化和甲基化,FOXP3的研究(35]。
在这项研究中,我们发现底层机制BMSC-derived exosomal诱发CD4 mir - 181+CD25+FOXP3+通过SIRT1 /乙酰化/ FOXP3 Treg细胞,提供一个潜在的改善胰腺移植的成功的方法。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
bmsc买来Cyagen生物科学(mubmx - 01001)。然后,老鼠的细胞培养间充质干细胞生长培养基(mucmx - 90011, Cyagen生物科学)和培养在37°C和5%的公司2。CD34和CD44表面标记用于综合分析。
2.2。BMSC-Exosome隔离和标识
当bmsc的密度达到大约80%,培养基是丢弃,无血清培养基对bmsc补充道。培养24小时后,上层清液吸气到50毫升离心管并受梯度离心(300 g, 10分钟;2000克,10分钟;10000克,30分钟)在4°C。上层清液被转移到一个外来体提取离心器管和受到离心(100000克,70分钟)。上层清液被丢弃,沉积物被PBS和受到离心(100000克,70分钟)。150年resuspended液μl PBS和与透射电子显微镜如前所述36]。
2.3。CD4+T细胞的分离和纯化
CD4+从脾脏T细胞分离使用磁激活细胞分选(mac)。短暂,脾细胞悬液是通过研磨组织。溶菌作用后,细胞在PBE resuspended缓冲区。Anti-CD4磁珠(Miltenyi)被用来分离CD4+T细胞后,制造商的协议。
2.4。流式细胞术
流式细胞术分析来确定Treg CD4细胞的百分比+T细胞。与FOXP3 Treg细胞用流式细胞术+作为标记。简单,细胞首先沾anti-CD4-FITC (ab218745 Abcam) anti-CD25-PE (ab210334 Abcam)和anti-FOXP3-APC (ab200568 Abcam)抗体。荧光信号测量的流式细胞仪Fortessa系统(BD)。
2.5。细胞转染
细胞转染和mir - 181 a抑制剂(5′-ACUCACCGACAGCGUUGAAUGUU-3′)和mir - 181数控(5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′)使用Lipofectamine 2000试剂(英杰公司)根据制造商的指示。
2.6。反向Transcription-Quantitative (RT-q) PCR分析
RT-qPCR被用来检查mir - 181 a的表达。总RNA分离使用试剂盒试剂(R0016 Beyotime),和1μg为互补脱氧核糖核酸合成RNA被用作模板使用上标三世RT(18080093,英杰公司)。本研究中使用的引物如下:mir - 181 a - 5 - p正向引物:5′-CGGCAACATTCAACGCTGT-3′和反向引物:5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′;U6正向引物:5′-CTTCGGCAGCACATATAC-3′和反向引物:5′-GAACGCTTCACGAATTTGC-3′。RT-qPCR在95°C执行3分钟,5 s 95°C, 56为10°C, 75°C 25 s(39周期),5 s的65°C, 50年代的95°C。
2.7。西方墨点法
总蛋白提取里帕裂解缓冲(Beyotime P0013B)和蛋白质测定的浓度BCA试剂盒(Beyotime P0012)。等量的蛋白质溶解产物被装载在一个钠十二烷基sulfonate-polyacrylamide凝胶(sds - page)和转移到聚偏二氟乙烯膜。膜被5%的脱脂牛奶和孵化与抗体在4°C。主要的抗体使用如下:anti-CD81(1: 1000年,细胞信号技术,56039),anti-CD63(1: 1000年,Abcam ab68418) anti-CD9(1: 1000年,Abcam ab223052) anti-SIRT1(1: 1000年,Abcam ab263965)和anti-FOXP3(1: 2000年,Abcam ab10901)。GAPDH是用作加载控制。然后,辣根过氧化物酶(合)标记的第二抗体被用于检测特定的蛋白质。
2.8。免疫沉淀反应
FOXP3的乙酰化作用是检测使用IP包(Absin abs955-50测试)根据制造商的指示。短暂,收集细胞被洗PBS和细胞溶解和IP在冰上裂解缓冲5分钟。细胞刮板和转移到一个微型离心机管。超声波中断3次后,细胞受到离心(14000 g, 10分钟)在4°C,和上层清液(细胞溶解产物)被转移到一个新管。细胞溶解产物(200 - 1000µg总蛋白)与anti-FOXP3混合抗体。在4°C隔夜孵化后,蛋白质A / G +琼脂糖添加到样本和孵化旋转在4°C 2小时。混合物在12000 g离心1分钟保留沉淀,它是用洗缓冲区。FOXP3的乙酰化作用是由西方墨点法与antiacetylated-lysine抗体(细胞信号技术,9941)和anti-FOXP3抗体(Abcam ab10901)。
2.9。荧光素酶报告实验
野外(WT)或突变体(傻瓜)类型的3′utr SIRT1的插入pGL3子向量(Promega E1761)。SIRT1 WT或SIRT1的傻瓜和mir - 181控制或mir - 181——模仿被转染进hek - 293 t细胞(Procell, cl - 0005)。荧光素酶活动被Dual-Luciferase记者分析测量系统。
2.10。统计分析
所有的数据提出了均值±SD表示至少三个独立的实验,与学生进行测试t以及差异。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。描述的bmsc和BMSC-Derived液囊
我们首次发现bmsc通过检测CD34和CD44的表面标记细胞(图1(一))。液源自msc和透射电子显微镜(图确定1 (b))。免疫印迹结果表明,外来体标记CD9、CD63,研究液明显高于BMSC溶解产物(图1 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.2。mir - 181 a是高度表达BMSC-Derived液
确定mir - 181 a的表达BMSC-derived液囊,我们第一次执行RT-qPCR发现mir - 181的表达BMSC-derived液和BMSC溶解产物。如图2(一个),mir - 181 a的表达调节BMSC-derived液囊。此外,后coculturing BMSC-derived液囊,mir - 181 - CD4的表达增加+细胞(图2 (b))。
(一)
(b)
3.3。BMSC-Derived外来体mir - 181治疗触发效应T细胞转化为具体+表达亚群
我们下一个确定的角色MSC-derived外来体mir - 181 a (bmsc -外mir - 181 - a)在CD4的刺激+CD25+FOXP3+Treg细胞。CD4+细胞治疗与bmsc外mir - 181 a,和CD4的频率+CD25+FOXP3+分析了Treg细胞流式细胞术。如图3(一个),CD4的频率+CD25+FOXP3+BMSC Treg细胞外mir - 181治疗组高于BMSC溶解产物治疗组。
(一)
(b)
(c)
我们下一个撞倒mir - 181 a mir - 181 a抑制剂转染到bmsc和隔离液击倒bmsc。mir - 181 a的表达在液源自mir - 181 a inhibitor-transfected bmsc测量(图3 (b))。抑制mir - 181 a后,液不再增加CD4的频率+CD25+FOXP3+Treg细胞(图3 (c))。这些结果显示bmsc的功能——外维持CD4的mir - 181 a+CD25+FOXP3+Treg细胞。
3.4。BMSC-Derived Exosomal mir - 181 a调节FOXP3通过SIRT1-Mediated乙酰化作用
microrna以前报道调节目标基因通过绑定3′utr。基于生物信息学分析,mir - 181 a可以直接目标脱乙酰酶,SIRT1(图4(一))。根据dual-luciferase记者分析,mir - 181 a和SIRT1之间的关系(图4 (b))。bmsc外mir - 181后治疗,SIRT1在CD4的表达+细胞减少(图4 (c))。抑制mir - 181 a获救SIRT1表达式(图4 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
越来越多的证据表明,SIRT1调节FOXP3表达通过蛋白脱乙酰作用。在这里,我们发现FOXP3 CD4和乙酰化水平+细胞治疗bmsc外mir - 181 a。bmsc外mir - 181提升FOXP3和乙酰化作用(数字4 (c)和4 (e))。mir - 181 a减少FOXP3的抑制和乙酰化水平(数字4 (d)和4 (f))。
4所示。讨论
这里,我们展示的影响液源自骨髓间充质干细胞(bmsc)免疫抑制的监管。我们的研究结果表明,BMSC-derived液能引起CD4的变换+T细胞CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞。CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞发挥关键作用的攻击性疾病和癌症通过调节免疫应答。近年来,随着研究的进步,CD4细胞的调控机制+CD25+Foxp3+Treg细胞控制自身免疫和维持免疫耐受的过程中逐渐理解(37,38]。
在我们的研究中,证明了mir - 181 a是高度表达BMSC-derived液,mir - 181 a, mir - 181 b, mir - 181 c和mir - 181 d共同形成了mir - 181家庭,这是一个最丰富的microrna在淋巴组织(39]。mir - 181 a B细胞发展中扮演一个重要的角色在骨髓40,41和免疫功能42]。我们发现mir - 181——可以由CD4细胞内化+细胞和CD4 mir - 181 a+细胞SIRT1的直接目标。SIRT1是一个调节蛋白表达的蛋白脱乙酰酶通过脱乙酰作用。microrna的监管机制和宿主细胞蛋白表达是很重要的。研究表明,丙肝病毒损害通过mir - 181 a - T细胞反应介导DUSP6 shp表达式(43]。mir - 181 a不仅调节T细胞与响应相关的蛋白质,而且平衡免疫介导的病毒清除炎性损伤和提高免疫耐受(44]。这项研究表明,mir - 181 -与SIRT1的关系有一个目标,一个脱乙酰酶,调节蛋白表达。在未来的研究中,蛋白质与mir - 181 a,角色在免疫耐受的过程中可以进一步研究,可以探索和相关机制。我们的研究结果表明,SIRT1的抑制增强FOXP3活动增加乙酰化水平。此外,我们的研究结果表明,BMSC-derived液CD4触发+CD25+FOXP3+Treg细胞通过mir - 181 a / SIRT1-mediated FOXP3乙酰化作用。
总的来说,我们的数据表明,液从骨髓间充质干细胞(bmsc)诱导CD4的变换+T细胞CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞。mir - 181 a是优先表达液源自骨髓间充质干细胞,可以转移到CD4细胞+T细胞。mir - 181 - CD4 SIRT1的直接目标+T细胞,减少SIRT1的表达式。抑制SIRT1增强FOXP3表达FOXP3的促进乙酰化作用。我们发现bmSC-derived液携带mir - 181 a诱导CD4的生产+CD25+FOXP3+Treg细胞通过调节FOXP3的表达。此外,我们发现exosomal mir - 181 a的机制提高FOXP3表达通过sirT1-catalyzed乙酰化作用。本研究的一个限制是,我们没有验证这种机制在体内。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Renyong王先生和李瑞雪的贡献同样目前的工作。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(81460132)和云南Packnrovincial科学部门,Technology-Kunming医科大学联合应用基础研究专项基金项目(2018 fe001(-224)),和云南Hepatobiliary-pancreatic疾病临床医学中心。