文摘

MFAP2报道发挥致癌作用的几种类型的人类癌症。然而,MFAP2在各种癌症的表达谱及其对预后的影响和免疫渗透仍不明朗。在这项研究中,MFAP2 mRNA表达和蛋白表达的正常组织,肿瘤细胞系和33个恶性肿瘤组织进行分析综合使用Genotype-Tissue表达式(GTEx),癌症细胞系百科全书(CCLE)和癌症基因组图谱(TCGA) Oncomine UALCAN数据库,MFAP2的表达在不同等级和阶段的癌症被评估使用基因表达分析交互式分析2 (GEPIA2)和肿瘤与免疫系统相互作用数据库(TISIDB)。一般来说,MFAP2显示不同的表达在大多数肿瘤和正常组织,与更高的肿瘤分级密切相关,较高的肿瘤阶段,和穷人生存在多种癌症。UALCAN数据库的搜索和cBioPortal数据库显示,这种差异在mRNA水平表达可以部分归因于异常的DNA甲基化和基因突变的水平。此外,MFAP2表达也与肿瘤相关的突变负担,微卫星不稳定性,neoantigens不同的癌症类型。更重要的是,计时器和TISIDB数据库还显示,MFAP2水平显著相关免疫渗透丰富和免疫相关基因标记,以及估计的分数。由qPCR MFAP2表达四种肿瘤组织样本进行验证。本研究结合几个数据库和执行pan-cancer表达谱的分析,甲基化,和突变MFAP2及其对预后的影响和免疫渗透,这表明MFAP2可能导致恶性许多肿瘤的性质。MFAP2可能与预后价值和一个重要的生物标志物有潜力成为肿瘤免疫治疗的目标。

1。介绍

免疫疗法被认为是一种很有前途的治疗癌症(1]。然而,由于肿瘤的异质性,只有10 - 20%的人口可以受益于当前免疫疗法(2,3]。例如,anti-CTLA4在胃癌(可怜的临床疗效4]。Anti-PD-1和anti-PD-L1部分响应在进步的结肠直肠癌5]。随着高通量测序技术的发展,向公众提供丰富的数据,例如,TCGA数据库包含33个肿瘤转录组数据。是可能的和必要的执行pan-cancer分析基因和评估与临床预后的相关性和免疫渗透(6]。迫切需要新的生物标记物预测预后和寻找新的免疫细胞的治疗目标。

MFAP2由183年与2 -氨基酸蛋白质域(7]。MFAP2以两种形式存在。一个是细胞外MFAP2,纤维蛋白的蛋白结合,第六胶原蛋白,弹性蛋白原,脱去蛋白质,biglycan14。另一种是细胞内蛋白质,这是一种功能性蛋白上调下游基因与细胞粘附、运动,矩阵重构。在过去的十年中,异常的表情MFAP2被发现在各种恶性肿瘤。MFAP2是在黑色素瘤的能力操纵EMT-related蛋白质和Wnt /β连环蛋白途径提高黑色素瘤侵袭和迁移能力(8]。Upregulation MFAP2胃癌被发现,其中MFAP2加速癌细胞迁移通过MFAP2 /整合素α5β1 / FAK / ERK通路(9,10]。在激活TGF MFAP2——的能力β/ SMAD2/3通路在胃癌也被报道,这激活加速转型的胃癌上皮细胞表型间质表型(11]。以前的研究已经指出,MFAP2拥有hyperaffinity TGF -β总科成员在脂肪组织12- - - - - -14]。

然而,没有pan-cancer研究MFAP2和各种癌症之间的关系。这里,我们检索多个数据库、GTEx CCLE, Oncomine, TCGA, UALCAN, GEPIA2 TISIDB,分析MFAP2表达pan-cancer及其与预后的关系。此外,我们探讨MFAP2表达与基因突变的关系,启动子甲基化,肿瘤neoantigens肿瘤突变负担(三甲)、微卫星不稳定性(MSI),错配修复(MMR)基因和免疫渗透。我们的研究结果表明,异常表达MFAP2与它的启动子甲基化改变,免疫渗透肿瘤微环境的影响,也充当了各种癌症的预后危险因素。本研究将提供一个理论依据的洞察MFAP2在肿瘤免疫治疗中的作用。

2。材料和方法

2.1。基因表达分析

我们下载了规范化pan-cancer TCGA数据集和GTEx UCSC的数据库,提取MFAP2基因的表达数据在每个样本,并进一步改变每个表达式值作为log2 (x + 1)。MFAP2表达式在33个癌症。此外,肿瘤细胞每一行的数据也从CCLE下载数据库,并分析了MFAP2的表达水平在21个肿瘤细胞系。数据分析使用RStudio版本1.1.456(美国RStudio Inc .)和R包ggpubr。此外,MFAP2基因的表达水平在不同的癌症被确定在Oncomine数据库(15),的阈值p值= 0.05,褶皱变化= 2,和基因等级=。MFAP2蛋白表达在UALCAN调查数据库,我们提供一个平台为蛋白表达分析癌症临床蛋白质组学分析联盟数据集(16]。最后,我们探讨了MFAP2表达式的不同病理阶段和成绩,TCGA肿瘤通过GEPIA2和TISIDB数据库。

2.2。预后分析

我们首先分析MFAP2表达式之间的关系在33肿瘤和总生存期(OS)使用,TCGA数据并与森林可视化情节使用单变量Cox回归分析。进一步的kaplan - meier曲线绘制显示MFAP2的预后意义。考虑在后续non-tumor-related死亡的可能性,我们分析了MFAP2表达之间的关系,针对疾病的生存(DSS),无病间隔(DFI)和无进展时间间隔(PFI) 33 TCGA肿瘤。

2.3。基因变化分析

在网站上cBioPortal [17),我们选择“TCGA锅癌症图谱研究”的数据集。MFAP2突变和拷贝数的调查,和MFAP2突变网站显示在地图和三维结构示意图。

所有样本的三甲和MSI分数决定TCGA从体细胞突变数据下载,MFAP2表达之间的相关性和三甲MSI是评估使用斯皮尔曼等级相关系数。肿瘤neoantigens在每个肿瘤样本的数量计算及其与MFAP2表达式的关系进行了分析。此外,TCGA表达谱数据被用来分析MMR基因的表达,包括MutL同源基因(一种),傻瓜同源基因(MSH2) MSH6,增加分离后减数分裂(PMS2)和上皮细胞粘附分子(EPCAM)在不同的肿瘤。MFAP2和MMR基因之间的相关性是热图使用Reshape2和可视化RColorBrewer包。

2.4。DNA甲基化分析

UALCAN数据库被用来显示MFAP2的甲基化水平在不同的肿瘤和相应的正常组织。此外,我们分析了相关性MFAP2表达和四甲基转移酶的表达,包括DNMT1 DNMT2种能阻碍DNMT3B DNMT3A,。

2.5。免疫渗滤分析

我们使用TISIDB数据库和计时器,微环境细胞群(MCP)计数器和伊势亚算法探索MFAP2表达和免疫之间的关系渗透在所有TCGA肿瘤。我们分析了基质、免疫和估计分数每个肿瘤的示例使用估计的包和可视化这些分数之间的关系和MFAP2表达式使用散点图。此外,我们调查的相关性MFAP2表达单核细胞和巨噬细胞生物标志物使用计时器数据库。此外,我们执行MFAP2斯皮尔曼相关分析和免疫相关基因,包括immunoinhibitors immunostimulators,主要组织相容性复合体(MHC)基因,趋化因子,趋化因子受体,和免疫分子检查点。终于获得所有数据可视化热图或散点图。

2.6。肿瘤组织集合

BLCA, BRCA HNSC, KICH收集组织和正常组织5例,分别。他们立即保存在液氮和保持在-80°C。伦理委员会批准的这项研究是山东省的青岛市立医院后,进行了《赫尔辛基宣言》。

2.7。定量实时聚合酶链反应(qPCR)

从组织总RNA提取使用试剂盒试剂(表达载体,热费希尔科学、上海、中国)和reverse-transcribed cDNA利用cDNA逆转录工具包(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。qPCR执行使用SYBR预混料交货Taq II工具包(RR820,豆类,大连,中国),与GAPDH作为内部参考。的相对表达MFAP2计算使用2^−ΔΔCt方法。表中列出使用的引物1。

2.8。统计分析

数据分析使用R4.0.2软件和GraphPad 9.0.0和用平均数±标准差表示。差异分析t以及,p被认为具有统计显著性值小于0.05。

3所示。结果

3.1。MFAP2表达式在癌症

我们首先研究了MFAP2的表达水平在正常组织通过GTEx数据集。如图1(一),MFAP2表达水平最高的子宫颈组织和最低的血液和骨髓组织。同时,MFAP2表达式的基础水平在不同肿瘤细胞系进行了评估。如图1 (b),MFAP2表示骨骼细胞系和最高水平的血液、淋巴细胞系的最低水平。

确定MFAP2的微分表达式,Oncomine数据库被用来分析MFAP2 mRNA水平在不同的肿瘤和相应的正常组织。这一分析表明,与正常组织相比,MFAP2表达式在膀胱癌更高,大脑和中枢神经系统(CNS)癌症、乳腺癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、头颈部癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌和肉瘤。在一些数据集的肝癌和前列腺癌,没有观察到的差异表达。此外,MFAP2表达模棱两可的肾癌,白血病,肺癌的数据集;参见图2(一个)。表2总结了MFAP2表达式在各种癌症的细节。进一步评估MFAP2的表达在人类癌症,我们综合从所有TCGA肿瘤和GTEx转录组数据。TCGA MFAP2表达式所得数据在数据库和综合TCGA GTEx +数据库中的数据在图所示2 (b)和图2 (c),分别。考虑到个体差异,我们进一步评估MFAP2表达式在成对样品图2 (d)。结果表明,MFAP2 BLCA更高,BRCA,胆固醇,COAD,光电子能谱,HNSC, LIHC, LUAD, LUSC,阅读,STAD, THCA,比邻近的正常组织和UCEC KICH显著降低,KIRC, KIRP,马比相邻正常组织。没有MFAP2 PAAD表达差异,这可能是由于小样本大小。此外,MFAP2蛋白表达升高乳腺癌,结肠癌,肺腺癌,透明细胞肾细胞癌减少;参见图2 (e)。

根据进一步分析MFAP2 mRNA表达水平和癌症之间的关系或年级阶段,结果表明,MFAP2呈正相关,先进BLCA阶段GEPIA2和TISIDB(见图3(一个)和3 (b)),和TISIDB数据库MFAP2呈正相关,先进的塞斯克,KIRC, LGG, LIHC成绩(见图3 (c))。

3.2。在癌症MFAP2预后价值

探讨MFAP2表达水平与预后之间的关系发展类金融机构而言,决策支持系统,操作系统,和PFI,我们为每个癌症(图描述森林的阴谋4)。COX比例风险模型分析表明,高表达的MFAP2与贫穷有关DFI ACC, BRCA,塞斯克,胆固醇,OV和PAAD(图4(一)),较差的DSS ACC, BRCA塞斯克,胆固醇,KIRC, LGG LIHC,不仅(图4 (b)差的),操作系统对ACC, BRCA塞斯克,KIRC, LGG LIHC,不仅(图4 (c)),和穷人PFI ACC, BLCA BRCA,塞斯克,KICH, KIRC LGG,不仅(图4 (d))。有趣的是,MFAP2 UVM表达水平与更好的监测系统,操作系统,和PFI。

3.3。MFAP2突变概要

基因突变与肿瘤发生密切相关。所以我们使用cBioPortal数据库分析基因组改变TCGA pan-cancer MFAP2的数据集,包括10967年的32个样本研究。结果表明,胆管癌患者深删除作为唯一的突变类型MFAP2改变频率最高,超过5%。此外,放大是唯一类型的子宫的MFAP2突变癌肉瘤样本,突变频率超过3%(图5(一个))。图5 (b)表明,氨基酸0到183之间,共有29 MFAP2突变网站,包括27个错义和2拼接,发现,错义DNA改变的主要类型。其中,F157 L ShKr蛋白质域的最常见的突变的网站,发现在子宫内膜癌2例。此外,MFAP2突变网站进一步展示3 d结构如图5 (c)。此外,我们发现MFAP2表达独立的突变(图5 (d)图()和独立的DNA复制变异5 (e))。

3.4。MFAP2异常的DNA甲基化

基因组变化分析表明,改变MFAP2表达可能不是由于基因变异。然后又介绍了表观遗传疾病的MFAP2癌症。如图6(一)4,我们发现肿瘤MFAP2高表达,包括BLCA BRCA, COAD, UCEC,表现出MFAP2 DNA甲基化水平降低。KIRP MFAP2甲基化水平降低,无法解释MFAP2 mRNA的表达。此外,两个较低的肿瘤MFAP2表达式,包括KIRC和马,表现出MFAP2 DNA甲基化水平的提升。甲基化水平的MFAP2 LIHC和LUAD升高,这无法解释MFAP2 mRNA表达升高。然后,我们评估MFAP2表达式和四甲基转移酶之间的关系,包括DNMT1 DNMT2种能阻碍DNMT3B DNMT3A,。如图6 (b),MFAP2表达呈正相关,一些四甲基转移酶在绝大多数的33个肿瘤。

3.5。肿瘤Neoantigen三甲,MSI和MMRs

肿瘤neoantigens新异常蛋白质编码突变基因在肿瘤细胞中,作为抗原激活T细胞。这里我们清点的数量分别为每个肿瘤样本neoantigens和分析MFAP2表达和抗原数量之间的关系。结果表明,MFAP2表达与肿瘤neoantigen UCEC负相关(图7(一))。三甲,通常随着体细胞数量的测量产生的突变发生在平均1 Mb基地的编码区其实地区,反映了肿瘤细胞中突变的数量(18]。斯皮尔曼等级相关分析表明,MFAP2表达呈正相关,在COAD三甲,STAD, UCEC,虽然它是负相关DLBC三甲,LGG,马,不仅,SKCM, THCA如图7 (b)。MSI是指长度变化的微卫星由于插入或删除一个重复单位的肿瘤与正常组织相比,产生一个新的微卫星等位基因(19]。用斯皮尔曼等级相关分析,MFAP2表达呈正相关,在COAD三甲,LGG,内消旋,STAD,虽然它是负相关BLCA三甲,BRCA, HNSC, LIHC,阅读,不仅,SKCM THCA, THYM(图7 (c))。MSI和高三甲从MMR不足可能导致20.]。如图7 (d),MFAP2表达呈正相关,一种MSH2, MSH6, PMS2,和EPCAM各种肿瘤,虽然在GBM EPCAM呈负相关,LGG, THYM。

3.6。免疫渗滤分析

肿瘤浸润淋巴细胞,肿瘤微环境的重要组成部分,起着关键作用在致癌作用21,22]。因此,我们分析了MFAP2各种免疫细胞的相互作用渗透在多个TCGA的癌症通过搜索计时器和TISIDB数据库或MCP和伊势亚算法。计时器数据库中,结果表明,在BLCA, BRCA,和LGG MFAP2强烈表达相关与免疫渗透水平,水平显著正相关,渗透的B细胞、CD4 + T细胞、CD8 + T细胞,树突状细胞,巨噬细胞和中性粒细胞(图8(一个))。每种类型的癌症的详细相关补充图所示1。此外,其他算法也进行评估的相关性。MFAP2表达与免疫渗透在癌症的相关性也分析了TISIDB数据库(图8 (b))。MCP分析(图8 (c)(图)和伊势亚分析8 (d))也被执行分析的相关性,分别。有趣的是,我们发现大多数单核细胞的表达水平,tam, M1, M2巨噬细胞标记和BLCA MFAP2表达水平呈正相关,COAD,光电子能谱,HNSC-HPV, KICH, LGG, LIHC, PAAD,马,阅读,STAD THCA, THYM(图8 (e)),这表明MFAP2可能调节巨噬细胞极化在上述肿瘤。

越来越多的报道表明一个重要的角色的肿瘤免疫微环境在肿瘤发展23,24]。我们分析每个肿瘤的免疫和基质成绩样本使用R包估计观察MFAP2表达式之间的关系在33肿瘤和StromalScore ImmuneScore和ESTIMATEScore(补充图2)。

MFAP2 BLCA表达式,BRCA、HNSC KICH组织被qPCR显示。

的表达MFAP2终于检查qPCR BLCA, BRCA, HNSC, KICH组织样本和相应的正常组织样本。因此,qPCR表明MFAP2 KICH组织中表达明显低于在正常组织,虽然明显高于其他三个肿瘤(图9)。

4所示。讨论

MFAP2细胞外弹性超细纤维是一个重要的组成部分,与和影响纤维蛋白。这也是大多数脊椎动物的组成型蛋白质微纤维(25]。MFAP2代表的特点是其工作能力与TGF -β家庭生长因子,切口,切口配体,以及各种弹性蛋白(26]。MFAP2基因的突变可能表明血栓形成,胸动脉瘤、新陈代谢疾病,骨质缺乏在人类27]。研究表明,MFAP2胃癌组织中高度表达,和其高表达的整体和无病生存率显著相关胃癌患者(7]。此外,MFAP2 TGF -发现一个可能的球员β/ SMAD2/3信号通路激活促进增殖,迁移,入侵,epithelial-mesenchymal过渡的胃癌细胞(11]。一项研究指出,MFAP2是小说microRNA-29目标,和miR-29 / MFAP2 /整合素α5β1 / FAK / ERK1/2可能是胃癌进展的一个重要致癌途径(10]。另一项研究也表明MFAP2在肝癌的相关性,即MFAP2超表达在肝癌与癌症分期有关,可怜的操作系统,和针对疾病的生存9,26]。的差别一个体外实验表明,对这些MFAP2抑制肝癌细胞的增殖和迁移水平。此外,转录因子、DNA甲基转移酶和免疫因素在肝癌可能与MFAP2并加速肿瘤进展(27]。

在这项研究中,我们发现MFAP2表现出不同的表达水平在不同的组织和细胞。分析基于Oncomine, TCGA、GTEx和UALCAN数据库显示,MFAP2 mRNA和蛋白异常表达在多种肿瘤。然而,这种异常表达并不与基因突变有关,在一定程度上影响了其启动子甲基化。此外,MFAP2明显的表达与病理阶段,年级,和许多癌症的预后,表明MFAP2发挥了致癌基因的作用在许多肿瘤。此外,MFAP2表达也与DNA甲基转移酶,三甲,MSI, MMR-related基因。异常的DNA甲基化过程中常见癌症恶化[28]。麻疹是一种胞内MMR机制,关键基因功能的丧失可能会导致不可挽回的DNA复制错误,最终提高体细胞突变(29日]。MFAP2和基因突变之间的关系进一步表明其重要性在肿瘤发生,尽管这些突变没有产生肿瘤neoantigens在大多数癌症。

结合多个算法,我们发现MFAP2密切相关免疫渗透在肿瘤组织,不仅影响免疫细胞的比例,也许多免疫相关基因的表达水平,包括免疫检查点。其中,一种我跨膜蛋白的小鼠30.),最近被确定为一种很有前途的肿瘤免疫治疗的目标(31日),是值得注意的。大量研究表明,小鼠在各种肿瘤,包括白血病(32],乳腺癌[33),前列腺癌(34),和其他肿瘤,与病人预后差,强烈表达水平相关,可能参与肿瘤免疫逃避。此外,小鼠被证明能促进乳酸生产通过促进己糖激酶2表达,从而促进糖酵解和耐药性35]。小鼠也可能导致增加NF -κB活动和VEGF表达升高,进一步促进肿瘤相关血管生成和肿瘤入侵(36]。尽管不清楚潜在机制,MFAP2之间的相关性和小鼠的肿瘤表明MFAP2是一种很有前途的肿瘤免疫治疗的目标。在接下来的研究中,我们打算进一步验证MFAP2对肿瘤细胞增殖的影响,移民和入侵和探索的分子调控机制。

5。结论

总之,我们的第一个pan-cancer MFAP2建议MFAP2可能影响临床预后分析在各种癌症和免疫细胞渗透,这加深了理解MFAP2在肿瘤发生中的作用。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

补充材料

补充图1:MFAP2表达的相关性免疫渗透水平在不同类型的癌症在数据库计时器。补充图2:StromalScore (a), ImmuneScore (b),和ESTIMATEScore (c)进行分析评估的相关性MFAP2表达与免疫和肿瘤基质的比例。(补充材料)