文摘
背景。有几个以前的研究表明圆形rna (circRNAs)参与肿瘤发生的非小细胞肺癌(NSCLC)。然而,circRNA_0000520的角色(circ_0000520)这种疾病尚未研究。方法。circ_0000520、微rna (miR) -1258和AKT丝氨酸/苏氨酸激酶3 (AKT3) mRNA表达水平被qPCR检测。CCK-8、EdU和Transwell化验是利用检测非小细胞肺癌细胞的恶性生物学行为。目标之间的关系mir - 1258和AKT3 3′utr或circ_0000520验证通过dual-luciferase报告基因分析。免疫印迹后被用来测量AKT3表达式circ_0000520和mir - 1258被选择性地监管。结果。circ_0000520在NSCLC调节。高度circ_0000520表达与非小细胞肺癌病人的先进的TNM阶段和淋巴结转移。circ_0000520超表达促进NSCLC细胞生长、迁移和入侵。mir - 1258被认定为下游circ_0000520的目标。mir - 1258超表达减弱circ_0000520进行靶向治疗在非小细胞肺癌细胞的影响。mir - 1258针对性和抑制AKT3。circ_0000520积极监管AKT3骗取mir - 1258非小细胞肺癌细胞中表达。结论。circ_0000520上调AKT3通过竞争性绑定mir - 1258促进非小细胞肺癌的进展。
1。介绍
从全球来看,肺癌是癌症相关死亡的最大原因1]。非小细胞肺癌(NSCLC)占超过80%的肺癌病例(2]。目前,常见的治疗策略是手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗(3]。尽管最近改进的诊断和治疗策略,非小细胞肺癌患者的预后仍然是不良(4,5]。
在过去的几十年中,越来越多的非编码rna (ncRNAs)被发现和调查6,7]。与共价闭环结构,环状rna (circRNAs) 5′端帽和3′末端尾巴保利(a) (8]。circRNAs非常稳定,在组织中转录方式(9]。此外,circRNAs参与肿瘤发生和可以作为生物标记物(10]。据报道,在非小细胞肺癌和特异表达多个circRNAs可以促进或抑制非小细胞肺癌的进展。例如,circ_100395过度抑制非小细胞肺癌细胞的恶性肿瘤(11]。在NSCLC组织中,circ_POLA2高度表达和高circ_POLA2表达与非小细胞肺癌患者的不良预后相关(12]。circ_0000520在胃癌和乳房癌表达下调,可以作为一个新的生物标志物(13,14]。然而,circ_0000520在NSCLC肿瘤发生的功能需要进一步说明。
被称为高度保守的小ncRNAs,小分子核糖核酸(microrna)绑定到mRNA 3′utr导致信使rna降解或翻译抑制,从而调节转录后的基因表达(15]。许多microrna作为肿瘤抑制因子或致癌因素参与肿瘤发生、发展、复发和转移(16]。越来越多的研究表明,microrna参与NSCLC肿瘤发生和发展17- - - - - -21]。例如,mir - 451 a目标ATF2抑制非小细胞肺癌细胞的侵犯(20.]。在非小细胞肺癌组织和细胞,mir - 1258表达下调,抑制非小细胞肺癌进展通过GRB2 / Ras / Erk轴[22]。尽管如此,mir - 1258失调在非小细胞肺癌的机理尚未阐明。
目前工作调查circ_0000520随后的表达模式探索的确切作用circ_0000520 mir - 1258 / AKT丝氨酸/苏氨酸激酶3 (AKT3)监管轴在非小细胞肺癌。我们的工作扩大我们对非小细胞肺癌的发病机制的理解,提供疾病的潜在生物标志物。
2。材料和方法
2.1。道德的声明和患者组织
37对非小细胞肺癌患者手术切除的肿瘤的组织和para-tumorous组织在襄阳中心医院收集。所有的患者都接受了新辅助治疗。本研究进行了与每个病人的知情同意。目前工作的程序是向阳中心医院伦理委员会的批准。非小细胞肺癌患者的临床特征描述在表1。
2.2。细胞培养
从美国文化集合类型,非小细胞肺癌细胞系(NCI-H1299, A549, H460 NCI-H2106, H1975)和不灭的支气管上皮细胞(BEAS-2B)购买。所有的细胞在DMEM培养基培养(HyClone)与100 U /毫升青霉素和100年μg / ml链霉素(表达载体)和10%胎牛血清(的边后卫;σ),然后放在孵化器有限公司5%2在37°C。当细胞confluency增加到70 - 80%,0.25%胰蛋白酶(罗氏)用于亚文化。GenePharma的提供者circ_0000520超表达质粒(pcDNA3.1-circ _0000520),负控制质粒(pcDNA3.1-NC), mir - 1258模拟和控制(miR-NC)。Lipofectamine®3000(英杰公司)是用于使转染上述质粒和寡核苷酸A549和H460细胞。24小时后,细胞转染效率的决心通过定量实时聚合酶链反应(qPCR)。
2.3。qPCR
试剂盒试剂(英杰公司)采用隔离的总RNA。PrimeScript RT工具包(豆类)是用于逆转录。ABI 7900快速实时PCR系统(应用生物系统公司),qRT检测PCR进行利用SYBR绿色主人混合二世工具包(豆类)。采用的表达GAPDH正常化mRNA的表达水平和circ_0000520, microrna的表达是规范化和小RNA RNU6B (U6)。基因的相对表达是通过2量化的−ΔΔCT方法。检查表2序列的引物。
2.4。核质分离实验
巴黎™工具(ThermoFisher)申请执行核质分离实验。试剂盒法提取细胞质和核RNA,然后,qPCR进行检查circ_0000520表达式在细胞核和细胞质,分别。U6, GAPDH是亚细胞定位的控制。
2.5。细胞计数Kit-8 (CCK-8)测定
非小细胞肺癌细胞接种到96孔板(2×103细胞/)。然后,10μL CCK-8解决方案(MedChemExpress)补充到每个在不同的时间点,和细胞孵化37°C 2 h。终止的文化后,吸光度值测量的波长450 nm。
2.6。5公/乙炔基检测2′脱氧尿苷应承担(EdU)测定
一个EdU检测设备(RiboBio)是用于检测细胞增殖。H460 A549细胞培养24小时。然后细胞治疗50μ在37°C M EdU 2 h。接下来,营养液被丢弃,随后,A549和H460细胞和4%多聚甲醛固定为30分钟。接下来,0.5% Triton x - 100应用于提高渗透率,然后,A549和H460细胞孵化与阿波罗荧光染色反应30分钟解决方案在一个黑暗的地方。然后,15分钟的细胞被染色DAPI染色方案。最后,这些细胞被置于一个荧光显微镜(200)的放大(奥林巴斯)和EdU-positive细胞数。
2.7。Transwell化验
A549和H460细胞,与0.25%胰蛋白酶消化后,离心机,resuspended无血清培养基。基底膜基质(孔隙大小:8µm;1:10;BD生物科学)只是用于入侵检测。A549和H460细胞(5×104Transwell)被添加到前室,和10% FBS-containing DMEM加入室底部,和细胞培养24小时在37°C。随后,没有迁移的细胞被丢弃;的细胞迁移与4%多聚甲醛固定10分钟,随后沾0.5%结晶紫的解决方案。在倒置显微镜下(奥林巴斯),这些细胞被计算在内。
2.8。Dual-Luciferase报告基因分析
从Promega(麦迪逊),所有的荧光素酶记者向量circ_0000520突变(狗),circ_0000520野生型(WT) AKT3傻瓜,和AKT3 WT。接下来,circ_0000520 WT /狗或AKT3 WT /狗和mir - 1258模拟或其消极控制被co-transfected H460和A549细胞。荧光素酶活性测定在转染后48 h。
2.9。免疫印迹
转染细胞,细胞溶解里帕缓冲区(Beyotime)。离心后收集细胞上清液。上层清液是在100°C水浴加热10分钟变性的蛋白质。然后,蛋白质是由sds - page分离和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(微孔)。膜在室温下被5%的脱脂牛奶1 h和随后与Tris-buffered盐水冲洗Tween-20 (TBST)的3倍。随后,膜和初级抗体(anti-AKT3抗体(ab152157, 1: 1000年,Abcam)和anti-GAPDH抗体(ab245355, 1: 1000年,Abcam))在一夜之间被孵化在4°C。TBST清洗后膜和山羊anti-rabbit免疫球蛋白g h和l (ab205718, 1: 5000年,Abcam)在室温下培养1 h。GAPDH是内部控制。ECL化学发光工具包(Promega)是用于开发。
2.10。移植瘤实验
这个实验动物研究伦理审查委员会的支持襄阳中心医院。16个裸体小鼠(4周大,买了从武汉大学模式动物中心,武汉,中国)被随机分为两组(每组8老鼠)。随后,转染A549细胞分别接种到裸鼠的后面。三周后,小鼠牺牲安乐死和肿瘤的体积在两组比较。
2.11。统计分析技术
每个试验进行了一式三份,重复3次。采用SPSS21.0 (SPSS Inc .)统计分析数据。”x±年代”是用来表示数据。t以及和单向方差分析进行比较的方法2组,分别。确切概率法是利用分析的相关性circ_0000520表达与非小细胞肺癌患者的临床参数。皮尔森相关分析进行评估的相关性。统计学意义的差异 。
3所示。结果
3.1。在非小细胞肺癌组织和细胞,circ_0000520调节
通过微阵列数据的分析、数据集GSE158695,据透露,circ_0000520调节在NSCLC组织(图1(一))。也显示,而不是para-cancerous组织或人类支气管上皮细胞永生化(BEAS-2B) circ_0000520显著调节在非小细胞肺癌(数字1 (b)和1 (c))。此外,circ_0000520主要是位于细胞质(图1 (d))。评估的相关性37 NSCLC患者的临床病理特征与circ_0000520表达式,患者分为高(n= 18)和低(n= 19)表达式组。据透露,高circ_0000520表达与非小细胞肺癌患者的淋巴结转移密切相关(表和更高的TNM阶段1)。此外,高circ_0000520表达呈正相关,低患者的总体生存率(图1 (e))。
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3.2。circ_0000520在非小细胞肺癌细胞的超表达的影响
在非小细胞肺癌研究circ_0000520s作用,circ_0000520超表达质粒转染到A549和H460细胞(图2(a))。circ_0000520超表达明显增强A549和H460细胞生长(数字2(b)和2(c))。此外,circ_0000520超表达能够显著促进A549和H460细胞迁移和入侵(图2(d))。此外,在活的有机体内circ_0000520促进了增长的实验表明,高表达的肿瘤细胞移植到裸鼠实验(图2(e))。上述发现表明circ_0000520可能是一种癌基因在非小细胞肺癌的进展。
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3.3。circ_0000520吸附mir - 1258
接下来,我们搜查了CircInteractome在线网站预测circ_0000520s microrna潜在目标,并观察到有一个绑定序列circ_0000520和mir - 1258之间(图3(a))。mir - 1258的超表达明显压抑circ_0000520 WT H460的荧光素酶活性和A549细胞,且没有明显的影响,circ_0000520狗(图3(b))。接下来,qPCR表示,与para-cancerous组织或BEAS-2B细胞,mir - 1258表达underexpressed癌症组(数字3(c)和3(d))。值得注意的是,circ_0000520表达式和mir - 1258表达在组织样本(图中负相关3(e))。
(一)
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3.4。针对mir - 1258 Circ_0000520扮演了一个角色
接下来,“救援”实验进行。据透露,circ_0000520过度会抑制mir - 1258表达H460和A549细胞,而转染mir - 1258模拟将彻底改变这种影响(图4(a))。因此,外源表达mir - 1258模拟明显减少过度的促进作用circ_0000520 A549和H460细胞(数字4(b) -4(e))。
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3.5。circ_0000520调节AKT3表达被压抑mir - 1258在非小细胞肺癌细胞
mir - 1258的下游靶基因预测利用TargetScan数据库,它是显示AKT3 mir - 1258(图的结合位点5(a))。过度的mir - 1258抑制AKT3 WT的荧光素酶活性(图5(b))。接下来,我们发现移植circ_0000520促进了AKT3蛋白表达,而移植mir - 1258可以减少这种影响(数据5(c)和5(d))。此外,AKT3 mRNA表达明显升高在非小细胞肺癌(图5(e))。mir - 1258和AKT3 mRNA的表达水平负相关(见图5(f))和AKT3 mRNA和circ_0000520表达正相关(图5(g))。与BEAS-2B细胞,AKT3 mRNA表达增强在非小细胞肺癌细胞株(图5(h))。
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(h)
4所示。讨论
越来越多的证据表明,circRNAs的表达特征与患者的不良临床参数密切相关,和circRNA失调通常促进不同的恶性行为(23,24]。例如,在非小细胞肺癌,circ_100395 underexpressed, circ_100395过度压制非小细胞肺癌细胞的恶性肿瘤(25]。circ-ACACA调节在非小细胞肺癌和推倒circ-ACACA抑制非小细胞肺癌发展骗取mir - 1183和调节PI3K / PKB轴(26]。本研究报告,circ_000052由circRNA微阵列分析在非小细胞肺癌特异表达。此外,它推出了高circ_0000520表达与非小细胞肺癌患者的不良预后相关。此外,我们观察到circ_0000520增加非小细胞肺癌细胞的恶性肿瘤。总而言之,上述证据表明circ_0000520可能作为癌基因在非小细胞肺癌。
mir - 1258在肿瘤发生的作用近年来已被广泛报道(27,28]。在乳腺癌细胞中,mir - 1258表达减少和mir - 1258可以下调表达E2F1 [29日]。在宫颈癌细胞,mir - 1258表达下调,它能抑制肿瘤细胞的恶性生物学行为调节E2F1 / P53信号(30.]。circRNAs可以作为microrna海绵在许多癌症31日,32]。例如,circ_0000326加速肺腺癌进展通过骗取mir - 338 - 3 - p (33]。circ_0046264抑制肺癌细胞的恶性肿瘤,mir - 1245 / BRCA2轴(34]。这项研究显示,circ_0000520可以在非小细胞肺癌细胞海绵mir - 1258。此外,mir - 1258 upregulation逆转的促销影响circ_0000520超表达对非小细胞肺癌细胞的恶性肿瘤,建议circ_0000520可能调节通过骗取mir - 1258非小细胞肺癌的发展。先前的研究已经报道,一些microrna目标microrna circ_0000520,如mir - 512 - 5 - p, mir - 1296, mir - 556 - 5 - p,等等(35- - - - - -37]。我们的研究还发现了一个新下游microrna circ_0000520和mir - 1258的目标。
称为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,AKT3关键在调节细胞增殖、分化、凋亡、迁移(38]。AKT3异常表达在各种癌症和癌症恶化的影响。例如,在乳头状甲状腺癌组织和细胞,AKT3表达升高;mir - 203压制乳头状甲状腺癌的恶性肿瘤细胞表达下调AKT3 [39]。有一项研究显示,AKT3能促进前列腺癌细胞扩散通过调节Akt, b - raf, TSC1 / TSC2 [40]。此外,mir - 217可以抑制非小细胞肺癌发展通过减少AKT3表达式(41]。这项研究显示,AKT3 mir - 1258的下游目标在非小细胞肺癌细胞。此外,AKT3表达式由circ_0000520调制/ mir - 1258轴。上述证据表明,circ_0000520调节通过调节mir - 1258 / AKT3 NSCLC发展轴。
总之,circ_0000520表达NSCLC升高,它能增强肿瘤细胞的恶性肿瘤。在机制方面,circ_0000520增加AKT3表达式通过吸收mir - 1258。这些发现可能为非小细胞肺癌的治疗提供创新理念。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
伦理批准
我们的研究是向阳中心医院伦理审查委员会的批准。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
局域网汉族人和杨Hanxue同样起到了推波助澜的作用。