文摘

lncRNA小核仁的RNA的功能和可能的机制宿主基因3 (SNHG3) GC尚未充分研究。我们的研究的目的是调查的角色SNHG3扩散,迁移和入侵GC细胞系。SNHG3的表情,mir - 326,捻GC9811-P GC RT-qPCR细胞系进行检测。进行免疫印迹检测蛋白水平的扭曲和EMT-related基因。荧光素酶报告基因分析和RNA免疫沉淀反应(RIP)分析证实之间的交互lncRNA SNHG3, mir - 326和扭曲。CCK-8和Transwell化验进行检测细胞增殖,入侵和迁移能力。结果表明,lncRNA SNHG3和捻GC细胞系中高度表达,而mir - 326表达程度低。此外,lncRNA SNHG3击倒或mir - 326超表达显著地抑制细胞增殖,迁移和入侵GC细胞系。此外,扭转过度可以扭转抑制lncRNA SNHG3击倒或mir - 326超表达在细胞增殖,迁移和入侵。总之,lncRNA SNHG3可以促进GC进程通过mir - 326 /扭轴,这可能提供一种新的诊断和预后的生物标志物GC。

1。介绍

胃癌是世界上(GC)是一种常见的恶性肿瘤(1]。GC的最常见原因幽门螺杆菌感染,占超过一半的发病率。其他公认的危险因素包括吸烟、饮食中摄入的泡菜,和肥胖的临床管理2]。GC的治疗主要包括手术、化疗、放疗、靶向治疗(3]。在全球范围,GC的整体效果相对较差,低于10%的五年存活率(4]。基于全面了解疾病的生物学基础,仍有迫切需要准确的药。长非编码RNA (lncRNA)超过200个核苷酸长度没有显著蛋白质编码潜力(5]。值得注意的是,积累的证据表明,lncRNA中扮演着重要的角色在人类恶性肿瘤(6]。SNHG3是一种新型的lncRNA,这可能与阿尔茨海默氏症和结肠直肠癌。例如,偏差lncRNAs可能成为致癌基因或肿瘤抑制基因在肝癌过程中7]。结果表明,小核仁的RNA的表达宿主基因3 (SNHG3)与恶性状态,预后相对较差。SNHG3被确认为一个竞争内源性RNA分子促进大肠癌的恶性进展(8]。异常的snhg3 upregulation卵巢癌预后不良和恶性进展密切相关(9]。线粒体蛋白质组学(执行的系统分析10]。LncRNA SNHG3也以其参与肝细胞癌的微通道,mir - 128 / CD151 SNHG3诱导上皮间充质转变的信号(EMT)。尽管SNHG3公认的致癌基因在一系列的人类癌症,GC SNHG3的机制仍然是难以捉摸的。

此外,我们试着去理解背后的基本分子机制lncRNA的致癌性。像lncRNA, microrna的已被广泛公认的癌症。mir - 326具有抗癌作用的各种恶性肿瘤和目标不同的基因在神经胶质瘤,子宫内膜癌,宫颈癌(11- - - - - -14]。然而,SNHG3之间的交互和mir - 326 GC尚未报道。据报道,mir - 326助手与骨转移、骨代谢的生化标记肺癌,并促进EMT-induced蜂窝肺腺癌浸润[15]。王等人报道,mir - 326是异常表达在非小细胞肺癌的转移和nonmetastasis组织,提供了实验依据探索非小细胞肺癌转移的机理和分子诊断和治疗(16]。这些结果表明,肿瘤抑制肺癌mir - 326的功能。我们目前的目标是调查mir - 326在GC的生物功能,探索其潜在机制。

扭曲、转录因子起着重要的作用在癌症的发展和进展。扭曲的upregulation EMT抑制钙粘蛋白的表达,表明捻晋升转移诱导EMT (17]。以前的调查表明某些microrna能调节捻度通过绑定捻度mRNA的表达水平(18,19]。先前的报道表明,mir - 326功能失调,各种肿瘤的发展。然而,mir - 326的功能和潜在机制表达GC尚未报道。在这项研究中,我们假设SNHG3可能促进肝癌进展通过瞄准mir - 326的表达。为了澄清这一问题,我们分析了分子的表达机制SNHG3记录GC。SNHG3在肿瘤生物学的潜在作用进行了研究。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和转染

人类永生的胃上皮细胞GES-1和人类胃癌细胞系HGC-27在DMEM培养基培养和GC9811-P含有10%的边后卫(美国GIBCO), 100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素(Solarbio,中国)。细胞培养中5%的股份有限公司₂在37°C。小干扰rna转染microrna的和,HGC-27 GC9811-P细胞six-well板是一式三份。根据制造商的程序,mir - 326模拟或核转染到GC细胞使用Lipofectamine 2000(美国表达载体)。

2.2。CCK-8化验

根据制造商的指示,在96孔板的细胞培养密度为2×10³细胞/。细胞培养在37°C 24、48和72小时在含有5%孵化器有限公司₂。在不同的时间点,10μl CCK-8的解决方案是添加到每一个毛孔都在37°C和培养另一个2小时。450纳米的吸光度被记录。

2.3。Transwell分析

确定是由使用聚碳酸酯过滤器(8μ米孔)。microrna的转染20小时后,细胞被收集和5×10⁴细胞在200年μl 0.1%血清中被安置在参议院。众议院10%胎牛血清的培养基。孵化后24小时并消除滤波器的细胞在参议院的棉签,细胞低于0.1%和4%多聚甲醛固定和染色在20%乙醇结晶紫,和五个相衬显微镜被随机观察的视野。监测移植细胞是由拍摄400×放大ICA显微镜。确定进行了一式三份。

2.4。双荧光素酶活性测定

上海基因制药有限公司(上海,中国)合成和证实了荧光素酶记者向量pGL3-TWIST-3′UTR野生型(WT)和pGL3-TWIST-3′UTR突变(狗)。GC细胞与pGL3-TWIST-3 cotransfected′UTR WT或pGL3-TWIST-3′UTR傻瓜和mir - 326模拟或2000年Lipofectamine数控。转染细胞转染后48小时收获,和荧光素酶活性检测dual-luciferase记者分析系统(德国Promega)根据制造商的指示。

2.5。把试验

RIP使用RIP工具分析(美国微孔)。HGC-27和GC9811-P细胞系细胞溶解和RIP溶解产物缓冲区。溶菌产物是孵化在RIP缓冲与磁珠结合Ago2或免疫球蛋白抗体(美国σ)在4°C。的表达lncRNA SNHG3 RT-qPCR mir - 326进行了分析。

2.6。定量实时聚合酶链反应

根据制造商的指示,从培养细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体)。被转录成RNA样本cDNA按照制造商的指示,总量为20μl .相同数量的cDNA样本被用作模板RT-qPCR检测曲折的表达水平。RT-qPCR进行了光周期实时PCR系统和SYBR绿色主人混合(豆类)。GAPDH是作为内生参考,每个样本标准化GAPDH内容。所有实验都是在重复,重复两次。2^−ΔΔCt方法是用来表达感应多个。

2.7。免疫印迹

西方墨点法进行10%十二烷基硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)。的细胞转染miR-NC转染或mir - 326.72小时后,收集和细胞溶解。蛋白质分离和转移到PVDF膜10% sds - page凝胶。然后,添加5%脱脂奶块特异性的连接。在黑暗孵化后1小时在室温下,兔子反扭多克隆抗体是添加1:200稀释。与PBS洗3次后,细胞膜是与相应的二次混合抗体室温1小时。EMT-related蛋白质,第一抗体用于根据特定的蛋白质。最后,加沙地带被清洗后化学发光在TBS可视化。

2.8。统计分析

每个实验重复三次。使用SPSS 15.0统计分析。Student-Newman-Keuls测试作为后续测试。 应该显示显著差异。

3所示。结果

3.1。LncRNA SNHG3和捻调节而mir - 326在HGC-27和GC9811-P细胞表达下调

首先,SNHG3, mir - 326和扭曲在GES-1发现,HGC-27, GC9811-P细胞系。结果表明,表达lncRNA SNHG3和捻HGC-27和GC9811-P细胞系高于对照组(数字1(一)- - - - - -1 (c))。然而,在HGC-27 mir - 326的表达和GC9811-P细胞株显然低于GES-1细胞系(图1 (d))。这些结果表明,不同寻常的表达lncRNA SNHG3, mir - 326,可能与GC的进步。

3.2。LncRNA SNHG3击倒或mir - 326超表达抑制细胞增殖,迁移和入侵HGC-27和GC9811-P细胞

为了研究功能lncRNA SNHG3和mir - 326 GC的发展,HGC-27和GC9811-P细胞系转染与si SNHG3 mir - 326模拟,分别或各自的数控序列。与siNC相比,的表达lncRNA SNHG3显然是减少细胞转染siSNHG3(图2(一个))。影响蛋白质含量的SNHG3 EMT-related蛋白质免疫印迹检测。结果表明,钙粘蛋白的表达明显增加,而N-cadherin和波形蛋白的表达降低(图2 (b))。此外,细胞迁移和入侵是有效减少HGC-27和GC9811-P细胞系转染siSNHG3(数字2 (c)和2 (d))。CCK-8试验表明,细胞增殖显著抑制细胞转染siSNHG3(数字2 (e)和2 (f))。

mir - 326表达明显增加了mir - 326模拟HGC-27和GC9811-P细胞系(图3(一个))。EMT-related蛋白的蛋白质含量和mir - 326细胞转染模拟(图中也检测到3 (b))。细胞迁移和入侵是有效地减少mir - 326模拟HGC-27和GC9811-P细胞系(数字3 (c)和3 (d))。HGC-27 CCK-8测定,细胞增殖和GC9811-P细胞系显著抑制了mir - 326模拟(数字3 (e)和3 (f))。

3.3。LncRNA SNHG3 mir - 326和负调控其表达

证实lncRNA,可以作为龙头,可以绑定到目标RNA转录microrna并释放。为了探索的监管机制lncRNA SNHG3, starstarv3.0预测之间的目标站点lncRNA SNHG3和mir - 326(图4(一))。mir - 326的表达水平HGC-27 GC9811-P细胞系是调查RT-qPCR当lncRNA SNHG3被撞倒了。我们的研究表明,mir - 326的表达在HGC-27和GC9811-P细胞系转染siSNHG3显著增加(图4 (b))。因此,我们建议lncRNA SNHG3可以作为龙头、GC mir - 326的细胞。此外,我们用荧光素酶报告基因分析证实之间的直接交互lncRNA SNHG3和mir - 326。cotransfection后荧光酶报告向量(SNHG3-wt或SNHG3-mut)和mir - 326模拟或数控细胞系,我们发现HGC-27 GC9811-P细胞系,转染荧光酶的活动与SNHG3-wt和mir - 326模拟显著下降(图4 (c)和4 (d))。此外,为了进一步验证之间的交互lncRNA SNHG3 mir - 326, RIP与Ago2抗体进行了分析。我们发现SNHG3和mir - 326都富含Ago2沉淀在HGC-27和GC9811-P细胞提取物(数字4 (e)和4 (f))。总的来说,这些结果表明lncRNA SNHG3可以用作龙头直接绑定mir - 326和负调控其表达。

3.4。转折是mir - 326的目标和提升lncRNA SNHG3

进一步检测的分子调控机制lncRNA SNHG3和mir - 326进行了生物信息学分析探讨在GC mir - 326细胞的潜在目标。转折是预测mir - 326的主要目标基因,和目标站点被TargetScan预测(图5(一个))。为了证实的生物信息学预测,我们进行了荧光素酶报告基因检测。荧光素酶记者矢量(TWIST-wt或TWIST-mut)和mir - 326模拟或数控cotransfected HGC-27和GC9811-P细胞。与NC和TWIST-wt cotransfection相比,荧光素酶的活性细胞cotransfected TWIST-wt和mir - 326模拟显著下降(图5 (b)和5 (c))。此外,当细胞转染mir - 326或数控,捻度测定的表达。高表达的mir - 326有效地抑制扭HGC-27和GC9811-P细胞(数字5 (d)和5 (e))。这些数据证实,捻mir - 326的目标基因,mir - 326控制的消极。此外,我们发现cotransfection mir - 326缓蚀剂和siSNHG3反向siSNHG3加捻的抑制效应表达式(图5 (f))。

3.5。LncRNA SNHG3 mir - 326 /扭轴调节细胞增殖,迁移和入侵HGC-27和GC9811-P细胞

根据上述实验数据,我们推测,监管轴lncRNA snhg3 - mir - 326 -转折可能与GC的发展。如数据所示6(一)和6(b),结果表明,mir - 326超表达显著抑制HGC-27 GC9811-P细胞增殖,可部分逆转扭转过度。此外,si的抑制功能SNHG3 HGC-27和GC9811-P细胞迁移和入侵也扭转扭转过度(数字6(c) -6(f))。建议lncRNA SNHG3能促进细胞增殖,迁移和入侵竞争性绑定和抑制mir - 326表达,从而上调。

4所示。讨论

GC是一个主要的健康问题,第二个全世界癌症相关死亡的主要原因。在亚洲,约60%的GC病例诊断(20.]。尽管外科手术技术的改进和辅助疗法,GC仍然是非常致命的,5年生存率仅为42%(在中国21]。LncRNAs可以调节基因表达和影响肿瘤的发展,发展,和治疗。黄et al。Snhg3被认定为竞争内源性RNA分子,从而促进大肠癌的发展(22]。香港等人异常upregulation snhg3在卵巢癌预后不良(密切相关9]。然而,许多具体的监管机制的lncRNA GC并没有被研究过。因此,探索潜在的分子机制lncRNA在GC可能有助于开发新的诊断和治疗的目标。我们的研究发现,根据RT-q PCR分析,lncRNA SNHG3在GC调节细胞比正常人类胃上皮细胞永生化。CCK-8和Transwell分析表明,抑制lncRNA SNHG3可以抑制增殖,迁移,入侵GC细胞,证实lncRNA SNHG3可能影响GC的过程。我们的研究结果表明,lncRNA SNHG3,这可能是一种癌基因,可以调节GC的发展和进步中获益。然而,的具体机制lncRNA SNHG3 GC需要进一步研究。

像龙头,lncRNA起着关键作用在癌症生物学和病理学竞争性抑制microrna和间接调节mRNA。吴等人的研究结果表明,SNHG15竞争内源性RNA(龙头),参与调控YAP1-hippo信号通路在甲状腺乳头状癌mir - 200 a - 3 - p (23]。北美防空司令部起着重要的作用在调节骨肉瘤细胞的功能与hsa - mir - 199 - a - 3 - p (24]。他等人表明,北美防空司令部超表达促进增长,入侵,PTC迁移细胞通过抑制mir - 202 - 5 - p表达式(25]。LncRNA人类负重外骨骼加速结肠癌细胞的增殖mir - 613 / RTKN 28岁,虽然LncRNA Xist, mir - 137的内生海绵,移植Rac1, mir - 137的目标基因和促进神经胶质瘤细胞的增殖(26]。在我们的实验中,我们发现的表达lncRNA SNHG3 mir - 326和发现他们在GC细胞显示反向表达趋势。此外,根据生物信息学的分析,我们发现lncRNA SNHG3 mir - 326包含一个结合位点。荧光素酶报告基因和rip分析表明lncRNA SNHG3直接与互动mir - 326和监管。这些结果表明,lncRNA SNHG3作为内生海绵、竞争性结合mir - 326,负调节其表达。

转折,一个高度保守的转录因子与螺旋结构,被认为是调节致癌性质对于许多癌细胞(27- - - - - -29日]。最近,人们发现转折是参与体内乳腺癌间质转型,促进上皮形成(30.]。也被报道,扭曲表达显著增强不同类型的癌症,如前列腺癌、肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤(31日- - - - - -33]。此外,转折还在许多生理过程中起着重要作用,如血管生成、内脏,外渗,和染色体不稳定31日]。这些发现表明,转折是一个新的癌基因与肿瘤发生和肿瘤的进展。为了调查是否lncRNA SNHG3和电抗器,可以负调控mir - 326的释放,调节目标基因扭曲GC mir - 326的细胞进行了研究。通过生物信息学分析和荧光素酶报告基因分析、扭转被证明是mir - 326的目标。更重要的是,过度的lncRNA SNHG3逆转的荧光素酶活动TWIST-wt mir - 326模拟所抑制。击倒的lncRNA SNHG3显著减少扭曲的表情,mir - 326逆转的抑制剂。我们建议lncRNA SNHG3可以调节的表达手法,负调节mir - 326。此外,扭转明显推翻了抑制细胞的过度转移的击倒lncRNA SNHG3或超表达mir - 326,这表明轴lncRNA SNHG3 - mir - 326 -转折可能参与GC的发展。

5。结论

总之,我们的数据表明,lncRNA SNHG3提升GC细胞转移通过调节mir - 326和扭曲。这将帮助我们更好地理解lncRNA, microrna的,在GC mRNA网络。然而,的功能lncRNA SNHG3, mir - 326,扭转体内是没有被测试的。此外,我们没有测量SNHG3临床病人的表情。还应该进行进一步的研究来探索是否某些信号通路发挥作用的机理lncRNA SNHG3 GC。因此,SNHG3作为生物标志物的意义和健壮性GC需要进一步确认。

数据可用性

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信息披露

小君饶和傅金近co-first作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。