文摘

介绍。长非编码rna (lncRNAs)在内的各种生物功能,包括肿瘤增殖、凋亡、进展、转移。lncRNA肺腺癌转移相关记录1 (MALAT1)在各种癌症中,以及骨肉瘤(OS);然而,它在操作系统底层机制了解甚少。本调查旨在阐明MALAT1 OS细胞增殖和迁移的机制,并为进一步靶向治疗提供理论基础操作系统。方法。在目前的研究中,我们应用中存在评估MALAT1表达式操作系统组织和细胞系。MALAT1的影响和mir - 124 - 3 - p OS细胞增殖和迁移研究了CCK-8和化验。细胞周期和细胞凋亡在使用流式细胞分析仪检测。MALAT1之间的竞争关系和mir - 124 - 3 - p dual-luciferase记者证实了试验。结果。MALAT1在OS细胞系和组织标本中,和击倒MALAT1显著抑制细胞增殖,迁移和细胞凋亡增加,G0 / G1期的百分比。此外,MALAT1可以直接绑定到mir - 124 - 3 - p和抑制mir - 124 - 3 - p的表达。此外,MALAT1超表达显著减轻了对OS细胞增殖抑制由mir - 124 - 3 - p超表达,涉及除抑制的鞘氨醇激酶1 (SphK1)。结论。我们建议lncRNA MALAT1与mir - 124 - 3 - p调节瞄准SphK1 OS进程。因此,我们发现了一个小说MALAT1 / mir - 124 - 3 - p / SphK1信号通路的生物行为的监管系统。

1。介绍

骨肉瘤(OS)是一种常见的原发性骨肿瘤在儿童和青少年偏爱的发病率已列为最高的原发性恶性骨肿瘤类型(1]。操作系统的特点是高度恶性肿瘤,早期转移。许多操作系统已经拥有先进的疾病患者远处转移时最初的陈述,因此临床实践者带来了巨大挑战。操作系统有一个糟糕的预后转移发生后尽管OS治疗患者的5年存活率显著增加在过去的几十年。最近突破的使用管理的靶向治疗恶性肿瘤,如白血病、肺癌,为操作系统治疗带来有益的启示。因此,有必要探索OS肿瘤发生和发展的分子机制和临床相关的生物标志物和操作系统的目标。

尽管93%的人类基因组转录成rna,只有2%的这些rna可以翻译成蛋白质。其余98%的非编码RNA的RNA (ncRNA)有限的或不编码蛋白质的能力。其中,长非编码RNA的RNA分子(lncRNAs)是一个类的长度在200 - 100000个核苷酸的范围和从事多样化的生物过程。越来越多的证据表明lncRNAs可以参与基因的表达,包括表观遗传调控、转录调控,转录后的调控,因此在癌症发展和发展中发挥着关键作用。先前的研究表明,转移相关的肺腺癌成绩单1 (MALAT1)相关的发生,发展,转移和预后的多种肿瘤类型,包括操作系统(2]。MALAT1是操作系统中高度表达的主要组织和细胞系,MALAT1减少的差别,对这些基因的扩散、迁移,入侵,epithelial-mesenchymal过渡(EMT) OS细胞。此外,抑制MALAT1会导致细胞周期阻滞和细胞凋亡3- - - - - -5]。然而,背后的分子机制MALAT1条例操作系统还不够清晰。

小分子核糖核酸(microrna)是一种内源性非编码单链RNA分子的长度范围的18 - 24核苷酸。他们可以降低mRNA或抑制mRNA翻译通过绑定3′未翻译区(3′utr) mRNA的目标,目标的差别导致对这些基因的表达。在最近几年,越来越多的关注已经支付给microrna在肿瘤发生和发展的作用6]。先前的研究表明,miR - 124 - 3 - p是一个肿瘤抑制米尔由于其低表达在各种癌症,并可能抑制细胞增殖,迁移和入侵癌细胞通过抑制不同的目标(7,8]。然而,具体机制mir - 124 - 3 - p的操作系统仍然是模糊的。

据报道,MALAT1可以用microrna竞争性结合,从而间接地调节miRNA-target表达式。这个竞争激烈的绑定microrna也叫microrna的海绵(9,10]。在目前的研究中,我们确定了过度的MALAT1 OS操作系统发展和它的致癌作用。此外,我们的研究验证,MALAT1可以绑定到mir - 124 - 3 - p,从而直接竞争与鞘氨醇激酶1 (SphK1)作为内源性分子海绵。本研究确定了MALAT1 / mir - 124 - 3 - p / SphK1通路在人类首次操作系统。

2。材料和方法

2.1。样本采集

新鲜肿瘤手术标本分离出操作系统患者在湖南省人民医院接受治疗。邻近的健康组织也从这些患者操作系统作为控制的组织。所有标本病理确诊为操作系统。所有的标本都立即snap-frozen在液氮和存储−80°C到使用。所有的研究过程符合赫尔辛基宣言的道德标准。批准这项研究是获得医院伦理委员会(批准号2019 - s14系列),并从所有个人获得知情同意。

2.2。细胞来源和Culturation

人类成骨细胞细胞系(HfoB1.19)和人类OS细胞系(MG63、U2OS Saos-2)都从Procell购买生命科技有限公司有限公司(武汉,中国)。

MG63细胞培养:HfoB1.19细胞,U2OS, Saos-2 OS细胞在DMEM培养基培养补充10%胎牛血清的边后卫。媒体被从Procell购买生命科技公司(武汉,中国),和的边后卫从Hyclone购买(美国南洛根,UT)。中含有青霉素(100 U /毫升)和链霉素(100 U /毫升)。细胞系都生长在一个37°C孵化器有限公司为5%₂。

2.3。结合位点预测MALAT1, mir - 124 - 3 - p,和SphK1

结合位点之间MALAT1和mir - 124 - 3 - p与在线预测软件预测母星V2 (http://starbase.sysu.edu.cn/starbase2/),而结合位点mir - 124 - 3 - p和SphK1与在线预测软件预测TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_72/)。

2.4。RNA提取和定量实时聚合酶链反应(存在)

RNA提取总RNA提取使用MiniBEST执行通用设备(猫。# 9767)(豆类、大连、中国)根据制造商的指示。一个数量的1.5288μg反转录成RNA的cDNA用逆转录酶工具包(Primescript RT试剂盒gDNA橡皮擦完美实时)。标准中存在的反应进行ABI 12 k实时PCR系统仪器,和mRNA水平量化使用SYBR-Green混合工具包(LightCycler 480赛博绿色我主人,罗氏公司)。

microrna的提取进行了使用miRNeasy微工具包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)根据制造商的指示。反转录成RNA cDNA然后存在试验。

引物都是购自岛制药公司(上海,中国),和所有的引物序列表1。相对表达水平计算比率规范化与内生控制(GAPDH或U6核内小rna)。候选基因的相对褶皱的变化进行了分析使用2^−ΔΔCT方法。

2.5。细胞转染

三个小核RNA)针对MALAT1序列设计,和序列的最佳抑制效应被选中,用于进一步研究脱靶效应降到最低。Lipofectamine RNAiMAX试剂(生活技术,卡尔斯巴德,CA)是用于各种核构造成OS细胞的转染,荧光素酶的记者分析,2000年Lipofectamine试剂用于cotransfection pmirGLO-MALAT1 / SphK1-WT或pmirGLO-MALAT1 / SphK1-MUT和mir - 124 - 3 - p模仿或mimic-NC HEK 293 t细胞。siRNA针对MALAT1 (si-MALAT1), siRNA针对SphK1 (si-SphK1),炒负控制(si-NC), mir - 124 - 3 - p, mir - 124 - 3 - p模仿,数控模拟都从岛购买制药公司(上海,中国)。

2.6。细胞计数Kit-8 (CCK-8)测定

一个CCK-8试验用于检测细胞增殖。转染24 h后,细胞在对数生长阶段被播种在96 -孔板,每口井的5000个细胞,和三个复制设置每组中。细胞培养在5%的二氧化碳,37°C的孵化器。一个额外的4 h孵化后10μL CCK-8试剂,光密度(OD)波长450纳米(OD450)是衡量使用EnSpire多模板读者(PerkinElmer,伍德布里奇,加拿大)1,2,3,4天后转染。

2.7。划痕试验

划痕试验是用于评估人类成骨细胞细胞系的迁移和OS细胞系。两条平行线是画在后面6-well盘子用记号笔在细胞播种之前,细胞被播种在6-well消化后板。我们用10μl吸管尖上轻轻地画线板当细胞板的底部,和每个划痕的宽度应该尽可能接近相同。冲洗后与PBS缓冲板三次取消所产生的细胞碎片抓,细胞拍摄(0 h)。接下来,照片拍摄在6 h, 24 h,分别和48 h孵化。最后,收集图片进行分析。

2.8。细胞周期和细胞凋亡测定

细胞周期阶段分布测量和分析CytoFLEX流式细胞分析仪(贝克曼库尔特)。暂时细胞转染与核隔夜孵化后,收集和OS细胞转染48 h后,用PBS。然后,收集细胞在一夜之间被70%乙醇固定在4°C。最后,DNA染色液添加后流式细胞术检测乙醇去除和PBS洗涤。数据收集和分析与CytExpert v.2.3软件(贝克曼库尔特)。

细胞凋亡分析使用膜联蛋白V-PI凋亡检测设备(A211 Vazyme,南京,中国)。特定的细胞转染核(6×10⁴细胞每24-well板)。转染OS细胞收获和PBS洗。然后,细胞resuspended在100年μ5 l膜联蛋白绑定缓冲和孵化μl的膜联蛋白FITC和5μl(π为15分钟。解决方案是在室温下受光照和孵化。最后,我们检查后细胞凋亡增加150μl膜联蛋白绑定缓冲。

2.9。Dual-Luciferase记者分析

荧光素酶检测中进行了使用Dual-Luciferase记者分析系统(WI Promega,麦迪逊,美国)。收集细胞和细胞溶解荧光素酶检测根据制造商的指示在cotransfection后48 h。

2.10。西方墨点法

细胞细胞溶解使用里帕缓冲区(Beyotime生物科技、上海、中国)。溶菌作用后,细胞与5×SDS混合加载缓冲区和煮5分钟在100°C。蛋白质10% sds - page分离和转移到PVDF膜。然后,膜被封锁5%牛奶/ TBST 1 h和随后孵化主要抗体在4°C一夜之间,和二次抗体稀释5%牛奶/ TBST室温1 h。蛋白质的表达进行了分析使用一个增强化学发光(ECL)试剂和ChemiDoc™XRS +成像系统系统(Bio-Rad、钙、美国),和GAPDH作为内部参考。

2.11。统计分析

所有与SPSS统计分析软件(版本22.0)。值提出了均值±SD,每个实验至少重复三次。费舍尔分析、独立样本t以及,单向方差分析(方差分析)作为适当的。值小于0.05被认为是具有统计学意义。所有图都是准备使用GraphPad Prism 7.0软件(美国圣地亚哥GraphPad软件)和Adobe Illustrator (Adobe,圣何塞,CA)。

3所示。结果

3.1。LncRNA MALAT1操作系统的进程中起着重要的作用

的影响lncRNA MALAT1上操作系统的开发和研究进展。中存在的结果表明,MALAT1高架在人类OS标本相比邻近健康组织( )(图1(一))。我们进一步探讨MALAT1表达与临床病理参数之间的关系。基于MALAT1表达式中值,操作系统患者分为两组:高、低组MALAT1表达式。我们的数据表明,高MALAT1表达式与先进的临床分期及远处转移(表2; )。此外,存活曲线的分析表明,高MALAT1表达式与贫穷有关操作系统患者的总生存期(图1 (b); )。

接下来,我们测量MALAT1表达在不同的操作系统细胞系(MG63、U2OS Saos-2)和人类成骨细胞细胞系(HfoB1.19)使用中存在。结果表明,MALAT1显著调节在所有操作系统细胞系,尤其是MG63和U2OS ( )(图1 (c))。因此,MG63 U2OS细胞系被选为后续实验。在一起,建议MALAT1可能与操作系统开发和进展显著相关。

以确保操作系统具体有效的细胞被封锁,细胞转染和小干扰rna (NC-siRNA)控制炒或MALAT1-specific核(siRNA1790, siRNA209, siRNA6108)。与NC-siRNA组相比,小干扰rna组MALAT1表达减少,特别是在siRNA6108集团(数字1 (d)和1 (e))。因此,siRNA6108被选为以下实验。

探索与OS MALAT1协会表达细胞周期和细胞凋亡,MALAT1核(si-MALAT1)和消极的控制(si-NC)转染为两个操作系统细胞系:MG63 U2OS。与si-NC组相比,凋亡细胞比例增加与细胞转染si-MALAT1以流式细胞术分析(数据1 (f)和1 (g)操作系统),而MALAT1沉默的百分比增加细胞系在G0 / G1期(数字1 (h)- - - - - -1 (j))。细胞增殖和迁移是由CCK-8和化验,分别。与si-NC组相比,击倒MALAT1相对减少两MG63细胞生存能力和U2OS细胞4天(数字2(一个)和2 (b))。击倒MALAT1也降低了相对迁移距离MG63和U2OS细胞(数字2 (c)- - - - - -2 (e))。在一起,上面的数据表明,si-MALAT1极其表达下调表达水平MALAT1, MALAT1减少的百分比G0 / G1期,抑制细胞凋亡,促进细胞增殖和迁移在人类的OS细胞。

3.2。负调控mir - 124 - 3 - p之间的关系和MALAT1操作系统

越来越多的证据表明,lncRNAs microrna的海绵和抑制microrna活性功能。MALAT1也调节microrna海绵分子的形式在操作系统?首先,我们寻找microrna与互补的碱基配对使用在线软件母星v2.0 MALAT1,和互补的结合位点mir - 124 - 3 - p和3′utr的MALAT1(图3 (d))被确认。接下来,我们集中在mir - 124 - 3 - p,一位参与癌症的肿瘤抑制细胞增殖和迁移。

我们发现一个负线性关系mir - 124 - 3 - p的表达和MALAT1 OS组织(图3(一个))。存在试验表明,mir - 124 - 3 - p的表达增加si-MALAT1组相比,si-NC组(图3 (b)),而MALAT1表达减少mir - 124 - 3 - p超表达组相比,负控制(NC)组(图3 (c))。在一起,上面的数据显示表达mir - 124 - 3 p是MALAT1在OS细胞的表达呈负相关。

我们探索目标绑定关系mir - 124 - 3 - p和MALAT1在进一步的实验中使用双荧光素酶检测。我们克隆了预测mir - 124 - 3 - p的结合位点MALAT1 (MALAT1-WT)和突变结合位点(MALAT1-MUT)成一个荧光素酶报告质粒。荧光素酶活性化验瞬态cotransfection后24小时。结果表明,mir - 124 - 3 - p模仿显著降低MALAT1-WT而mimic-NC的荧光素酶的活动。Cotransfection mir - 124 - 3 - p模仿和MALAT1-MUT没有改变荧光素酶活动(图3 (e))。在一起,这些数据表明,mir - 124 - 3 - p可以直接绑定到MALAT1和减少其表达式。

确认这个目标绑定的生物功能的关系,我们观察到MG63细胞生存能力和U2OS细胞转染数控,mir - 124 - 3 - p, mir - 124 - 3 p +数控或mir - 124 - 3 - p + MALAT1。CCK-8结果表明,mir - 124 - 3 - p超表达显著抑制细胞生存能力MG63 U2OS细胞与数控转染组相比,而MALAT1缓解抑制作用(数据3 (f)和3 (g))。总的来说,结果表明,目标绑定关系mir - 124 - 3 - p和MALAT1除了表达改变可能存在功能性监管的影响。

3.3。识别MALAT1监管关系,mir - 124 - 3 - p,和SphK1

进行了进一步的分析重点是miR-14-3p和Sphk1之间的关系。首先,我们预测之间的结合位点mir - 124 - 3 - p和SphK1使用在线预测软件TargetScan(图4(一))。然后,我们验证目标绑定关系mir - 124 - 3 - p和SphK1使用双荧光素酶检测。我们克隆了预测mir - 124 - 3 - p的结合位点SphK1 (SphK1-WT)和突变结合位点(SphK1-MUT)成一个荧光素酶报告质粒。荧光素酶活性化验瞬态cotransfection后24小时。结果表明,mir - 124 - 3 - p模仿显著降低SphK1-WT而mimic-NC的荧光素酶的活动。Cotransfection mir - 124 - 3 - p模仿和SphK1-MUT没有改变荧光素酶活动(图4 (b))。在一起,这些数据表明,mir - 124 - 3 - p可以直接绑定到SphK1和减少其表达式。

识别MALAT1监管关系,mir - 124 - 3 - p, SphK1,我们首先探讨mir - 124 - 3 - p的影响和MALAT1 SphK1 mRNA /蛋白表达在人类OS细胞。MALAT1 Sphk1被击倒的表达下调和mir - 124 - 3 - p的过度表达,通过免疫印迹(数字4 (c)和4 (d))。类似的结果也观察到在mRNA水平(数字4 (e)和4 (f))。我们下一个评估SphK1于OS细胞的影响。免疫印迹结果表明si-SphK1明显降低MG63 SphK1表达式和U2OS细胞相比,si-NC组(图4 (g))。CCK-8化验显示OS细胞生存能力降低,以应对由si-SphK1 SphK1抑制(数字4 (h)和4(我))。在一起,这些结果表明SphK1促进OS细胞增殖,和MALAT1可能与mir - 124 - 3 - p调节瞄准SphK1 OS进程。

4所示。讨论

近年来,大量研究表明,lncRNAs发挥关键作用在癌症发展和进展,包括乳腺癌[11),胆囊癌症(12),前列腺癌(13),和其他恶性肿瘤,以及操作系统(14]。考虑到可以由lncRNAs恶性肿瘤的生物学行为,他们可能是一个潜在的恶性肿瘤患者的治疗目标。

lncRNA MALAT1表达式已经证明在人类增加操作系统,它是显示调节增殖,入侵和转移的OS细胞通过多种信号通路(3,4,15,16]。此外,lncRNA MALAT1被证明是操作系统的一个独立预后因素(17]。在目前的研究中,我们表明,lncRNA MALAT1显著调节在操作系统组织和细胞系相比邻健康组织和正常细胞系。我们还发现,击倒MALAT1减少在OS细胞增殖和迁移。这些结果与以前的研究结果整合,它建议MALAT1可以作为一个潜在的目标操作系统治疗。

作为mir - 124家族的一员,mir - 124 - 3 - p能抑制细胞增殖,和mir - 124 - 3 - p失调已经证明参与肿瘤发生和发展多种肿瘤类型,包括乳腺癌[7),膀胱癌(18),非小细胞肺癌(19),和前列腺癌20.),以及操作系统。黄表明,mir - 124 - 3 - p在OS表达下调,作为肿瘤抑制功能衰减OS细胞增殖和入侵。此外,mir - 124 - 3 - p与不良临床和病理特征观察到操作系统(21]。我们之前的研究还发现,mir - 124 - 3 - p可以通过目标函数作为一个肿瘤抑制OS ROCK1 [22]。然而,mir - 124 - 3的底层机制- p抑制OS仍不清楚,需要进一步的研究和探索。

探索MALAT1之间的相关性和mir - 124 - 3 - p,我们进行了生物信息学分析,结果证明了一个假定的结合位点在MALAT1 mir - 124 - 3 - p。接下来,荧光素酶的测定表明,mir - 124 - 3 - p的确可以绑定到MALAT1元素由公认的microrna的直接反应。此外,MALAT1击倒导致mir - 320 b的表达升高,而mir - 124 - 3 - p过度抑制MALAT1表达式。这些结果表明负监管MALAT1之间的关系和mir - 124 - 3 - p。进一步的实验结果显示,MALAT1可能减轻扩散抑制由mir - 124 - 3 - p,表明负调节mir - 124 - 3 - p MALAT1可以调节在OS细胞生物学行为。

鞘氨醇激酶1 (SphK1)是一个平衡的关键调节器赞成鞘氨醇、神经酰胺和pro-survival sphingosine-1-phosphate (S1P)。SphK1的作用在调节细胞周期进程通过G1 / S期已经被很好地记录下来了。作为一个致癌激酶,它表现出高表达在许多类型的肿瘤,包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、子宫癌、肾癌23,24),急性白血病(25),以及操作系统(26]。患者SphK1过度往往预后较差(27]。先前的研究表明,SphK1的表达显著增加操作系统组织,和SphK1证明是致癌基因的操作系统,操作系统,它可以促进经济增长并支持其抵抗化疗药物(26]。进一步的研究表明,SphK1参与阿霉素耐药性的发展和贡献在OS细胞通过调节HIF-1糖酵解α表达式[28]。在目前的研究中,CCK-8化验显示,下调表达的SphK1减少操作系统细胞的增殖,进而证明SphK1提升OS细胞的增殖。

然而,SphK1之间的关系、MALAT1和mir - 124 - 3 - p OS目前不清楚。之间关系的基础上证明negative-regulation MALAT1和mir - 124 - 3 - p,我们进一步确定SphK1是一个潜在的目标mir - 124 - 3 - p使用生物信息学工具。荧光素酶报告实验和监管分析研究表明,mir - 124 - 3 - p下调SphK1的表达水平。我们也观察到,过度mir - 124 - 3 - p或者击倒的MALAT1导致显著降低SphK1表达式。

近年来,一种新的RNA调控mechanism-competing内源性RNA(龙头)已经被提出(29日]。在该机制中,rna可以互相竞争microrna与microrna绑定,从而调节下游rna转录后的调控,实现和参与调控生物行为的操作系统。例如,我们以前的研究表明lncRNA HOXA11-AS作为内生海绵通过直接绑定mir - 124 - 3 - p和减少mir - 124 - 3 - p的表达,然后产生一个致癌基因功能的操作系统(22]。

在目前的研究中,我们发现SphK1的表达显著下调后MALAT1淘汰赛和mir - 124 - 3 - p超表达。结合负监管MALAT1之间的关系和mir - 124 - 3 p,我们相信SphK1表达式与MALAT1表达呈正相关和负相关mir - 124 - 3 - p的表达。

在一起,我们推测MALAT1作为一个内生海绵通过直接绑定到mir - 124 - 3 - p因此减少mir - 124 - 3 - p的表达。同时,我们发现MALAT1的影响可以调节操作系统进程mir - 124 - 3 - p针对SphK1表达式,表明MALAT1充当龙头、调节SphK1表达式骗取mir - 124 - 3 - p OS。

5。结论

总的来说,目前的研究表明,MALAT1超表达促进细胞增殖和迁移的操作系统。更重要的是,我们的数据显示一个小说MALAT1 / mir - 124 - 3 - p / SphK1监管途径在OS细胞。其中,MALAT1可以作为竞争内源性RNA结合mir - 124 - 3 - p,然后通过针对SphK1可能促进OS进程。

缩写

操作系统:	骨肉瘤
MALAT1:	转移相关的肺腺癌成绩单1
LncRNA:	长非编码RNA
SphK1:	鞘氨醇激酶1。

数据可用性

数据和材料将根据要求提供。

伦理批准

本研究通过湖南省人民医院伦理审查委员会(批准号2019 - s14系列)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突的研究,本文的作者,和/或出版。

作者的贡献

磅写手稿和执行大部分的实验。ZXL和LC协助执行实验。磅ZXL赞助和设计研究。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项工作得到了湖南省自然科学基金(2020 jj5301)和湖南的科研项目健康委员会(20200042)。