文摘
前列腺癌(PCa)指的是一个在男性泌尿生殖系统最常见的肿瘤。新兴的研究已经证实,circRNAs发挥重要作用在肿瘤的发生和发展。然而,圆形RNA circITGA7之间的相关性和PCa仍然不清楚。这里,PCa circITGA7的角色是探索和底层机制研究。circRNA表达谱的PCa和paracancerous组织建立的高通量测序。在PCa circITGA7组织和细胞的表达水平检测中存在。集落形成,细胞计数Kit-8 EdU,流式细胞术检测用于检测circITGA7在PCa细胞增殖的影响。进一步探索底层机制,对下游靶基因进行生物信息学分析。RNA免疫沉淀反应和dual-luciferase记者分析被用来验证mir - 370 - 3 - p之间的直接关系和circITGA7或P21CIP1。目前的结果表明,circITGA7 PCa组织和细胞中表达下调。获得或丧失化验表明,circITGA7抑制PCa的增殖细胞在活的有机体内和在体外。海绵机械,circITGA7担任mir - 370 - 3 - p,和mir - 370 - 3 - p P21目标CIP1在主成分分析的细胞。引起小鼠细胞增殖的抑制由circITGA7可以逆转使转染mir - 370 - 3 - p模仿。总的来说,我们的数据表明,circITGA7发挥了重要作用在抑制肿瘤增殖PCa和可能是一个潜在的治疗目标。
1。介绍
前列腺癌(PCa)是第二个最常见的癌症男性在世界范围内,高发病率和死亡率(1]。尽管手术切除局部PCa是可以治愈的,但是许多病人被诊断为远处转移和手术错过了机会。雄激素剥夺疗法(ADT)是首选的治疗转移性PCa和可以在短期内迅速抑制肿瘤恶化。然而,几乎所有的患者PCa ADT将发展为前列腺癌激素抵抗(CRPC)和(2 - 4年内死去2]。因此,迫在眉睫的是更好地了解PCa的发病机制,寻找新的治疗靶点。
环状RNA是一种新型的非编码RNA没有帽子5′和3′尾巴。它形成一个封闭的循环结构back-splicing机制和稳定比线性非编码RNA (3,4]。在1979年首次发现在电子显微镜下,circRNAs最初认为前体mRNA拼接错误的产品5,6]。随着高通量测序的出现,它已经发现,circRNAs广泛表达于真核生物(7]。此外,越来越多的证据显示,circRNAs恶性肿瘤的发展发挥了重要作用,包括PCa (8- - - - - -10]。
circITGA7,生成的外显子4整合素α亚基由back-splicing 7 (ITGA7)基因,抑制大肠癌的首次报道增长和2018年由李等人转移(11]。随后,在甲状腺癌其监管的作用,骨肉瘤,神经胶质瘤,胃癌是报道先后[12- - - - - -15]。然而,circITGA7在PCa的表达式和生物作用仍不清楚。在这项研究中,我们确定了circRNAs差异表达PCa基于高通量测序,发现在PCa circITGA7组织的表达显著低于paracancerous组织。我们进一步检查的影响circITGA7 CCK-8前列腺癌细胞的增殖,EdU,集落形成、流式细胞术和探索底层机制。我们的研究可能提供一个潜在的PCa的诊断和治疗的新目标。我们工作的预印本曾被发表在研究广场(DOI:10.21203 / rs.3.rs - 726944 / v1)[16]。
2。材料和方法
2.1。组织样本和细胞系
共有28对PCa样本和对应的相邻正常前列腺组织得到根治切除术病人的前列腺癌在武汉中心医院2016年至2019年之间。总结临床数据补充表中列出1。患者接受化疗、放疗、内分泌治疗,或其他抗癌治疗手术前被排除在我们的研究。研究协议是中心医院的伦理委员会批准的武汉,入学前,从每个病人知情同意了。
人类前列腺癌细胞系(DU145 LNCaP,生物)和正常的人类前列腺上皮细胞(RWPE-1)从细胞研究的研究所,获得中国科学院(中国上海)。细胞在37°C和5%孵化有限公司2在DMEM培养基(美国Gibco)含有10%的边后卫(青霉素和链霉素美国HyClone)和1%(美国Gibco)。
2.2。RNA-Seq分析
高通量测序进行三对前列腺癌和paracancerous正常组织,和样本处理和测序Kangce科技有限公司有限公司(武汉,中国)。磨边机的结果处理软件包(3.12.1版)。截止值的0.05和叠化截止2被用来判断基因表达差异的统计学意义。RNA-seq数据都需要在NCBI基因表达综合数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE179321),加入GSE179321数量。
2.3。RNA净化和存在
细胞和组织的总rna提取使用试剂盒试剂(美国英杰公司)根据制造商的指示。核糖核酸酶在37°C R治疗处理3 U /毫克的核糖核酸酶R(中心、美国)15分钟。混合互补DNA合成使用PrimeScript RT大师(豆类,中国)或miScript逆转录工具包(试剂盒、德国)500 ng的RNA随机或低聚糖(dT)底漆。定量实时PCR分析(存在)进行了使用SYBR预混料交货Taq™工具(豆类,中国)或miScript SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒,德国)。2的值−ΔΔCT相对于一个样本,计算分析rna的相对表达水平。GAPDH或U6作为内生控制mRNA和circRNA或microrna的分别。补充表中列出了所有的引物2。
2.4。质粒建设和转染
circITGA7人为上调或下调表达,pcD-ciR过度表达向量(circITGA7),空向量(矢量),针对circITGA7小干扰RNA (si-circITGA7)和消极的控制(si-NC)从GenePharma购买(上海,中国)。mir - 370 - 3 - p模拟及其相应的负控制(mimic-NC)从RiboBio购买(广州)。所有的向量被转染到细胞Lipofectamine 3000(美国热费希尔科学)后,制造商的指示。
2.5。细胞计数Kit-8化验
在48 h posttransfection, 1×104细胞被镀成96 -孔板,然后孵化有限公司为5%2在37°C 24、48、72、或96 h。然后,10μL CCK-8解决方案(美国Sigma-Aldrich)添加在每个好,和一个额外的细胞继续培养2 h。吸光度测量在使用标450海里。
2.6。集落形成实验
集落形成试验,稳定转染细胞被播种到six-well板块每口井的1000个细胞和培养2周37°C公司为5%2。殖民地被固定在甲醇和0.1%结晶紫染色。细胞殖民地拥有超过50个细胞数。
2.7。EdU化验
EdU试验进行了使用Cell-Light EdU DNA细胞增殖工具包(RiboBio,中国)根据制造商的协议。在48 h posttransfection细胞(1×105细胞/)被播种在96 -孔板,和EdU(100更易/ l;RiboBio)添加到中、孵化2 h在黑暗中在室温下。然后,100年μl Hoech st 33342 (2μg / ml;RiboBio)用于染色细胞的DNA含量。图像得到一个奥林巴斯FSX100显微镜(日本奥林巴斯)。EdU-stained细胞Hoechst-stained细胞的比率计算来评估细胞增殖。
2.8。荧光原位杂交
设计并合成Cy3-labeled circITGA7 RiboBio (RiboBio,中国)。这些探测器是混合物,他们的序列没有公开。细胞首先固定在4%多聚甲醛和孵化0.1% Triton x - 100在冰上10分钟。2.5μl circITGA7探针(20μ米)与细胞杂化5 h在黑暗中在37°C。DAPI染色细胞核。获得的图像在尼康A1Si激光扫描共焦显微镜(日本尼康仪器公司)。
2.9。流式细胞术分析细胞周期
是暂时性的转染细胞与circITGA7或si-circITGA7收获和沾propidium碘缓冲区(热费希尔科学、美国),持续15分钟。细胞周期分析是由FACScalibur流式细胞分析仪(美国BD Pharmingen)。分析的结果是ModFit LT软件。
2.10。Dual-Luciferase记者化验
野生型和突变序列circITGA7和P21CIP13′utr被Tsingke合成生物科技有限公司,有限公司,和克隆到pGL3子向量RiboBio (RiboBio,中国)。细胞被播种密度1×10496孔板。然后,荧光素酶载体转染到细胞与米尔高370 - 3 - p模仿或mimic-NC分别。荧光素酶活动是由一个双荧光素酶报告实验设备(美国Promega)。
2.11。RNA免疫沉淀反应
美国EZMagna RIP工具(微孔)被用来评估目标之间的关系mir - 370 - 3 - p和circITGA7。细胞收获和细胞溶解RNA在冰上裂解缓冲含有核糖核酸酶和蛋白酶抑制剂为5分钟。然后,细胞溶解产物(100μl)与40孵化μl蛋白A / G珠子和5μ人类anti-Ago2 g抗体(美国微孔)或5μ美国g免疫球蛋白(微孔)在一夜之间在4°C。接下来,RNA /珠复合物与RIP洗清洗缓冲和resuspended蛋白酶K缓冲瓶在58°C 30分钟分离蛋白质。免疫沉淀反应rna被存在试验用于识别。
2.12。免疫印迹分析
细胞被收集在48 h posttransfection和resuspended里帕裂解缓冲(Beyotime,中国)。总的来说,50μ克的蛋白质样品被sds - page分离,然后转移到聚乙二烯二氟化物膜(美国微孔)。与5%阻断缓冲区被屏蔽后,细胞膜和P21孵化CIP1一夜之间抗体在4°C。发射极耦合逻辑显色底物(Beyotime中国)被用来可视化乐队。P21的抗体CIP1和GAPDH是购自Abcam(美国Abcam)。
2.13。肿瘤异种移植实验
生物细胞(3×106,200年μl)稳定转染circITGA7或控制向量皮下注入雄性BALB / c裸小鼠(4周)。然后,老鼠维持三个星期前被颈椎脱位牺牲。肿瘤体积记录每3天。肿瘤体积是根据以下公式计算:体积=长×宽2/ 2。
2.14。统计分析
数据平均值±标准偏差。统计分析了使用GraphPad Prism 7.0(美国拉霍亚)。所有的实验都是独立重复一式三份。的χ2测试用于确定circITGA7表达式之间的关系和临床参数。皮尔森相关分析是用来分析circITGA7的表达之间的相关性和mir - 370 - 3 - p。比较肿瘤和相邻的非癌变组织进行了分析使用成对的学生的t以及。对比分析了两个独立的团体通过未配对的学生的t以及,比较在多个组单向方差分析计算图基的测试。 被认为是表明一个统计上的显著差异。
3所示。结果
3.1。circITGA7 PCa组织和细胞系表达下调
在PCa识别circRNAs差异表达,我们在三双表现RNA序列前列腺癌和paracancerous组织,结果表明29 circRNAs显著调节和87 circRNAs显然PCa组织中表达下调与paracancerous组织(图1(一))。circITGA7在肿瘤的微分表达式及其参与肿瘤发展的能力已报告在PCa但其作用尚不清楚,所以我们选择circITGA7进行进一步的研究。基因组结构表明,生成circITGA7 ITGA7基因的外显子4和头部到尾部的拼接circITGA7进一步证实了Sanger测序(图1 (b))。之后,我们设计了收敛的引物和不同引物放大线性和环状RNA的互补的基础上,从生物基因组DNA (gDNA)通过PCR和DU145细胞线。结果给信息circITGA7只能放大了不同引物互补,而不是在gDNA(图1 (c))。然后,核糖核酸酶R化验表明circITGA7更耐核糖核酸酶R比线性mRNA(图1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
随后,circITGA7表达水平的28例PCa相应组织和邻近的正常组织中存在探测到,结果表明circITGA7明显比正常组织的PCa组织中表达下调(图1 (e))。然而,circITGA7表达水平没有显著相关病理阶段,格里森评分和血液PSA水平(补充表1)。同样,PCa circITGA7的表达细胞(生物、LNCaP DU145)是大大低于正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)(图1 (f))。之后,为了理解circITGA7的亚细胞定位,我们进行了鱼的生物实验,结果显示,circITGA7主要分布在细胞质(图1 (g))。
3.2。circITGA7抑制PCa的增殖细胞的过度在活的有机体内和在体外
为了调查circITGA7的函数PCa, circITGA7的超表达载体转染到PCa细胞。如图2(一个)的表达水平circITGA7转染后显著增加。之后,我们进行了CCK-8、集落形成、EdU,流式细胞术分析。CCK-8化验发现,细胞生长速率抑制过度后circITGA7(图2 (b))。同样,集落形成试验和EdU试验表现出circITGA7抑制PCa的增殖细胞(数字2 (c)和2 (d))。此外,流式细胞仪分析显示,过度的circITGA7诱导细胞周期阻滞于G0 / G1期(图2 (e))。进一步探索circITGA7对细胞增殖的影响在活的有机体内生物细胞的稳定性与circITGA7注入裸小鼠和circITGA7的表达在异种移植肿瘤检测(图2 (f))。如数据所示2 (g)- - - - - -2(我)与控制向量组相比,增长率和肿瘤异种移植肿瘤的重量circITGA7组明显减少。总的来说,我们的研究结果表明,circITGA7能够明显抑制PCa细胞增殖在活的有机体内和在体外。
(一)
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(d)
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(h)
(我)
3.3。击倒的circITGA7促进PC细胞增殖
进一步探索circITGA7在PCa细胞增殖的影响,我们构造的小干扰RNA击倒circITGA7表达式(图3(一个))。如图3 (b),CCK-8试验表明,击倒circITGA7显著增加PCa细胞的细胞生长速度比消极的控制。一致,以下集落形成和EdU化验表明,主成分分析细胞的增殖能力提高circITGA7击倒后(数字3 (c)和3 (d))。此外,流式细胞仪分析显示,circITGA7降价可能会加速细胞转变S期(图3 (e))。
(一)
(b)
(c)
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(e)
3.4。circITGA7海绵mir - 370 - 3在PCa - p细胞
作为高效的microRNA海绵调节蛋白质编码基因是一个重要的为circRNAs发挥它的功能。为了阐明circITGA7调节PCa过程的潜在机制,我们进行了生物信息学分析米兰达,TargetScan, CircInteractome和预测可能目标circITGA7(图5小分子核糖核酸4(一))。分析地理数据GSE40026表明,mir - 370 - 3的表达水平在PCa - p细胞非常高于正常上皮细胞(图4 (b))。此外,据报道,mir - 370 - 3 - p促进扩散PCa (17]。因此,mir - 370 - 3 - p选择深造。首先,mir - 370 - 3的表达水平在PCa - p组织中存在了。如图4 (c),mir - 370 - 3的表达在PCa - p组织的价格相比明显增加相邻正常组织。然后,皮尔森相关分析说明,mir - 370 - 3的表达水平- p circITGA7呈负相关(图4 (d))。此外,过度的circITGA7显著降低的水平mir - 370 - 3 p(图4 (e))。
(一)
(b)
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(j)
阐明circITGA7能否直接绑定miR - 370 - 3 - p,然后执行dual-luciferase试验,结果表明,miR - 370 - 3 - p模仿的荧光素酶活性显著降低circITGA7与米尔数控应承担的相比,虽然miR - 370 - 3 - p模拟荧光素酶活性没有显著影响circITGA7突变目标站点(数字4 (f)- - - - - -4 (h))。接下来把化验展出circITGA7和mir - 370 - 3 - p在核糖核酸复合物浓缩Ago2组与免疫球蛋白组(数字4(我)和4(j))。
3.5。P21CIP1是一个目标,mir - 370 - 3 - p在PCa细胞
为了进一步研究的监管机制mir - 370 - 3 - p,我们预测下游P21的目标CIP1与TargetScan数据库。如图5(一个),mir - 370 - 3 - p P21可能的目标CIP1,所以与WT-P21荧光素酶质粒CIP13ʹUTR或Mut-P21CIP13ʹUTR构造之间的关系,进一步验证mir - 370 - 3 - p和P21CIP1。我们发现mir - 370 - 3 - p模仿显著抑制细胞携带的荧光素酶活性荧光素酶质粒含有WT-P21CIP13ʹUTR,但不包含Mut-P21的荧光素酶质粒CIP13ʹUTR(图5 (b))。此外,P21的信使rna和蛋白质水平CIP1circITGA7超表达后显著增加,而这种效应逆转了mir - 370 - 3 - p模拟(数字5 (c)- - - - - -5 (e))。总的来说,上述结果表明,circITGA7监管P21的表达CIP1通过骗取mir - 370 - 3 - p。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.6。mir - 370 - 3 p的超表达消除circITGA7在PCa细胞增殖的抑制作用
测试是否circITGA7抑制PCa的增殖细胞通过mir - 370 - 3 p,我们进行了救援化验。如图6(一)的执行表达式circITGA7显著地抑制PCa细胞增殖,但这种抑制效应使转染后取消了mir - 370 - 3 - p模仿。类似的现象被发现在随后的流式细胞术分析。细胞周期在G0 / G1期被捕后circITGA7的过度表达,但是转染细胞加速进入S期的mir - 370 - 3 - p模拟(图6 (b))。总之,这些结果表明,circITGA7导致细胞增殖抑制mir - 370 - 3 - p / P21CIP1轴。
(一)
(b)
4所示。讨论
最近,circRNAs的作用在癌症的发展过程中已经吸引了越来越多的关注和几个circRNAs被认为是潜在生物标记物对癌症(18,19]。据报道,CircSLC19A1沉默抑制PCa细胞增殖,迁移和入侵通过调节mir - 326 / MAPK1轴(20.]。张等人提出,Circ_0057553 PCa细胞生存能力的影响,移民,入侵,细胞凋亡,通过糖酵解mir - 515 - 5 - p / YES1轴(21]。山等人认为circFMN2促进了PCa的增殖细胞通过促进DNA合成和抑制细胞凋亡22]。这些研究表明,circRNAs发挥了重要作用PCa的开发和发展。
在这项研究中,我们证明了在PCa circITGA7组织和细胞的表达明显低于正常前列腺组织和细胞。然而,circITGA7没有明显的表达水平与病理阶段,格里森评分,PSA水平。考虑到小样本量的研究,这个结论还需要进一步澄清的一个更大的样本量。方舟子等人报道,circITGA7促进了骨肉瘤细胞的增殖和转移(13),而李等人发现circITGA7抑制大肠癌的生长和转移11]。这两项研究与不同的结论揭示了生物的多样性circITGA7的角色在不同的组织。在我们目前的研究中,损失和功能化验证实,在PCa circITGA7抑制细胞增殖,但circITGA7细胞入侵和迁移的影响尚不明确,这将在我们未来的探索研究。
那些circRNAs主要来源于蛋白质编码外显子和局部细胞质中可以通过骗取microrna函数(23]。金等人发现circLMTK2作为肿瘤抑制通过调节微rna的表达在PCa - 183 (24]。circAMOTL1发现作为竞争内源性RNA的表达提示AMOTL1通过骗取mir - 485 - 5 - p在宫颈癌25]。考虑到circITGA7源自ITGA7基因的外显子4,主要位于细胞质中,我们推测circITGA7可能充当microrna的海绵,然后miRNA-target进行分析。通过重叠筛选的米兰达,TargetScan CircInteractome,结合地理数据分析和文献检索,mir - 370 - 3 - p被选为目标的circITGA7下一步的研究。mir - 370 - 3 - p被报道参与广泛的人类疾病,如急性肺炎(26),子宫内膜异位(27),心肌细胞缺氧损伤(28[],特别是癌症29日- - - - - -31日]。通过进一步的机制研究,我们发现circITGA7可以结合mir - 370 - 3 - p和负调控mir - 370 - 3 - p在PCa细胞表达。
P21CIP1由CDKN1A编码,在细胞周期调控的关键因素之一。几项研究已经指出,P21CIP1参与细胞周期G1-S阶段过渡(32- - - - - -34]。吴等人证实,mir - 370 - 3 - p可以促进前列腺癌细胞G1-S相变部分P21表达下调CIP1(17]。此外,P21CIP1被预测为目标,通过TargetScan mir - 370 - 3 - p。因此,P21CIP1被选为下游mir - 370 - 3 - p的目标进行进一步的研究。在我们的研究中,circITGA7的超表达可能上调P21的表达CIP1和诱导G0 / G1细胞周期阻滞,扭转了这种效应使转染mir - 370 - 3 - p模仿。我们的结果初步阐述了circITGA7机制,监管PCa的增殖细胞。
5。结论
总之,我们的研究表明,circITGA7下调在PCa首次组织和细胞系。circITGA7抑制PCa细胞的增殖和诱导G0 / G1期被捕。从力学上看,功能为海绵mir - 370 - 3 p, circITGA7 P21增加CIP1表达式。数据增强我们理解circRNA生物学和提出了一个新颖的circRNA / microrna的mRNA监管网络PCa的管理。
数据可用性
相对应的数据集和支持数据可从作者在合理的请求。
伦理批准
本研究中心医院的伦理委员会批准武汉(2021 - 021)
同意
入学前书面知情同意了每个病人。
信息披露
帮派罗和李Guohao co-first作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
帮派罗和刘董设计研究和写的手稿。Yonglian郭、李Guohao志华Wan, Yuanjie张进行了实验。Yonglian郭和李Guohao分析数据。最终版本的手稿是批准所有作者。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金(81802538和81802538)。
补充材料
补充表1:患者样本的临床病理的特点和PCa circITGA7的表达。标本分类根据2017年版的美国癌症联合委员会。补充表2:小干扰rna序列引物,用于研究。(补充材料)