文摘
背景。面对预后不良和免疫治疗胃癌(GC)的失败,这一项目试图找到新的潜在生物标记物预测预后和精密的药物来改善情况。方法。形成合成矩阵,我们从Genotype-Tissue胃腺癌转录组数据检索表达式项目(GTEx)和癌症基因组图谱(TCGA)。Necroptosis-related预后lncRNA coexpression分析和确认了单变量Cox回归。然后我们表演最绝对的收缩和选择算子(套索)构建necroptosis-related lncRNA模型。接下来,kaplan meier分析,接受者操作特征(ROC)、时间(uni-Cox)单变量Cox回归,多元考克斯(multi-Cox)回归,计算图表,和校准曲线模型进行验证和评估。基因集富集分析(GSEA),主成分分析(PCA),免疫分析,预测half-maximal抑制浓度(IC50)高危人群进行了分析。为进一步讨论冷热之间的免疫治疗肿瘤,我们整个组分为两个集群基于necroptosis-related lncRNAs。结果。我们建造了一个模型16 necroptosis-related lncRNAs。在模型中,我们发现校准块显示出良好的一致性与预后的预测。该地区的1 -、2 - 3年OS ROC曲线下(AUC)是0.726,0.763,和0.770,分别。高危人群可能全身治疗的指南,因为风险组之间IC50明显不同。最重要的是,集群可以帮助区分冷热肿瘤有效,为精确的中介。集群2被确认为炎热的肿瘤更容易受到免疫治疗药物。结论。这个项目的结果支持,necroptosis-related lncRNAs可以预测预后和帮助区分冷热肿瘤为提高个人在GC疗法。
1。介绍
令人遗憾的是,通常情况下,大多数胃癌(GC)患者诊断在晚期预后不良结束(1]。因此,GC是第三个全球癌症死亡的最常见原因(2018年世界范围内8.2%的960万例癌症死亡)(2]。系统性治疗是唯一的选择不能手术治疗的患者。化疗和目标疗法是常见的系统性治疗和经常报道治疗失败和副反应(3]。它敦促我们找到新的可利用的治疗策略。免疫治疗已经改变了景观治疗恶性肿瘤,取得了很多。但是仅仅三分之一的病人应对检查点抑制剂在大多数癌症(4]。除了没有诱导的细胞死亡,寒冷的肿瘤,缺乏既存的免疫力,也是免疫治疗抵抗的原因(5]。因此,必须研究如何增强免疫治疗在GC。
大多数肿瘤都有天生的抗细胞凋亡,诱导的细胞死亡机制,如necroptosis,已经逐渐被认为是很有前途的治疗策略(4]。Necroptosis,小说形式的坏死细胞程序性死亡与细胞凋亡不同,能增强CD8+leukocyte-mediated抗肿瘤免疫激活RIPK1和RIPK3肿瘤微环境内(时间)6]。在另一份报告,necroptotic癌症cell-mimicry纳米疫苗可以加强抗肿瘤免疫小鼠诱导NKG2D +自然杀伤细胞和CD8的扩张+T细胞(4]。同时,necroptosis作品产生免疫抑制时间促进恶性肿瘤通过处于受控和Mincle,也暗示了necroptosis作为一个潜在的免疫治疗目标在GC [7]。
长非编码RNA (lncRNA)可以控制基因通过影响他们的翻译或直接互动与其他蛋白质和RNA物种(8]。microrna Linc00176版本,如miR-9 mir - 185,目标mrna表达下调导致necroptosis肝癌细胞。特林,p53-inducible lncRNA,可以防止癌细胞necroptosis通过抑制TRAP-GSK3βnf -κB坏死信号。心肌细胞necroptosis可以通过RIPK1受lncRNA / RIPK3 [9]。此外,lncRNAs已报告,促进肿瘤炎症和帮助恶性肿瘤逃避免疫破坏10]。研究necroptosis-related lncRNA并未被广泛认为是一个潜在的治疗目标在GC。因此,收购更多necroptosis-related lncRNAs知识可以帮助我们理解的角色necroptosis和lncRNAs免疫疗法。
冷和热之间的区别肿瘤和肿瘤感冒肿瘤转变成热将改善免疫疗法的抗肿瘤效应。在免疫疗法将会带来一个突破,而其他细胞死亡的机制仍完全阐明GC在这个阶段。但是我们仍然缺乏一个简单而有效的方法区分肿瘤(5]。当lncRNAs高度作为新癌症生物标记物的体液,我们试图重组患者基于necroptosis-related lncRNAs和识别肿瘤热有效地改善预后和增加精确中介在临床实践10,11]。
2。材料和方法
2.1。患者的GC收购信息
获得合成数据矩阵关于胃腺瘤和腺癌和正常胃组织,RNA转录组数据集(HTSeq-Counts和HTSeq-FPKM)及相关临床信息从Genotype-Tissue表达式下载项目(GTEx) (https://www.gtexportal.org/TCGA)和癌症基因组图谱()(https://portal.gdc.cancer.gov/)。然后我们转换FPKM价值TPM合成矩阵数据的价值。表、宠物猫dplyr, tidyr R包。因此,我们有两个合成数据矩阵。识别差异表达的重要值矩阵只是lncRNAs,而另一个TPM值矩阵分析。减少在这个分析中统计偏差,胃腺瘤和腺癌缺失患者总生存期(OS)值或短OS值(< 30天)被排除在外。与相关的临床信息,我们检索到的306例患者,将他们分成火车组和测试风险组随机风险草莓Perl和插入符号R包。比例是1:1。
2.2。的选择和lncRNAs Necroptosis-Related基因
M24779 necroptosis基因集。格林尼治时间包含八个necroptosis基因,从基因集富集分析下载(GSEA) (http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)。此外,关于necroptosis与先前的报道,我们终于获得67 necroptosis-related基因(附录的形象T1)。然后我们发现5022年差异表达lncRNAs(日志2褶皱变化(FC) > 1,错误发现率(罗斯福)< 0.05, )筛选合成数据矩阵后草莓Perl和limma R包(12]。67 necroptosis-related基因之间的相关性分析和差异表达lncRNAs组合矩阵。然后,387年lncRNAs necroptosis-related基因,皮尔森相关系数> 0.4, ,被认为是necroptosis-related lncRNAs。
2.3。建立和验证签名的风险
根据GC病例的临床资料,TCGA GTEx,单变量Cox比例风险相关回归分析被用来屏幕lncRNAs生存从necroptosis-related lncRNA ( )。然后,我们做了套索回归10倍交叉验证和执行值为0.05以及1000年运行周期。对于每一个周期,一个随机刺激成立为了防止过度拟合的1000倍。然后建立了一个模型。1 - 2 -,3年时间接收机工作特性曲线(ROC)绘制了模型的计算过程。我们计算了风险评分用以下公式: 的系数(lncRNAn)的短形式与生存和expr lncRNAs相关系数(lncRNAn) lncRNAs的表达。根据风险评分中位数子组,包括低收入和高危人群建立了(12,13]。我们使用卡方检验分析临床因素之间的关系模型,以评估预后的价值构造模型。
2.4。独立因素和中华民国
我们开发了单变量Cox (multi-Cox) (uni-Cox)和多变量Cox回归分析评估风险评分及临床特征是否自变量因素和使中华民国比较不同因素在预测结果。
2.5。列线图和校准
rms R包,风险评分,年龄,和肿瘤阶段被用来建立一个为1 -诺模图,2 -,3年操作系统基于Hosmer-Lemeshow测试和修正曲线来说明是否预测与实际结果显示良好的一致性。
2.6。基因集富集分析
与策划基因集(kegg.v7.4.symbols.gmt),基因集富集分析(GSEA)软件(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/login.jsp)应用于识别显著富集的通路之间的低收入和基于标准的高危人群: 和罗斯福< 0.25。
2.7。调查时间和免疫的检查点
根据GSEA的结果,我们决定在风险分析的免疫细胞因子组。我们可以计算出免疫渗透状态TCGA GC患者包括定时器,CIBERSORT,伊势亚,QUANTISEQ, MCPcounter,史诗,CIBERSORT TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org/)。用另一种方式,我们可以下载的形象渗透TCGA估计所有肿瘤在同一个网站。ggplot2 Wilcoxon符号秩检验、limma尺度,和ggtext R包进行分析探索免疫细胞浸润的差异内容,和泡沫图所示的结果13]。除此之外,我们还通过比较关于时间分数和激活免疫检查站低收入和高危人群之间ggpubr R包。
2.8。模型的探索在临床治疗
然后我们用R包pRRophetic评估治疗的反应取决于每个GC的half-maximal抑制浓度(IC50)患者在癌症基因组学的药物敏感性(GDSC) (https://www.cancerrxgene.org/)[14]。
2.9。基于16预后lncRNAs集群
为探索GC应对免疫疗法,我们决定探索潜在的分子子组由ConsensusClusterPlus (CC) R包基于预后lncRNAs表达式(15]。主成分分析(PCA), T-distributed随机邻居嵌入(t-SNE)和由Rtsne kaplan - meier生存R包。
此外,我们由GSVA免疫分析和药物敏感性比较基础和pRRophetic R包。
3所示。结果
3.1。在GC Necroptosis-Related lncRNAs病人
这项研究是在图的流动1。癌症基因组图谱(TCGA)和Genotype-Tissue表达项目(GTEx)矩阵,我们获得204份正常样本(174 GTEx样本)和343个肿瘤样本。根据67年necroptosis-related基因的表达和差异表达lncRNAs(|日志2FC | > 1和 )正常和肿瘤样本之间,我们终于387 necroptosis-related lncRNAs(相关系数> 0.4 )(12,16]。,194是调节,其他人则表达下调(图2(一个))。necroptosis-related基因之间的网络图和数据,如妳、BCL2 lncRNAs如图2 (b)和附录D1。
(一)
(b)
3.2。模型的构造和验证
根据单变量Cox回归分析(uni-Cox),我们发现16 necroptosis-related lncRNAs明显与总生存期(OS)(所有相关 )和做了一个热图(数字3(一个)和3 (b))。为了避免过度拟合预测签名,我们执行这些lncRNAs套索回归并提取相关16 lncRNAs necroptosis在GC日志(的第一流的价值λ)的最小偏差(数据的可能性3 (c)和3 (d))。除此之外,我们能找到10 lncRNAs调节和其他人是桑基图(图中表达下调3 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
我们计算风险评分公式:风险评分= LINC01829×(0.2597) + LINC02657×(0.1297) + RNF139-AS1×(−0.1539) + FRMD6-AS2×(0.0083) + AGBL5-IT1×(−0.4116) + AC116914.1×(−0.4053) + AC005165.1×(0.0228) + AL353804.2×(−0.0387) + AC004596.1×(−0.5485) + AL355574.1×(−0.1209) + AC012409.3×(0.3441) + AC124067.4×(−0.0227) + AC015813.1×(−0.1553) + AP001189.3×(0.0173) + AL133245.1×(−0.3709) + AC069549.1×(0.1690)13]。
风险评分公式,风险评分的分布、生存状态、生存时间,和相关的表达这些标准lncRNAs低收入和高危人群之间的患者相比,在火车上,测试,和整个集。这些都表明高危人群更糟糕的预测(数字4(一)- - - - - -4(左))。此外,传统的临床病理的特点,年龄,性别,年级,舞台,T, M, N也表现相同的结果(图4(米))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
(左)
(m)
3.3。建设列线图
风险比(人力资源)的风险评分和95%可信区间(CI)分别为2.588和1.778 -3.767 ( ),分别在单变量Cox回归(uni-Cox) 2.564和1.738 -3.782 ( ),分别在多变量Cox (multi-Cox)回归(数字5(一个)和5 (b))。此外,我们发现另外两个独立预后参数、年龄(1.051和1.023 - -1.080; )和阶段(1.523和1.018 - -2.280; )(图5 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
根据三个独立的预后因素,风险评分,(所有年龄和TNM阶段 multi-Cox),我们建立了一个预测计算图表1 - 2 -,3年OS的GC病人(图5 (c))。我们也利用1 - 2 -和3块校准证明的诺模图有很好的一致性预测的1 - 2 -,3年操作系统(图5 (d))。
3.4。的风险评估模型
接受者操作特征(ROC)是利用时间来评估模型的敏感性和特异性的预后。我们还说明了中华民国的结果与ROC曲线下的面积(AUC)。1 - 2 -,和三年的训练集的AUC是0.754,0.824,和0.819,测试集的0.709,0.701,和0.713,和整个组的0.726,0.763,和0.770,分别为(数字5 (e)- - - - - -5 (g))。3年中华民国的风险模型、临床因素和计算图表总分,风险得分(0.770),和诺模图(0.731)(图显示了他们主要的预测能力5 (h))。
3.5。GSEA
研究生物功能风险组之间的差异,我们利用GSEA软件探索KEGG通路中的高危人群在整个设置(图S1A)。七个十大通路与浓缩的高危人群是高度相关的肿瘤入侵,和其他与免疫有关,如“白细胞transendothelial迁移”(所有 ;罗斯福< 0.25;| NES | >(图1.5)6(一))[17]。因此,我们试图使一个免疫分析的模型。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.6。免疫因素的调查和临床治疗高危人群
有更多的免疫细胞与高危人群在不同的平台上展出的免疫细胞泡泡图和文档,如巨噬细胞M1, T细胞CD4 +天真,免疫分数在伊势亚,CD8 T细胞+,T细胞CD4+在计时器,T细胞CD4细胞+QUANTISEQ和巨噬细胞在MCPcounter和史诗(所有 )(图6 (b))(附件D2)。此外,我们还发现,较高的风险评分有更多的协会与树突状细胞等免疫细胞休息,被报告为免疫疗法在GC(图的一部分6 (c))[18]。所有这些表明,高危人群有更高的免疫渗透状态。高危人群有更高的免疫得分和更高ESTIMAT(微环境)得分,标志着一个不同的时间从低风险组(图6 (d))。大多数免疫检查站还显示更好的激活在高危人群中(图6 (e))。它暗示我们可以选择适当的检查点抑制剂对GC病人重整旗鼓的风险模式19]。与报告一致,高危人群,免疫得分更高,较低的IC50 12免疫治疗药物如苔藓虫素1(图6 (f))[20.]。更重要的是,我们还可以发现16化学或靶向药物,应用GC疗法,显示较低的IC50高危人群(图S2)。
3.7。区分冷热肿瘤和精密医学集群
指先前的研究,不同的集群,通常称为子类型,显示不同的免疫微环境导致的免疫治疗的反应不同21,22]。16 necroptosis-related lncRNAs,我们重整旗鼓病人分成两个集群的ConsensusClusterPlus (CC) R包基于necroptosis-related lncRNAs表达式(数字7(一)和S3A)[15]。T-distributed随机邻居嵌入(t-SNE)表示两个集群(图可以清楚7 (b))。此外,我们采用主成分分析(PCA)来验证两组和集群风险有不同的PCA(图7 (c))。此外,集群1最好的操作系统( )kaplan meier分析(图7 (d))。GSEA也被用来研究集群的生物功能。七个十大通路与浓缩在集群2相关免疫( ;罗斯福< 0.25;| NES | > 1.9),如“自然杀伤(NK)细胞介导细胞毒性”(数字7 (e)和图印地)。NK细胞及其细胞毒性充当一个重要的角色在免疫和癌症23]。验证其与风险的关系,图也。集群1与低风险组显著相关,和集群2与高危人群(意味着 )(图7 (f))。下面的结果对集群2可能导致患者的免疫治疗高危人群。关于比较单一样本GSEA (ssGSEA)分数的免疫细胞和免疫功能,15个免疫细胞,如CD8+12 T细胞,免疫功能,如有助改善炎症,物损伤你的心脏有更多与集群2(图的关系7 (g))。集群2是由免疫细胞高度渗透基于不同平台(图的分析7 (h))(附件D3)。集群2免疫得分较高和高ESTIMAT(微环境)得分,从集群1(图代表一个不同的时间7(我))。几乎所有的免疫检查点集群2中表达了更多的活动,如HAVCR2 (TIM3) LAG3, CD274 (PD-L1)(图7 (j))。CD8+T细胞的功能,有助改善炎症,物损伤你的心脏免疫得分高,激活TIM3, LAG3, PD-L1扮演了重要的角色在炎热的肿瘤。因此,我们可以考虑集群2炎热的肿瘤,而集群1作为冷肿瘤(5,24]。它可能导致不同的免疫治疗反应(22,25]。冷热肿瘤的概念、集群2更容易受到免疫疗法。与药物敏感性的比较,我们发现9免疫治疗药物,如紫草醌、只显示不同的IC50集群以及16化学或靶向药物应用于系统性治疗在GC(图7 (k)和图S3B)[26,27]。因为集群基于这些lncRNAs,我们可以进一步研究免疫治疗反应和加强精确GC患者的药物。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
4所示。讨论
免疫疗法可以改善经常报道治疗失败的情况,但并不是所有疾病的灵丹妙药4]。由于免疫抑制时间,一些患者免疫治疗反应差。因此,我们引入了概念,冷热肿瘤指肿瘤免疫分类而不是传统的由改善免疫疗法。高度渗透肿瘤免疫得分高的通常被认为是肿瘤热而noninfiltrated肿瘤与肿瘤免疫得分低的冷。检查点的更高的活动,比如TIM3 LAG3,也是肿瘤的特征之一。面对炎热的肿瘤,我们可以用T-cell-targeting免疫疗法治疗病人,微生物调制或其他免疫治疗药物。但它是不容易冷肿瘤,因为它未能释放先前存在的免疫T细胞程度较低。CD8 + T细胞可以通过释放PRF1杀死癌细胞,gn,或GZM打破宽容作为一个先前存在的免疫反应,增强免疫治疗通过PD-1 / PD-L1免疫抑制轴。因此明智的做法是将冷肿瘤成热肿瘤而不是给其他疗法(5,28]。
在这项研究中,我们建立了16个necroptosis-related lncRNAs模式并试图确定冷热肿瘤。患者重新集结到低收入和高危人群如kaplan meier分析模型并做了一些分析,GSEA, IC50预测。尽管我们发现高危人群可以预测预测和系统性治疗指南,我们不能确定热肿瘤高危人群。指报告,分子亚型,也称为集群,与肿瘤免疫抑制和微环境1,29日]。不同的类型有不同的免疫和时间分数导致不同的预测和免疫反应(22,25]。因此,我们将病人分成两个集群基于这些lncRNAs的表达15]。正如所料,这两个集群有不同的免疫微环境。集群1免疫抑制时间。与此同时,有更多CD8+T细胞高度渗透,更积极的功能,有助改善炎症,物损伤你的心脏免疫得分更高,TIM3和更高的活动,LAG3, PD-L1集群2,可以确定为绝对热肿瘤(5,24]。更重要的是,集群2更敏感的免疫治疗药物。Necroptosis-related lncRNAs不仅可以预测预后,但也是一个个人治疗指南。液体活检,最重要的是,这些lncRNAs区分冷热肿瘤可以简单、有效地与成像质量血细胞计数或肿瘤活检相比其他实验(28]。
此外,桑基图,我们发现其中一些lncRNAs明星如BCL2基因有关。FRMD6-AS2和LINC02657与妳相关联,这导致免疫治疗通过重组免疫微环境和PD-1抑制剂(30.]。BCL2 PD-1免疫治疗的热点,与AC012409.3 AC069549.1。它还可以克服免疫疗法失败并保持持久的抗肿瘤活性细胞凋亡反应(31日]。RNF31是一个潜在的免疫疗法的目标GC和可能受AC004596.1 [32]。TRAF2,与AL355574.1有关,可以通过增加肿瘤的易感性增强免疫治疗(33]。FRMD6-AS2抑制肿瘤生长、迁移和入侵通过河马信号通路(34]。和河马从事程序性细胞死亡信号通路是通过调节各种目标YAP等(35]。LINC02657报道,其过度将阻止肿瘤细胞程序性细胞死亡调节SART3 [36]。其他lncRNAs首先发现。新近necroptosis-related lncRNAs知识可以帮助我们开发一个更好的机械理解GC,这将带来一个突破到临床实践。
仍有一些缺点和不足虽然我们已经使用了许多方法来资产模型。回顾性研究,它容易受到固有偏见的研究范式37]。尽管检查点之间的表现明显的激活组和集群风险,我们不能做个比较相应的检查点抑制剂IC50, PD-1抑制剂等GDSC数据不足的结果。我们进行内部测试和验证的整个模型集,但是很难做预测的外部验证。即使我们有检索GSE84437系列和GSE62254系列的所有信息从基因表达矩阵综合(GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),我们无法得到适当的信息lncRNAs因为商业微阵列数据与GTEx TCGA相比有偏见和局限性。然而,免疫细胞的免疫细胞泡沫和热图显示多个平台的结果,这可能被认为是外部验证在某种意义上。鉴于上述分析和先前的报道,我们觉得我们的模型是合理的和可接受的为未来的临床试验13,38]。收集更多的临床数据集可以帮助确立的价值这些necroptosis-related lncRNAs,这将是我们的计划。
此外,necroptosis和lncRNAs诱导细胞死亡。Necroptosis可以诱导肿瘤细胞死亡,绕过细胞凋亡的形态caspase-independent方式(7]。LncRNAs可以调节apoptosis-related信号通路(39]。澄清他们的关系和机制通过实验将有助于有效地杀死癌细胞在不影响健康的细胞(7,10]。它将不仅在免疫治疗也在取得进展癌症研究。
5。结论
Necroptosis-related lncRNAs可以预测预后和帮助提出一个可利用的治疗策略通过确定冷热肿瘤,这将使很大的进步在个别治疗和改善病人的预后。针对necroptosis和lncRNAs将是一个有前途的途径克服系统性治疗失败和免疫治疗领域的扩张。因此,机制和关系,在necroptosis, lncRNAs,免疫力,和GC,价值被完全阐明和验证。
数据可用性
用于支持结果的数据可用,TCGA (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/),GTEx (https://www.gtexportal.org/),GSEA (http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)和GDSC (https://www.cancerrxgene.org/)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关这项研究的出版物。
作者的贡献
Zirui赵和Haohan刘本研究同样起到了推波助澜的作用。Zirui赵和刘Haohan促成了概念化;Zirui赵的方法、分析、可视化、和准备初稿;Zirui赵,Haohan刘、周Xingyu刘德亮方,Ou、晋宁你们Jianjun Peng简帛徐审查和编辑手稿;简帛徐促成了项目管理和资金收购。所有作者已阅读及同意发布版本的手稿。
确认
这项研究得到了国家自然基金(81672343和81672343),广东省自然科学基金,中国(2015 a030313570 a030313053和2017年),广州和科技项目,中国(201607010050)。
补充材料
附录S1。图S1:高危人群和集群的GSEA 2。(一)GSEA高危人群。(B)的GSEA集群2。附录S2。图S2: 16化学或靶向药物的IC50预测风险组。附录S3。图S3:共识的聚类分析necroptosis-related lncRNAs和IC50预测在集群。(A)热图,累积分布函数(CDF)情节,和共识的共识CDF实验组的情节集群矩阵。(B) 16化学或靶向药物仅仅显示显著的IC50不同集群。 Appendix T1: the table of necroptosis-related genes refers to GSEA and previous reports. Appendix D1: the network data of necroptosis-related genes and lncRNAs. Appendix D2: the profile of significantly differently infiltrated immune cells between risk groups in different platforms. Appendix D3: the profile of significantly differently infiltrated immune cells between clusters in different platforms.(补充材料)