文摘

肺癌是一种常见的恶性肿瘤,严重威胁着人类健康。它已成为恶性肿瘤的发病率和死亡率。近年来,circRNA,一种特殊的非编码RNA分子,已经吸引了相当大的兴趣。本研究关注的角色circRNA ANXA2 (circANXA2)在肺癌和促进癌症的分子机制。实时定量聚合酶链反应(rt - PCR)是用于检测circANXA2的表达丰度在不同肺癌细胞和组织。的亚细胞定位circANXA2通过荧光原位杂交检测。通过核circANXA2表达式被撞倒了。CCK-8、克隆形成试验和TUNEL分析被用于评估circANXA2对细胞增殖的影响,克隆形成能力,和细胞凋亡。circANXA2在肿瘤增殖的作用进一步验证在裸小鼠体内使用肿瘤移植模型。circANXA2的分子机制是研究荧光素酶活性测定和rt - pcr。 The expression abundance of circANXA2 is high in lung cancer cell lines and tissues. Knocking down of circANXA2 inhibits the proliferation and clonogenesis of the lung cancer cells. Knocking down circANXA2 promotes apoptosis. circANXA2 further affects downstream PDPK1 expression by regulating miR-33a-5p and thereby affecting the malignancy of the lung cancer cells. circANXA2 inhibits miR-33a-5p activity by directly interacting with miR-33a-5p. circANXA2 regulates the transcription of the miR-33a-5p downstream target gene PDPK1 and affects the malignant progression of lung cancer.

1。介绍

肺癌是肿瘤死亡的主要原因1),肺癌的高发病率和死亡率已经施加了沉重的社会和经济负担2]。预防和治疗肺腺癌的关键是探索肺癌的发生和发展的机理方面的基因调控和发现新奇的早期诊断方法和治疗靶点3- - - - - -5]。

非编码rna发挥重要作用在肿瘤发展和形成复杂的监管网络6,7]。circRNAs期间非编码RNA分子形成端到端转录(8和许多病理生理过程中扮演很重要的角色9]。circRNAs可以影响多种肿瘤的发生和发展,包括肺癌,通过机制,这种竞争性微rna抑制(10]。尽管取得了一些进展circRNAs的研究,了解circRNAs在肿瘤中的作用仍处于起步阶段。因此,circRNAs在肿瘤的作用和功能需要进一步研究,以及下游circRNAs监管机制和目标基因。circANXA2参与肿瘤的起源和发展。张等人证明circANXA2是一个潜在的生物标志物和治疗AML的目标通过分析circRNA概要文件(11]。然而,circANXA2在肺癌中的作用还没有被报道。

成熟的microrna识别目标mrna通过基本互补配对12]。根据程度的互补性,microrna诱导沉默复杂降解目标mrna或阻止目标mrna的翻译13]。miR-33a参与多种生理和病理过程,包括代谢、细胞分化、肿瘤起源和发展(14]。在乳腺癌(15和骨肉瘤16),miR-33a作为一个肿瘤抑制通过针对多个癌基因。在肺癌细胞,miR-33a的作用需要进一步研究。

3-phosphoinositide-dependent激酶1 (PDPK1)结构是由一个63 kDa丝氨酸/苏氨酸(对丝氨酸/苏氨酸)蛋白酶17]。PDPK1 Akt1的上游激酶激活(18,19]。c端兼容phosphatidylinostol-3 pH值地区,4,5,三磷酸(Pi2P3)和磷酸化Akt / PKB。Pi2P3-dependent蛋白激酶PDPK1结合Pi2P3 pH值通过自己的域在细胞质中,导致Akt构象变化和PDPK1接近对方。PDPK1可以激活其他蛋白质,比如一些PKC亚型和AGC家庭的成员,包括p70核糖体S6激酶(S6K) P90核糖体S6激酶(RSK),血清和激素性激酶(SGKs)和蛋白激酶A (PKA)20.,21]。PDPK1-mediated PI3K / Akt信号与许多类型的癌症(22,23]。然而,PDPK1在肺癌中的作用还不清楚。

在这项研究中,我们第一次评价circANXA2的表达水平在临床肺癌和paracancerous组织水平。表达下调的影响circANXA2表情增殖,凋亡,肺腺癌细胞周期与细胞功能进一步观察实验。可能的circANXA2 microrna的目标和下游基因检测使用生物信息学方法和双荧光素酶记者分析。电抗器的监管机制由circANXA2终于证实。在肺腺癌的作用和机制circANXA2初步探索,以及circANXA2的作用在肺腺癌的监管网络被澄清。小说的主要目的是发现早期诊断标志物和治疗靶点。

2。方法

2.1。临床样本收集和病人信息的收集

肺腺癌组织样本用于本研究收集的都是肺腺癌的病人一个明确的诊断和手术医院的胸外科部门2020年9月至2021年2月。肺癌和相邻控制收集20例。患者入选标准如下:肺腺癌患者接受叶切除术在我们医院的胸外科部门;影像学表现支持肺腺癌的诊断;病理诊断为肺腺癌;术前放疗、化疗、靶向药物治疗和生物治疗是没有收到;并同意参与研究和签署了知情同意书。排除标准如下:复杂或怀疑与其他慢性呼吸系统疾病,如慢性阻塞性肺病、支气管扩张;术后常规病理诊断未能证实肺腺癌;和其他潜在疾病可能干扰的研究。 Pathological diagnosis was made independently by two senior pathologists. The clinical information of patients was recorded completely before surgery. Samples of lung adenocarcinoma and normal lung tissues that were more than 5 cm away from the lung adenocarcinoma foci were collected during the operation, placed in RNA-free cryopreservation tubes within 10 min, and rapidly cooled with liquid nitrogen. Under low-temperature conditions, the samples were transferred to the −80°C deep low-temperature refrigerator. All patients signed informed consent forms. This study was reviewed and approved by the Ethics Committee of Shaanxi Cancer Hospital and in line with the Declaration of Helsinki (IRB-SC-2020-012).

2.2。细胞培养

人类肺上皮细胞BEAS-2B和肺癌细胞株A549, NCI-H446, NCI-H460,中冲,和95 - d都购买了从生物化学和细胞生物学研究所,中国科学院,在我们实验室处理。的细胞被放大high-glucose含10%胎牛血清的DMEM培养基(Gibco,生活技术,罗克维尔市,医学博士,美国)。在这项研究中,分析了circANXA2的功能在A549和中冲细胞系。属于人类nonsmall细胞肺癌细胞A549细胞和由肺癌组织移植由d . j . Griad文化。获得的细胞从一个58岁的白人男性24,25]。A549可以合成卵磷脂,含有大量的不饱和脂肪酸,通过胞二磷胆碱途径。A549细胞角蛋白阳性。中冲是一种人类nonsmall细胞肺癌细胞EGFR 19个外显子突变(26,27]。细胞培养的贴壁细胞培养瓶或培养板,每天观察和细胞生长。每2 - 4天中取代了根据细胞密度。细胞培养在37°C, 5%的公司₂湿恒温培养箱(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。一旦细胞密度达到80% - -90%,细胞通道和低温贮藏根据实验的需要。

2.3。细胞转染

观察细胞生长,细胞消化后最优的通过时间。细胞被播种在six-well细胞培养板密度为2.5×10⁵/好。文化在一个完整的媒介,进行24 h后观察细胞生长。脂质体转染实验后进行细胞融合的程度达到了60% - -70%。至少20分钟在实验之前,最初的媒介是废弃的,取而代之的是血清DMEM培养基(1.5毫升/)。准备Lipofectamine 2000转染(生活技术,罗克维尔市,医学博士,美国)。小干扰RNA降解的影响被进行预防的整个过程没有RNA酶脂质体转染的环境。根据研究的目的不同siRNAs转染,实验组集。细节如下:(1)si-circANXA2转染组(si-circRNA组):circANXA2核;(2)核转染组(si-NC组):随机核转染;(3)空白对照组:只添加和siRNA脂质体转染不执行。脂质体转染过程是根据2000年Lipofectamine手册。

2.4。基因表达检测中存在

总RNA提取试剂盒(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)方法根据装备的技术手册。纯度和浓度的总RNA检测使用NanoDrop 1000分光光度计(美国热科学)。的总RNA细胞转化成cDNA逆转录工具包。互补脱氧核糖核酸的肺腺癌组织或细胞作为模板,和目标基因的上游和下游引物。可能反向转录组片段通过PCR扩增反应。每个样本都配备了三个重复的漏洞来提高结果的可靠性。rt - pcr反应和执行检测。反应过程和条件如下:circANXA2,向前:5′-ACCTGCTCAGTATGACGCTTCT-3′,相反:5′-CTGGTAGGCGAAGGCAATATCC-3′;miR-33a-5p转发:5′-GGTGCATTGTAGTTGCATTGC-3′,逆转:5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。钙粘蛋白、前进:5′-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3′,相反:5′-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3′; vimentin forward: 5′-GAGAACTTTGCCGTTGAAGC-3ʹ, Reverse: 5ʹ-GCTTCCTGTAGGTGGCAATC-3ʹ. PDPK1, forward: 5′-GGAACAGCGCAGTACGTTTCT-3′, reverse: 5′-CTCGTTTCCAGCTCGGAATGG-3′; U6: forward: 5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′, reverse: 5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′; GAPDH, forward: 5′-AAGCCTGCCGGTGACTAAC-3′, reverse: 5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′. The PCR reaction conditions were as follows: predenaturation at 95°C for 3 min; 35 cycles of 95°C denaturation for 35 s, 53°C annealing for 35 s, and 72°C extension for 40 s; and extension at 72°C for 10 min. The reaction was stopped at 10°C. Sequence information: CT values of measured tissue and cell samples and internal reference GAPDH were recorded, and the average CT value from the three reholes was obtained for each sample. The 2^△△Ct值是用来表示目标基因的相对表达水平在肺腺癌组织。

2.5。免疫印迹

提取细胞总蛋白与细胞转染细胞蛋白提取工具。进行sds - page凝胶10%,分离和细胞转移到PVDF(美国Billerica的微孔,MA)膜。细胞膜含有5%脱脂牛奶被关闭在室温下1 h。第一抗体是用在一夜之间在4°C。最后,这些膜孵化与二次抗体和发达。

2.6。荧光原位杂交的实验

这些细胞被消化和计算。细胞被滑动后,细胞的数量添加到每个洞大约是5×10⁴。细胞密度达到约50% - -60%。1×PBS被添加到每个好,这些细胞被洗5分钟。然后,500年μL 4%的多聚甲醛是添加到每个。细胞在室温下10分钟。废液处理,1毫升的液体渗透增加了在4°C到每个操作孔为5分钟。prehybridization解决方案准备,适当的屏蔽解决方案和prehybridization缓冲区被混合在一个离心管的比1:99。prehybrid解决方案(200μL)被添加到每个好,反应30分钟的37°C。在黑暗中,2.5μL的鱼探针混合的浓度为20μ一夜之间被添加在37°C。然后,添加清洗液。DAPI染色溶液被稀释的比例1:1000光保护,200年μL的解决方案是添加到每个染色10分钟。细胞幻灯片仔细删除(远离光)和固定在玻片封平板电脑。荧光检测,和照片。

2.7。CCK-8

细胞悬液的稀释与调整的完全培养基的细胞密度5×10⁴/毫升。暂停接种在100年μL / 96孔细胞培养板。文化的24 h后,观察融合的程度,和细胞转染融合时进行了大约70%。五重复井每组设置,通过井被设置为引用。CCK-8 (Beyotime、上海、中国)检测解决方案(10μL)被添加到每个72 h转染后的细胞被放置在一个孵化器4 h。吸光度值(OD值)在450 nm的决心使用酶标分析仪。上面的实验进行了三次。

2.8。克隆形成实验

Six-well盘子都准备好了,和2毫升的预热DMEM完全培养基和100年μL细胞悬液(包含约200个细胞)被添加到每个在37°C。液体是改变每3 - 4天,培养了2周。文化是停止克隆时肉眼可见的盘子。文化是停止后,每个孔的上层清液中提取,孔与PBS清洗两次。多聚甲醛(4%)添加修复细胞大约10分钟。固定的解决方案是丢弃,细胞与PBS小心清洗两次。治疗0.1%结晶紫染色(Beyotime、上海、中国)解决方案进行了10分钟,和染色溶液与PBS冲洗掉。井是在室温下干燥。克隆形成的数量是在显微镜下计数,记录和拍照。

2.9。TUNEL实验

提取细胞对数生长期,细胞的浓度是1×10的调整⁵细胞,这些细胞被播种到幻灯片。每个标本与PBS冲洗三次。在空气中干燥之后,与刚做好样本固定,增加了多聚甲醛溶液在室温下1 h。PBS的样本洗,治疗后0.03%的H₂O₂在室温下进行10分钟消除内源性过氧化物酶的活动。这部电影打破了特里同x - 100年的0.1%。治疗是在4°C 2分钟。最后,在样本干后,他们与PBS冲洗。反应混合物(2μL酶集中和18μL标签解决方案)和deoxynucleotide转移酶解补充道。样本37°C的5%孵化有限公司₂孵化器60分钟。DAPI染色后荧光显微镜下观察样品。

2.10。双荧光素酶报告基因分析

circANXA2的全长序列和PDPK1 3′utr和没有miR-33a-5p突变体结合位点克隆。的下游Renilla荧光素酶基因克隆到双质粒psiCHECK2向量(WI Promega,麦迪逊,美国)。psiCHECK2-circANXA2和psiCHECK2-PDPK1-3′utr向量(Promega)构造。随后,10 pmol miR-33a-5p和控制模拟与荧光素酶cotransfected向量。剂量的转染试剂40 Lipofectamine 3000 ng。荧光素酶活性测定荧光素酶报告实验设备(Promega)转染后48 h。所有的实验都重复三次。

2.11。皮下肿瘤轴承测试

裸体老鼠一周后,皮下肺癌肿瘤移植模型建立,每组包含6裸小鼠。使用酒精消毒裸体小鼠的皮肤,和0.2毫升的准备肺癌A549细胞(Lenti-sh-NC Lenti-sh-circANXA2)悬架中提取一个注射器和接种裸鼠皮下注射的。肿瘤细胞接种后,在注射部位皮肤表皮是可见的。1周后,肿瘤生长的直径5 - 6毫米,表明成功建立在裸小鼠皮下移植瘤模型。裸小鼠移植和转移瘤模型被喂食的SPF环境。裸体小鼠的饮食和心理状态定期观察。老鼠的重量每周记录。长直径(l)和短直径(W)测量垂直于皮下移植瘤。肿瘤体积(V)计算使用公式V= (l×W²)/ 2,绘制肿瘤生长曲线。实验后,裸体小鼠牺牲通过位错的脖子。肿瘤大规模提取和体重。在半小时内组织隔离,质量与液氮保存的一部分,另一部分是固定在多聚甲醛。免疫组织化学检测肿瘤组织摘除。动物实验是陕西省肿瘤医院伦理委员会的批准。

2.12。免疫组织化学染色

组织切成4μ米厚片,在烤箱烤60°C半个小时。蜡和二甲苯脱蜡3 * 5分钟。两次与无水乙醇治疗了5分钟。两次组织浸泡在95%乙醇为5分钟。蒸馏水使用2 * 5分钟,关闭3%的过氧化氢,持续15分钟。部分被移除后,他们用PBS 3 * 5分钟洗净。正常山羊血清封闭了30分钟(10%)。主要抗体是一滴一滴地补充了一句,于是样本孵化一夜之间在4°C。主要的抗体被删除,增加了polymer-reinforcing代理,30分钟的混合物在室温下是平衡的。第二抗体是补充道,和样本孵化37°C 60分钟。 DAB color and color intensity under the microscope were controlled. After the color is finished, it was placed in distilled water and dehydrated with ethanol according to the concentration gradient. Transparent treatment was performed with xylene, and neutral gum was used for sealing.

2.13。统计分析

SPSS 17.0软件(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)被用于实验结果的统计分析。测量数据被表示为平均值±标准偏差。独立样本学生的t以及用于比较两组。组的平均值与单向方差分析图基的事后测试紧随其后。计算数据进行了卡方检验。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。检测circANXA2肺腺癌组织和细胞中表达水平

肺腺癌患者手术标本检测中存在。结果表明,circANXA2明显的表达调节在肺腺癌组织与邻近组织,有统计学意义(图1(一))。检测coexpression circANXA2和增殖标记ki - 67之间的相关性表明,coexpression circANXA2和ki - 67水平呈正相关(图1 (b))。随后,我们检测到的表达丰度circANXA2在人类正常的肺上皮细胞(BEAS-2B)和在不同肺癌细胞。此外,circANXA2特别高的细胞系中表达肺癌被确定。如图1 (c)circANXA2肺癌细胞系的表达水平明显高于BEAS-2B细胞。荧光原位杂交(FISH)是一种新的基于荧光原位杂交方法标签代替同位素标记和有很多优势,如安全、迅速,灵敏度高,探针与长时间保存。我们用鱼来检测sublocalization circANXA2的肺癌细胞。如图1 (d),circANXA2主要是局部的肺癌细胞的细胞质中。

3.2。推倒circANXA2对扩散的影响,克隆形成,肺癌细胞的凋亡

肿瘤细胞的增殖可以反映程度的恶性肿瘤。肿瘤扩散的速率随恶性程度,但倍增时间缩短。CCK-8用于检测A549和中冲细胞的增殖后circANXA2击倒。图2(一个)显示了基因敲除核效率。circANXA2 siRNA显著降低circANXA2的表达(图2(一个))。的影响circANXA2 A549的克隆形成能力和中冲被检测到。circANXA2击倒后,单独使用能力显著抑制A549和中冲的细胞,这表明击倒的circANXA2单独使用可以抑制肺癌细胞(图的能力2 (b))。circANXA2击倒显著抑制A549的生长和细胞中冲,这表明circANXA2击倒可以抑制小细胞肺癌(图的扩散2 (c))。随后,我们发现蛋白质表达水平的变化扩散细胞周期蛋白A1和CDK2。实验结果表明,细胞周期蛋白的表达水平A1和CDK2 circANXA2击倒后(数字有所下降2 (d)和2 (e))。确定circANXA2影响肺癌细胞的凋亡,TUNEL染色检测执行它。TUNEL荧光分析在控制和si-circANXA2组。结果表明,A549细胞凋亡和细胞中冲circANXA2击倒后显著增加(图2 (f))。bcl - 2表达水平检测结果表明,circANXA2撞倒后,bcl - 2表达降低(图2 (g))。然而,circANXA2撞倒后,伯灵顿的表达调节(图2 (h))。

3.3。circANXA2击倒抑制肺癌细胞的增殖

circANXA2在细胞水平的研究,我们发现的击倒circANXA2减少肺癌的恶性肿瘤细胞。我们确认是否circANXA2体内肿瘤抑制效果,使用裸鼠肿瘤移植模型。在体内实验中,BALB / c裸小鼠免疫缺陷的4 - 6周选择建立动物模型。建立了两组(Lenti-sh-NC和Lenti-sh-circANXA2),每组有六个裸小鼠。动物实验结果表明,扩散率裸体小鼠的肿瘤组织sh-circANXA2组和肿瘤体积小(减少数据3(一个)和3 (b))。裸体小鼠的肿瘤重量SH-circANXA2组低于对照组(图3 (c))。的表达circANXA2发现皮下肿瘤组织中存在。circANXA2减少的表达的肿瘤组织SH-circANXA2组(图3 (d))。细胞周期蛋白的表达水平A1和CDK2在肿瘤组织中存在的模型被检测到。细胞周期蛋白的表达水平A1和CDK2 sh-circANXA2组(数字有所下降3 (e)和3 (f))。此外,bcl - 2在肿瘤组织的表达减少circANXA2击倒后(图3 (g))。伯灵顿是调节(图的表达3 (h))。

3.4。circANXA2 miR-33a-5p可以绑定

我们进一步筛选可能绑定到circANXA2的microrna。我们第一次使用生物信息学分析方法。预测结果表明,circANXA2可能绑定到miR-33a-5p(图4(一))。为了进一步验证circANXA2和miR-33a-5p之间的关系,我们构建了一个双荧光素酶报告基因检测系统。我们克隆的线性序列circANXA2下游的荧光素酶基因。的3′UTR区域荧光素酶基因,如果miR-33a-5p可以绑定到这个circRNA,它等于作用于3′UTR区域的荧光素酶基因和抑制其正常转录。在这个实验中,所构造的荧光素酶基因转入细胞一起海肾荧光素酶基因。模拟和miR-33a-5p模仿先后转移到293 t细胞。48小时后收集细胞,检测荧光素酶的活动。结果表明,荧光素酶的活动circANXA2野生型组显著低于miR-33a-5p转移组比模拟组。然而circANXA2突变组,荧光素酶的活动miR-33a-5p转移组没有显著变化的价格相比模拟组(图4 (b)。表达水平的A549细胞中冲,miR-33a-5p circANXA2击倒后(图增加4 (c))。肺腺癌患者的手术标本检测中存在,和结果表明,miR-33a-5p在肺腺癌组织的表达明显下调的价格相比邻近组织,有统计学意义(图4 (d))。进一步的实验结果表明,miR-33a-5p肺癌细胞系中表达下调的价格相比人类正常的肺上皮细胞BEAS-2B(图4 (e))。

3.5。过度的miR-33a-5p逆转circANXA2在肺癌细胞的促进作用

绑定miR-33a-5p circANXA2的能力被证实使用上面所述的荧光素酶报告基因技术。然而,还需要进一步的功能实验来验证是否circANXA2的影响通过miR-33a-5p肺癌发生的恶性肿瘤。在这项研究中,我们同时转染miR-33a-5p模仿过表达circANXA2肺癌细胞。Mimics-NC作为消极的控制。miR-33a-5p的超表达是否能扭转circANXA2决心的促进效应。CCK-8检测的结果在图所示5(一个)。的超表达circANXA2 A549和中冲细胞的增殖,但肺癌细胞的增殖增加miR-33a-5p模仿后下降。此外,过度的circANXA2调节细胞周期蛋白的表达水平A1, CDK2、bcl - 2。然而,在miR-33a-5p模仿,表达水平降低(数据5 (b)- - - - - -5 (d))。伯灵顿的表达被抑制circANXA2超表达,但表达水平提高后的miR-33a-5p模仿(图5 (e))。这些结果表明,circANXA2可能调控其下游基因的功能与miR-33a-5p绑定。

3.6。mir - 125 - 5 - p目标PDPK1绑定

实验表明,circANXA2可以绑定到miR-33a-5p,但circANXA2能否调节下游靶基因的表达通过miR-33a-5p尚不清楚。使用TargetScan网站,我们进一步预测miR-33a-5p可以绑定到3′UTR区域PDPK1基因在肺癌细胞(图6(一))。双荧光素酶报告基因分析进一步证实miR-33a-5p PDPK1可以绑定。PDPK1野生型组miR-33a-5p转移组的荧光素酶活性明显低于模拟组。然而PDPK1突变组,荧光素酶的活动miR-33a-5p转移组没有显著变化的价格相比模拟组(图6 (b))。的存在结果表明表达PDPK1 miR-33a-5p过度后的下降(图6 (c))。相关分析的结果coexpression miR-33a-5p和PDPK1表明coexpression miR-33a-5p和PDPK1水平负相关(见图6 (d))。circANXA2过表达后,发现PDPK1基因的表达。后PDPK1基因的表达显著增加circANXA2超表达,如图6 (e)。免疫组织化学结果表明PDPK1高度表达的肺癌组织(图6 (f))。我们进一步分析了coexpression circANXA2与PDPK1之间的相关性。结果表明,circANXA2和PDPK1积极coexpression相关性(图6 (g))。分析结果的影响,过度的circANXA2上皮钙粘蛋白标记的表达水平和间叶细胞波形蛋白在肺癌细胞标志显示,过度的circANXA2抑制钙粘蛋白但调节波形蛋白的表达。这些结果表明,circANXA2可以促进肺癌细胞的EMT(数字6 (h)- - - - - -6 (j))。

4所示。讨论

肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因之一,可分为nonsmall细胞性肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC) (28,29日]。

目前,circRNA的角色“海绵”吸附microrna是研究最广泛的30.]。CircGFRA1 NSCLC组织中高度表达,调节非小细胞肺癌细胞的增殖绑定mir - 183 - 3 - p和调节PIK3 / Akt信号通路(31日]。Hsa_circ_0012673在肺癌组织和细胞系中,充当一个竞争内源性RNA。Hsa_circ_0012673结合mir - 320 a,从而调节LIMK1表达并促进肺癌的进展(32]。CircNT5E也显著调节在非小细胞肺癌细胞系和肺癌组织。CircNT5E促进癌细胞的扩散通过海绵mir - 134 (33]。然而,circANXA2在肺癌中的作用尚不清楚。进一步研究circANXA2在肺腺癌的生物学功能是必要的。在目前的研究中,circANXA2的表达水平显著增加在肺腺癌组织,而在邻近的正常组织。circANXA2的差别,对这些基因的抑制肺癌细胞的增殖和circANXA2细胞克隆的数量显著降低的价格相比对照组。差别之后对这些的circANXA2差别的影响对这些细胞细胞凋亡,细胞凋亡率显著增加si-circRNA组。这些结果的差别表明,对这些circANXA2可以提高肺癌细胞的凋亡能力。生物信息学分析表明,circANXA2和miR-33a-5p可能互动互补的区域。

microrna的异常表达参与肿瘤恶化[34,35]。通过抑制靶基因的功能,microrna发挥重要作用在肿瘤细胞增殖的协调,侵略,invascular灌注,生存,溢出,和殖民36]。张等人的实验结果表明,miR-33a人体乳腺癌组织中的表达显著降低正常组织相比。此外,一个协会之间被发现miR-33a表达降低,增加乳腺癌患者淋巴结转移(37]。在目前的研究中,我们发现,与正常肺上皮细胞相比,miR-33a-5p和PDPK1表达水平明显低和高的肺癌细胞,分别。miR-33a-5p和PDPK1 coexpression水平负相关在癌症组织。我们预测,针对这两个之间的关系。结果表明PDPK1 miR-33a-5p的是一个潜在的目标。荧光素酶报告基因的结果支持这一预测,和进一步的实验证明了监管的miR-33a-5p PDPK1的表达。此外,miR-33a-5p的过度表达可以扭转circANXA2的促进效果。这些结果表明,miR-33a-5p扮演一个肿瘤抑制肺癌的恶性发展。

PDPK1活动的抑制与反义RNA或小分子抑制剂PDPK1凋亡或抑制癌细胞的扩散38- - - - - -40]。PDPK1在增长和发展中起着重要的作用18]。在目前的研究中,PDPK1肺癌组织中表达调节。进一步的实验表明,PDPK1 miR-33a-5p的目标基因,推倒circANXA2-reduced PDPK1表达式。

本研究有一些缺点。首先,是否一个重要的上游调控机制仍然存在circANXA2尚不清楚。尤其是它的起源的父母基因是否与监管途径交互是未知的。龙头、轴的终端,我们发现,下游信号通路由PDPK1和监管机制对肺腺癌的恶性进展的影响仍有待澄清。最后,进一步研究其他microrna的角色或RBPs circANXA2除了miR-33a-5p的目标是必要的。

5。结论

circANXA2的影响肺腺癌的增殖和凋亡细胞和可能的机制进行了探讨。结果表明,circANXA2发挥监管作用主要通过miR-33a-5p PDPK1和下游靶基因。这一发现可能提供有用的信息,一个潜在的目标为肺腺癌的诊断和治疗。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者。

伦理批准

本研究回顾和陕西省肿瘤医院伦理委员会的批准,并且符合《赫尔辛基宣言》。

同意

所有患者签署知情同意表格。

信息披露

金赵是第一作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

燕榉和本元的贡献同样工作。YJ和病人生理分析和解释数据。写手稿YJ是一个主要因素。XRS和生理改变证实了原始数据的真实性。负责设计和监督的研究,以及修改的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。