DOK7抑制细胞增殖、迁移和入侵乳腺癌通过PI3K / PTEN / AKT通路

文摘

最近,越来越多的关注已经支付给下游激酶7的表达之间的相关性(DOK7)和各种肿瘤的发生和发展。在这项研究中,我们澄清DOK7在乳腺癌的影响。首先,我们表明,DOK7表达明显减少乳腺癌组织和低水平的DOK7与更积极的行为和预后差的患者。此外,DOK7各种乳腺癌细胞系的表达低于人类的非癌变MCF-10A细胞。DOK7超表达的抑制增殖、迁移和入侵,而沉默DOK7表达促进了乳腺癌的恶性肿瘤。此外,过度DOK7抑制肿瘤增殖和肺转移的动物模型。最后,探讨可能的信号机制,我们首先发现p-AKT蛋白质水平是极其表达下调和PTEN蛋白的水平显著调节后overexpressing DOK7在乳腺癌细胞。镇压的PTEN表达使用PTEN siRNA或SF1670 (PTEN抑制剂)获救tumor-inhibiting效应引起DOK7超表达,表明DOK7抑制增殖,迁移和入侵乳腺癌细胞虽然PI3K / PTEN / AKT通路。这些结果表明DOK7可能成为小说的差别,对这些基因的乳腺癌治疗的目标。

1。介绍

乳腺癌是最常发生的恶性肿瘤和癌症患者的死亡率高以及世界范围内(1]。最近,许多研究表明乳腺癌与多种因素有关,包括不同的生活方式,病毒感染,医疗条件和致癌基因(2- - - - - -7]。广为人知,但三阴性乳腺癌有巨大的入侵能力,这使得它远处转移(8,9]。尽管巨大的进步在乳腺癌治疗,转移仍然是最重要的死亡原因在乳腺癌患者10]。因此,它已成为一个重要的研究方向找到特定的分子,可作为早期诊断和预后标记和可以治疗的目标。

下游激酶(辩)蛋白家族,已经有七个成员,DOK1 DOK7 (11- - - - - -13),涉及细胞内信号转导通路的下游的受体酪氨酸激酶(rtk)。辩经蛋白质的结构相似性的氨基端收缩球蛋白同源性(PH)和phosphotyrosine绑定(PTB)域和c端结合SH2目标主题(14,15]。最近,DOK7基因和肿瘤之间的关系被注意。DOK7恶性肿瘤密切相关,包括肺癌和神经胶质瘤。最近的一项研究表明,低水平的DOK7负责在肺癌患者预后不良和DOK7扮演了重要的角色在细胞生长、迁移和入侵13]。另一项研究还显示,沉默的表达DOK7显著抑制神经胶质瘤的发展在细胞和动物模型(16]。然而,DOK7水平之间的联系和乳腺癌的起始尚未评估。

在我们最近的调查结果,显示DOK7的表达显著降低临床乳腺癌组织和低水平的DOK7不良临床结果和相关的乳腺癌患者的预后。此外,DOK7抑制扩散的过度表达,乳腺癌的入侵,和迁移。相反,推倒DOK7表达促进了乳腺癌的恶性肿瘤。机械,我们证实p-AKT的蛋白质含量显著降低,PTEN的蛋白质含量增加DOK7超表达组与对照组相比。然而,PTEN表达的镇压PTEN核或SF1670 (PTEN抑制剂)获救tumor-inhibiting效应引起DOK7超表达。我们证明DOK7抑制增殖、迁移和入侵通过PI3K / PTEN / AKT通路在乳腺癌细胞。

2。材料和方法

2.1。乳腺癌患者的kaplan meier绘图仪

我们使用kaplan meier绘图机(http://kmplot.com/analysis/)之间的关系来分析DOK7 mRNA水平和乳腺癌患者的预后。数据库已从临床癌症生存信息样本超过54000个基因在21癌症类型,其中包括乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌。系统6234乳腺癌患者生存的信息,覆盖临床因素如ER地位,公关状态,HER2状态、内在亚型,淋巴结状态、年级,TP53的地位,pietenpol亚型,化疗和放疗。在我们的研究中,我们检查DOK7 mRNA水平和预后之间的关系(包括总生存期(OS),复发存活率(RFS),和遥远的metastasis-free生存(时间)在乳腺癌样本使用kaplan meier绘图仪分析。

2.2。细胞系和人体组织

人类正常乳腺内皮细胞系MCF / 10和乳腺癌细胞株MCF-7 BT474, T47D, SKBR3, mda - mb - 231, hcc - 1937, - 1315和国家基础设施的细胞系获得资源(中国,北京)。MCF / 10细胞的培养基是内皮细胞培养基(美国ScienCell)。MCF-7、mda - mb - 231 T47D,总和- 1315细胞在DMEM培养基培养含10%胎牛血清(Hyclone)和1%青霉素和链霉素(Beyotime生物技术,中国)37°C公司为5%₂。BT474 SKBR3, hcc - 1937细胞培养在rpmi - 1640中含10%胎牛血清(Hyclone)和1%青霉素和链霉素(Beyotime生物技术,中国)37°C公司为5%₂。68年乳腺癌和匹配paracancer组织收集从2016年3月到2019年1月北京同仁医院病理系的。所有的标本都是北京同仁医院伦理委员会批准,并从每个病人知情同意提供。

2.3。细胞增殖

CCK8化验(Dojindo、日本)被用来分析细胞增殖。1×10⁴96 -孔板细胞培养24小时、48小时、72小时和96小时。孵化之后,10μL CCK8试剂的添加到每一个96孔板和孵化1小时。孵化后CCK8试剂,我们测量了OD值在450 nm。

2.4。建设稳定的细胞系

mda - mb - 231和SKBR3稳定细胞系转染pcDNA3.1-DOK7或质粒pcDNA3.1和选择嘌呤霉素为1个月。质粒是来自OBiO科技有限公司(上海,中国)。具体来说,细胞融合(70%)被播种到培养瓶,并使用Lipofectamine质粒进行转染2000(表达载体)48 - 72小时。然后,这些转染细胞被选5μg / mL嘌呤霉素为1个月。

MCF-7和SKBR3细胞株稳定沉默DOK7使用慢病毒成分构造技术;成分(DOK7成分或炒shRNA)获得GenePharma公司(上海,中国)。具体地说,293 t细胞(30% - -50%融合)被播种在6-well盘子和转染DOK7成分或炒shRNA 24小时使用Lipofectamine 2000(表达载体)。上层清液从转染293 t细胞收集过滤和添加到MCF-7 SKBR3细胞融合(50%)48小时,其次是嘌呤霉素(5μg / ml)选择了一个月。

2.5。Transwell化验

Transwell分析是用来分析肿瘤细胞的迁移和入侵。迁移试验,1×10⁵乳腺癌细胞被播种上24-well transwell钱伯斯(微孔),基底膜基质凝胶(BD生物科学)和培养24小时。入侵检测(2 - 5)×10⁵乳腺癌细胞与基底膜基质凝胶培养上24-well钱伯斯(BD生物科学)和孵化48小时。孵化后,细胞移动到24-well室的底部,然后用4%甲醛固定并与结晶紫染色试剂。

2.6。实时定量PCR(存在)

总RNA提取使用试剂盒RNeasy迷你工具包。总RNA (1µg)是reverse-transcribed使用逆转录系统(豆类)。执行中存在与SYBR绿色装备(豆类)。引物的PCR DOK7: 5′-TGCCAAGCGGATTCATCTTTG-3′(向前),5′-GACGATGCAGTCGAACAGGAA-3′(反向);和引物GAPDH: 5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′(向前),5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3(反向)。

2.7。免疫印迹分析

蛋白表达是利用免疫印迹试验检查。收集使用蛋白质消化的蛋白质缓冲(强里帕缓冲区(Beyotime生物技术,中国)和蛋白酶抑制(美国ThermoFisher))。然后,蛋白质含量是评估使用BSA工具包(美国ThermoFisher)。30μg蛋白样本添加到每一个车道,其次是在凝胶分离和转移到PVDF膜(微孔)。然后,膜被封锁的5%牛奶和孵化的主要抗体(稀释5% BSA) (anti-DOK7、Abcam ab75049, 1: 1000稀释;anti-AKT,细胞信号技术,# 4685,1:1000稀释;anti-p-AKT,细胞信号技术,# 4060,1:1000稀释;anti-PTEN,细胞信号技术,# 9188,1:1000稀释;和反β肌动蛋白,Bioworld BS6007MH 1: 5000稀释)一夜之间在4°C。第二天,孵化的二次抗体稀释3%的牛奶(细胞信号技术,1:5000稀释)进行室温下2小时。

2.8。异种移植肿瘤模型

前不久女性裸体小鼠河从北京获得至关重要的实验动物科技有限公司有限公司的主要肿瘤,mda - mb - 231稳定overexpressing DOK7或矢量控制细胞(5×10⁶细胞在50µL DMEM培养基)接种到乳腺时尚垫(MFP) 6裸小鼠,分别。肿瘤体积的公式如下:[(长度)×(宽度)×(长+宽/ 2)×0.526 =体积)。肿瘤的大小和老鼠的身体重量记录每三天。30天之后,肿瘤切除和体重。转移模型,DOK7-overexpressed或控制稳定的mda - mb - 231细胞(2×10⁵细胞在50µL PBS)的尾静脉注入5裸小鼠,分别。45天后,所有小鼠肺收集。PTEN抑制剂模型,控制稳定的mda - mb - 231细胞(5×10⁶细胞在50µL DMEM培养基)接种到乳腺时尚垫(MFP) 4裸体小鼠和DOK7-overexpressed稳定mda - mb - 231细胞(5×10⁶细胞在50µL DMEM培养基)接种到乳腺时尚垫(MFP) 8裸小鼠。当肿瘤明显,老鼠被随机分为三组:(i)向量/ DOMSO组,腹腔内注射DMSO (500µL)每天4老鼠;(2)DOK7 / DMSO组,腹腔内注射DMSO (500µL)每天4老鼠;和(3)DOK7 / SF1670集团SF1670腹腔内注射(10μ500年摩尔/公斤稀释µ每天在4老鼠[L DMSO)17]。21天之后,肿瘤切除和体重。后进行了动物实验的动物保健委员会北京同仁医院。

2.9。免疫组织化学

组织与4%甲醛固定24小时与石蜡和嵌入式,然后进行免疫组织化学。具体地说,幻灯片在抗原暴露的解决方案(pH值6.0)煮20分钟,阻止H为0.3%₂O₂20分钟。然后,幻灯片和5% BSA和紧随其后孵化的孵化主要抗体(抗- ki - 67 (Abcam) ab15580, 1:200稀释;anti-PCNA(增殖细胞核抗原,Dako) M0879, 1: 50稀释)一夜之间在4°C。第二天,孵化的二级抗体进行了37°C 1小时,其次是与民建联色原治疗。

2.10。统计分析

GraphPad Prism 7.0被用于制造所有图表和统计分析。双尾学生的t以及和生存率较被用于执行统计分析。值< 0.05是法官表示统计学意义。

3所示。结果

3.1。DOK7显著下调在乳腺癌组织和与临床结果相关联

询问DOK7水平之间的关系和乳腺癌患者的临床特征,我们比较的mRNA水平68年DOK7配对正常和乳腺癌组织。在匹配的乳房组织对从68年乳腺癌(表获得1),DOK7表达明显减少肿瘤(图1(一))。调查是否DOK7水平与乳腺癌患者的攻击行为,我们分析了DOK7水平和不同的临床结果之间的关系(TNM阶段,肿瘤直径,和淋巴结转移)。结果表明,乳腺癌组织的高级阶段(III / IV阶段)表达水平显著降低DOK7比I / II阶段子组(图1 (b))。同样,DOK7 mRNA表达显著降低大型肿瘤(T1阶段,肿瘤直径> 2 cm)与肿瘤直径≤2厘米(T2/3阶段,图1 (c))。此外,高患者淋巴结转移(N1/2/3)组较低的表达比低DOK7淋巴结转移(N0)(图1 (d))。这些数据表明,低DOK7表达与乳腺癌患者更积极的行为。

3.2。低DOK7表达会导致乳腺癌患者的预后不良

进一步确认的影响DOK7表达在乳腺癌患者临床预后,我们也认为DOK7水平之间的关系和生存的乳腺癌患者kaplan meier绘图仪(KMplot,http://kmplot.com/analysis/)。低水平的患者DOK7差总生存期(OS) (< 0.001)626年乳腺癌患者(314个样本在低水平的DOK7和高水平的312个样本DOK7)(图2(一个))。此外,使用类似结果复发存活率(RFS) (< 0.0001)1764年乳腺癌患者(886个样本在低水平的DOK7和高水平的878个样本DOK7)(图2 (b))。同样,更高水平的DOK7最好遥远metastasis-free生存时间)比那些低DOK7表达式(< 0.0001)664年乳腺癌患者(333个样本在低水平的DOK7和高水平的331个样本DOK7)(图2 (c))。所有这些数据表明,低水平的DOK7导致糟糕的乳腺癌患者的预后。

3.3。DOK7超表达的抑制增殖、迁移和入侵乳腺癌细胞

在我们确定了DOK7的水平和临床结果之间的关系在乳腺癌患者预后,我们问的mRNA水平DOK7各乳腺癌细胞系(BT474 MCF-7笔——1315年,hcc - 1937, T47D, SKBR3, mda - mb - 231)和人类的非癌变细胞线(MCF-10A)。结果表明,乳腺癌细胞的mRNA水平的DOK7远低于MCF-10A细胞中存在试验(图3(一个))。mda - mb - 231和SKBR3细胞最低DOK7所有乳腺癌细胞中表达,所以我们在这两个细胞系中也是DOK7。转染和选择后,转染效率表明DOK7的表达在超表达组mda - mb - 231和SKBR3细胞信使rna和蛋白质含量显著(图评估与向量组3 (b)和3 (c))。此外,我们发现在mda - mb - 231细胞增长和SKBR3细胞被DOK7压抑过度CCK8试验(图3 (d))。transwell测定结果表明,DOK7抑制过度的迁移和入侵在mda - mb - 231和SKBR3细胞(图3 (e)和3 (f))。

3.4。推倒DOK7促进增殖、迁移和入侵乳腺癌细胞

从上面的结果,MCF-7和总和- 1315细胞DOK7最高表达在乳腺癌细胞;我们删除DOK7表达式通过使转染shrna在这两个细胞系。沉默DOK7 MCF7和总和- 1315细胞表达显著降低DOK7表达式被发现使用中存在和免疫印迹分析(图4(一)和4 (b))。此外,DOK7损耗显著提升MCF7和总和- 1315细胞的细胞生长与对照组相比被发现使用CCK8试验(图4 (c)),这表明沉默DOK7表达促进了细胞乳腺癌细胞的生长在体外。此外,MCF7和总和- 1315细胞与DOK7 shrna迁移和入侵能力表现出高于控制细胞(图4 (d)和4 (e))。这些数据显示,推倒DOK7表达的乳腺癌细胞导致促进增殖、迁移和入侵。

3.5。DOK7抑制肿瘤生长和转移的乳腺癌在活的有机体内

我们已经证实击倒DOK7抑制细胞增殖和细胞入侵和迁移能力在体外(图3)。接下来,进一步验证的影响DOK7超表达在肿瘤发生的财产在活的有机体内的乳房时尚垫(MFP) 12裸体小鼠接种DOK7-overexpressed或控制mda - mb - 231细胞。肿瘤的增长明显慢于DOK7进行靶向治疗组比向量组(图5(a))。肿瘤大小和肿瘤重量在DOK7小得多的超表达组与对照组相比(图5(b)和5(c))。此外,免疫组织化学检测显示,DOK7-overexpressed mda - mb - 231细胞蛋白质含量较低的ki - 67和PCNA,常见的扩散标记(图5(d)),表明DOK7过度抑制细胞增殖在活的有机体内。我们下一个测试转移行为改变使用尾静脉注入mda - mb - 231细胞。有一个戏剧性的减少量化DOK7肺转移结节的过表达组(图5(e)和5(f))。综上所述,这些数据提出DOK7至关重要的表达升高抑制肿瘤进展和转移的乳腺癌。

3.6。DOK7压制扩散、迁移和入侵乳腺癌通过PI3K / PTEN / AKT通路

探讨分子机制如何DOK7表达介导肿瘤的生长和转移,我们检查PI3K / PTEN / AKT pathway-associated蛋白质DOK7-overexpressed或控制mda - mb - 231和SKBR3细胞。实验结果发现,p-AKT非常表达下调的蛋白质含量和PTEN的蛋白质水平显著调节DOK7超表达组与矢量控制相比组(图6(a))。然后我们调查了PI3K / PTEN / AKT通路是否负责DOK7-induced抑制细胞生存能力,迁移和入侵。要做到这一点,我们首先撞倒PTEN表达的核方法在mda - mb - 231和SKBR3细胞(图6(b))。有趣的是,过度的DOK7克制在mda - mb - 231细胞增殖和SKBR3细胞,而镇压PTEN表达的使用PTEN siRNA或SF1670 (PTEN抑制剂)获救tumor-inhibiting效应引起DOK7超表达(图6(c))。此外,我们还执行transwell化验,发现抑制PTEN表达的蛋白PTEN siRNA或SF1670也可以逆转DOK7过度,调解迁移和入侵抑制(图6(d)和6(e))。这些数据表明DOK7抑制增殖、迁移和入侵乳腺癌细胞通过PI3K / PTEN / AKT通路。最后,为了进一步证实DOK7是否能抑制乳腺癌的肿瘤生长在活的有机体内,我们将mda - mb - 231细胞注射到乳房时尚垫的裸体小鼠和DMSO溶液处理或SF1670 (10μ摩尔/公斤)[18]。结果表明,肿瘤的体积和重量减少DOK7超表达组与控制向量组,而抑制PTEN表达使用PTEN抑制剂SF1670获救DOK7 overexpression-induced肿瘤生长(图6(f) -6(h))。

4所示。讨论

酪氨酸激酶(辩)家族的下游由七名成员组成,DOK1 DOK7,其中一些有影响的负调控肿瘤信号通路(15,19- - - - - -21]。最近,一些研究其他的辩经蛋白质如DOK1, DOK2, DOK6参与乳腺癌的发生和发展。在乳腺癌样本,DOK1的mRNA水平显著降低肿瘤与邻近正常组织和DOK1表达之间的相关性DOK1表达式和c-cerbB-2状态(22]。DOK2的负面表达与预后不良,不良285例乳腺癌患者的临床参数,表明DOK2可以乳腺癌预后的一个独立因素23]。塔玛拉等人表明DOK6作为肿瘤抑制在人类乳腺癌[24]。也有显著减少DOK3肺癌和激进的组织细胞的肉瘤25,26]。辩经的其他子群家人,DOK4和DOK5组成的,主要是表达在神经系统27,28]。

近来,越来越多的关注与DOK7协会和癌症的恶化。先前的研究表明,DOK7在多种肿瘤组织表达下调,低水平的DOK7肺癌患者的不良预后密切相关(9,29日]。张等人还发现,高水平的急性髓系白血病(AML)患者DOK7 DOK7再操作系统比低表达者(18]。最近的一项研究表明,DNA甲基化DOK7被发现在乳腺癌样本(血液从乳腺癌患者乳腺癌肿瘤,和乳腺癌细胞系),这表明DOK7启动子甲基化可能成为小说在早期发现乳腺癌的分子生物标志物(18,25]。

越来越多的证据表明,在乳腺肿瘤发生DOK7扮演着重要角色。在这里,第一次,我们展出DOK7表达在乳腺癌组织和低水平的降低DOK7是更积极的临床行为和乳腺癌的预后差。在这里,我们过表达DOK7表达式,发现DOK7抑制增殖和转移在体外和在薇芙o。相反,推倒DOK7促进了恶性肿瘤的表达在乳腺癌细胞在体外。

目前,有几种机制DOK7弱表达的肿瘤。DNA甲基化DOK7乳腺癌样本中发现,包括血液、肿瘤组织和培养细胞,它被认为是机制差别的一个对这些DOK7表达式(16]。的主要成员之一,此外,DNMT1 DNA甲基转移酶(DNMT)的家庭,是一个DNA甲基转移酶和DOK7甲基化是通过增加DNMT1表达增强,DOK7的差别,导致了对这些基因的表达(25]。最近的一项研究表明DOK7蛋白质的表达是一种蛋白激酶和ERK途径(29日]。然而,定义具体的分子机制仍然不佳。

PI3K / AKT / PTEN启动与发展是一个重要的途径在不同肿瘤中扮演着很重要的角色在促进肿瘤的生长和抑制细胞凋亡的肿瘤细胞(30.,31日]。著名肿瘤抑制剂,PTEN的PTEN / PI3K / AKT通路的关键成员。探讨PTEN / PI3K / AKT通路是否参与DOK7-induced细胞生长,入侵,在乳腺癌细胞和迁移,我们证实p-AKT的蛋白质水平非常低,PTEN蛋白水平明显高于DOK7超表达组比矢量控制组在乳腺癌细胞。镇压PTEN的表达由PTEN siRNAs或SF1670 (PTEN抑制剂)获救的tumor-inhibiting效果DOK7超表达,表明DOK7抑制增殖,迁移和入侵乳腺癌细胞虽然PI3K / PTEN / AKT通路。

总之,本研究显示,DOK7低表达在乳腺癌组织,这表明DOK7是一个潜在的肿瘤抑制基因。具体来说,我们证实DOK7的低水平与不良临床结果和乳腺癌患者的预后不良;因此,DOK7有潜在价值的分子生物标志物在预后预测乳腺癌。机械的研究表明,DOK7抑制增殖、迁移和入侵乳腺癌细胞通过PI3K / PTEN / AKT通路。这些结果的差别表明,对这些小说DOK7可能成为乳腺癌治疗的目标。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

这些作者声明没有利益冲突。

确认

本研究北京市政府财政支持的特殊医院临床医学发展的资金,中国(ZYLX101814)和关键医学专业的北京医院管理局Yangfan项目(ZYLX201814)。

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