文摘
食管癌(光电子能谱)是最常见的类型的恶性肿瘤之一,令人沮丧的预后。TCGA目的本研究应用数据集从地理和创建一个对预测预后签名能谱患者的临床结果的基础上circRNA-associated监管网络。方法。监管网络与能谱circRNAs转录组数据的基础上建立,microrna, mrna。功能注释实施进一步探索能谱的机制。考克斯相对回归方法应用于创建一个签名的风险。此外,签名的免疫微环境研究利用CIBERSORT算法。结果。基于27 DEcircRNAs, 65 DEmiRNAs, 780 DEmRNAs circRNA-miRNA-mRNA网络终于成立了。功能性浓缩出土,监管网络可能参与磷酸化负监管、MAPK通路和PI3K / AKT通路。本研究建立了一个风险得分基于七个免疫相关基因(irg)签名(MARP14, RASGR1 PTK2, HMGB1、DKK1 RARB,和IGF1R),验证了其可靠性。一个稳定和精确的计算图表结合的几种风险得分与临床特征。此外,我们还观察到的风险模型与免疫细胞浸润有关。结论。我们的研究成功创建了一个circRNA-associated监管网络和进一步发展的几种模型预测能谱患者的临床结果以及评估他们的免疫状态。
1。介绍
食道癌(光电子能谱)是最常见的类型的恶性肿瘤,其死亡率排名第六的所有肿瘤(1]。GLOBOCAN 2018年数据显示,据估计,大约有572000新发病例光电子能谱和508000人死亡发生在那一年2,5年总生存期(OS)率仅仅是15 - 25% (3]。尽管提高能谱的诊断和治疗,大多数病人是中间或晚期才诊断因为阴险的早期症状的性质。因此,目前迫切需要更精确和有效的目标援助能谱诊断和个性化治疗的病人。
定义为内生非编码rna, CircRNAs单链,共价闭环结构。封闭的结构是由反向拼接的5′和3′端线性rna,使其更耐核酸的核酸外切酶,以及更稳定的组织和等离子体相比,线性rna (4,5]。2011年,电抗器,假设第一次被提出,暗示circRNAs负调节microrna的表达和影响他们的交互与mrna (6]。近年来,大量研究表明circRNAs的致癌作用。CircRNA 100146年,例如,可以通过调节调节SF3B3 mir - 361 - 3 - p,从而促进肺癌的发展(7]。CircNRIP1肿瘤促进剂,可能会影响AKT1表达在胃癌绑定mir - 149 - 5 - p (8]。同样,CircSETD3报道明显在鼻咽癌中,可显著提高癌症细胞入侵和迁移9]。许多研究表明,某些circRNAs cancer-suppressive效果。CircTADA2A-E6抑制乳腺癌发展目标mir - 203 - 3 - p (10]。此外,circCUL2有可能限制胃癌的进展通过自噬激活介导mir - 142 - 3 - p / ROCK2 [11]。
目前,8日版的光电子能谱TNM分期是临床上使用的主要工具来评估患者的预后光电子能谱(12]。然而,这种方法是通用和有限的个体差异。因此,迫切需要开发新的方法,可以准确地评估能谱的生存。最近,基于免疫相关基因的信使rna基因签名已经成为研究热点预测患者的预后。例如,陈等人开发了一个免疫特征预测头颈癌患者的预后(13]。此外,预后指数模型,建立了11个免疫相关基因在肝细胞癌14]。
尽管先前的研究已经证明了几种模型的性能在许多恶性肿瘤中,很少有考虑使用免疫基因为光电子能谱创建一个预后风险模型。
在本研究中,我们成功地构造了一个TCGA食道癌症相关的龙头、网络使用地理数据集和数据库。我们进一步发展风险的几种签名通过选择七个免疫相关基因从龙头、网络。最后,我们进一步发现签名基因的表达模式在体外分析。我们的研究不仅提供了一个最优预测模型来预测能谱病人的操作系统也能谱治疗开辟了一个新的见解。
2。方法
2.1。数据收集
光电子能谱的circRNA-seq数据情况下(GSE131969)收集从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。TCGA miRNA-seq数据得到的(https: / portal.gdc.cancer.gov /)。mRNA转录组数据(GSE53625)和临床数据也从地理数据库。从ImmPort提取的几种生物标记(https: /www.immport.org/)。
2.2。筛选差异表达的rna
limma包应用于确定差异表达circRNAs (DEcircRNAs)。日志(褶皱变化(FC)) > 3和adj。 被用来过滤DEcircRNAs。我们使用了磨边机包筛选差异表达microrna (DEmiRNAs)和mrna (DEmRNAs),分别。截止值DEmiRNA和DEmRNA日志(褶皱变化(FC)) > 0.5和adj。 。
2.3。CircRNA-Associated监管网络的发展
从circBase circRNAs的基本信息是下载(http://circbase.org/)。CSCD的在线工具(http://gb.whu.edu.cn/CSCD/)执行获得有针对性的microrna circRNAs,这些潜在的microrna DEmiRNAs测定。接下来,microrna的关系和mRNA TargetScan生成,miRDB, miRTarBase预测工具(15- - - - - -17]。之后,这些目标与决定DEmRNAs mrna被分割的。最终,由Cytoscape circRNA-associated监管网络成立。
2.4。功能富集分析
基因本体论(去)是一个生物信息学方法旨在衡量基因功能。KEGG数据库,整合基因组,化学和生物系统的信息,被广泛用于集成和解释数据集生成的高通量实验技术。发现的功能机制的监管网络,和KEGG方法进行, 被认为是显著的。
2.5。建设CircRNA-Based预后签名
我们首先收集immune-relevant基因(irg) ImmPort数据库,这是一个公共数据库提供一个最新的基因对伊斯兰革命卫队的列表和功能信息。然后,伊斯兰革命卫队和识别之间的重叠基因mrna从circRNA监管网络检索利用来确定差异表达尾声。发展良好的风险模型,GSE53625集分为培训组和测试组在6:4比例。预后尾声时被首次发现的一元回归方法。缩小的模型过度拟合,套索回归。最后,多变量Cox方法是创建一个签名来预测系统进行能谱的病例。病人的风险评分是由以下方程:风险评分=基因1×系数表达式1 + 2×系数2…+基因表达n×系数表达式n,系数n代表了回归系数。测试组,整个队列,TCGA设置用来确认模型的性能。
2.6。建立列线图
估计预后的独立能力模型,进行单变量和多变量Cox方法。光电子能谱的诺模图预测系统是由结合临床特征和预后模型。为了验证这个签名的预测能力,我们绘制校准地图和ROC曲线。
2.7。免疫细胞渗透分析
CIBERSORT是一个生物信息学方法识别免疫细胞的渗透。在本例中,我们输入参考基因资料和分析每个细胞的浸润程度在22日类型的肿瘤浸润免疫细胞(抽搐)。
2.8。基因集富集分析
我们应用GSEA检查潜在的生物功能相关的高危患者的签名。基因集的标志和KEGG数据库从分子获得签名。基因集规范化P值小于0.05被认为意义重大。
2.9。细胞培养
两个人类能谱细胞系(kyse - 150和Eca109),以及一个正常食管上皮细胞系(HEEC),提供了从中国科学院(中国上海)。光电子能谱中培养细胞和HEEC rpmi - 1640中有10%胎牛血清(青霉素、链霉素的边后卫)和1%与5%的公司2在37°C。
2.10。RNA提取和存在
总RNA从利用RNA-easy孤立的细胞样本中分离出试剂(Vazyme生物技术),由PrimeScript然后逆转成cDNA混合试剂(豆类)。SYBR绿色预混料(Vazyme生物技术)是准备使用PCR系统。个人的价值终于标准化到GAPDH基因表达水平。表示基因的引物序列显示在补充表S1。
2.11。统计分析
kaplan meier法来评估风险两组之间的临床结果的差异。此外,接受者操作特征(ROC)分析检验模型的可靠性。所有统计数据分析了使用GraphPad 8.0 R软件4.0版本。
3所示。结果
3.1。识别DEcircRNAs、DEmiRNAs DEmRNAs
共有28 DEcircRNAs,包括15个高表达circRNAs circRNAs和13个低表达,GSE131969数据集(图中标识1)。我们排除了hsa_circ_0001336因为它CSCD数据库中不存在。在执行CSCD在线工具之后,我们确定了1140年可能针对这些27 circRNAs microrna。在表格内DEmiRNAs TCGA的检索数据库,只剩下65 microrna。然后我们预测潜在的mrna的目标这65 DEmiRNAs使用TargetScan miRDB, miRTarBase。这些候选人mrna DEmRNAs选自GSE53625交叉,导致780个基因共享。
3.2。龙头、建设网络
总共27个DEcircRNAs 65 DEmiRNAs和780 DEmRNAs终于决心建立一个由Cytoscape circRNA-associated网络软件(图3.82)。
3.3。功能富集分析
如图3(一个)重要的功能不仅是Wnt-related通路,消极的磷酸化调节,和负调控蛋白质的磷酸化。KEGG显示肿瘤途径极大地丰富,包括MAPK通路,PI3K-AKT通路,Ras途径(图3 (b))。
(一)
(b)
3.4。在训练集建设CircRNA-Based签名
我们随机GSE53625包含179例分为内部培训和验证系列在6:4比例。伊斯兰革命卫队是重叠的DEmRNAs电抗器,网络上面所提到的,在64年产生的差异表达尾声时依然存在。这些基因进一步进行单变量Cox方法,套索考克斯和多变量Cox分析连续建立seven-IRG签名(表1)。风险得分= 0.745 + 0.363××HMGB1 PTK2 + 0.261×IGF1R + 0.228×RARB + 0.149×DKK1 - 0.192×RASGRP1 - 0.353×MAPK14。正如所料,高危组的临床结果显著低迷比低风险组(图4(a))。模型的预测精度评估曲线下的面积(AUC)中华民国(图4(e))。此外,我们探讨了分布的风险价值和每个病人的生存结果(图4(我))。
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(j)
(k)
(左)
3.5。CircRNA-Based签名的验证
我们建议的签名验证是有效的内部测试时队列。我们发现高危能谱病人显示操作系统比它的对手(图4(b))。相似的结果也证实了在整个集和TCGA队列(图4(c))。中华民国的AUC是计算估计的可靠性模型在上面的人群(数字4(f) -4(h))。在最后,风险评分的分布和临床结果的每个能谱例图所示4(j) -4(左))。
3.6。基于风险的诺模图模型的建立
评估预后的独立的权力签名,考克斯相对风险回归方法进行(数据5(一)和5(b))。我们发现只有风险评分非常有意义的预测系统在单变量和多变量Cox方法。此外,诺模图是由结合的风险模型和临床参数预测能谱病例的临床结果(图5(c))。校准曲线显示良好的一致性预测和实际生存率(图5(d))。AUC值达到了0.73,0.76,0.75,1、3和5年(图5(e))。
(一)
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(e)
3.7。相关分析的免疫细胞浸润和风险评分
通过应用CIBERSORT算法,一个酒吧(图6(一))代表执行差异之间的渗透程度的22种抽搐两个风险组。进一步确认风险签名和免疫细胞浸润的关系在光电子能谱,皮尔逊相关分析。结果表明,M0巨噬细胞、CD4记忆+T细胞,激活NK细胞有一个积极的协会与风险评分,而CD8+T细胞和浆细胞表现出负相关风险评分(图6 (b))。
(一)
(b)
3.8。预后CircRNA-Based签名在免疫抑制微环境的性能
最近,癌症免疫周期,描绘了肿瘤细胞的免疫监视,在癌症免疫治疗已成为一个研究重点。它包括一系列的程序包括癌症细胞抗原释放(18]。我们选择54负调控基因在癌症免疫周期的跟踪肿瘤Immunophenotype网站进行进一步分析。接下来,我们分析了负调控基因之间的关系和我们的签名。结果表明,DNMT1、NECTIN3 SMC3风险评分的正相关,而NCR3呈现相反的趋势(图7)。
(一)
(b)
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3.9。GSEA
如图8(一个)、血管生成、IL2 / STAT5通路,炎症反应,氧化磷酸化,PI3K / AKT / MTOR通路,及通路在例高危分数大大丰富。我们还观察到六KEGG通路被激活在高危人群,包括MTOR通路和鉴定及途径,符合标志(图的结果8 (b))。
(一)
(b)
3.10。签名检测基因表达的细胞系中存在化验
最后,一个圆形RNA-associated龙头、子网是建基于我们的几种风险签名(图9)。随后,我们进一步研究了七个特征基因的表达水平在HEEC, Eca109, kyse - 150使用中存在。结果表明,HMGB1、PTK2 IGF1R在Eca109表达水平显著升高,在HEEC kyse - 150和表达水平较低。相反,RASGRP1、MAPK14 RARB, DKK1是低表达Eca109和kyse - 150和高度表达HEEC(图10)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
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(g)
4所示。讨论
光电子能谱排名第八和第六癌症发病率和死亡率,分别与高转移和复发1]。因此,迫切需要利用能谱的强大生物标志物。越来越多的证据表明,circRNAs可能与microrna的相互作用,导致相应的减少microrna的活动(19]。microrna行为主要在mrna,但circRNA竞争过程阻碍目标的规定由microrna基因表达,进而影响肿瘤的形成,发展,和转移。例如,hsa_circ_0006168可以提高ESCC细胞生存能力和转移通过绑定mir - 100 (20.]。所发现的孟et al ., CIRS-7可以加快发展ESCC通过绑定mir - 876 - 5 - p和移植MAGE-A家族基因(21]。此外,circGSK3β据报道,作为一个指标的预后光电子能谱(22]。因此,circRNA可能成为光电子能谱治疗的新分子的目标。
我们确定了27 DEcircRNAs 65 DEmiRNAs, 780 DEmRNAs从地理,TCGA,和CSCD数据库,进而建立一个ESCA-associated龙头、网络。根据几种签名,我们还创建了一个circRNA-miRNA-mRNA子网。王先生和他的同事们证明hsa_circ_0005654早期胃癌标本有更高的表现比在正常情况下(23]。hsa_circ_0001313也叫circCCDC66,已被证明在胃癌有促进作用,结肠癌,肾脏癌和肺癌24- - - - - -27]。然而,其他六个circRNAs尚未研究。因此,这些circRNAs肿瘤的作用,特别是在光电子能谱,需要在未来研究出土。
发现龙头、网络的底层机制,我们实现了一个从网络信使rna的功能注释。结果表明,Wnt-related通路,消极的磷酸化调节,负调控蛋白磷酸化的极大丰富。浓缩的KEGG信号通路建议肿瘤通路被激活MAPK通路、PI3K-AKT通路,Ras途径。MAPK信号通路的基本功能是调节细胞生长、存活和分化。作为一个最明显的信号通路在肿瘤生物学的研究中,其致癌效应异常激活已经证明在许多肿瘤,包括食道癌(28]。的机制PI3K-AKT信号通路促进癌症发展可能包括以下:细胞增殖、代谢改变,抑制自噬,促进EMT (29日]。目前,PI3K承诺作为一种新的治疗选择在肺癌,头颈部癌,乳腺癌[30.- - - - - -32]。同样,沉默G3BP1街区的发展通过Wnt /光电子能谱β连环蛋白通路(33]。王所透露的et al ., SOX9可以抑制PI3K-AKT通路ESCC通过阻断mir - 203转录(34]。此外,miR302a抑制能谱细胞生存能力通过MAPK信号通路(35]。
在目前的研究中,考克斯相对回归和套索回归进行建立签名7尾声时,包括HMGB1 PTK2, RASGRP1, MAPK14, IGF1R RARB, DKK1。HMGB1 chromatin-associated蛋白质,据报道ESCC调节细胞增殖和辐射敏感度36]。迪和他的同事注意到,HMGB1的超表达可能促进细胞照射后抗辐射性。PTK2,也称为FAK,发现促进ESCC的转移细胞通过mir - 4324 / FAK通路(37]。所显示马et al .,高IGF1R表情调节细胞增殖和细胞凋亡,表明它可以作为一个重要的致癌基因在食管癌38]。此外,Lyros等人发现的DKK1 upregulation食管腺癌肿瘤的生长和发展提高AKT-phosphorylation和Wnt轴(39]。
最近,免疫细胞已被证明肿瘤环境中发挥核心部分(40,41]。此外,免疫细胞的渗透特征作为一个可靠的食管癌的预后因素。先前的报道表明,高渗透水平M2巨噬细胞(42,43和亚群44)是肿瘤发展强有力的证据和转移。相反,舒马赫等人发现,增加CD8的浓缩+T细胞是一个良好的预后指标的临床结果(45]。我们发现CD8+T细胞与风险分数负相关,与假设一致的是,大量的CD8很高+T细胞可能表明一个更好的临床结果。总之,我们的研究强调了保持特定的免疫细胞在肿瘤免疫治疗的重要性。此外,我们发现风险评分也与中投公司负监管标记的表达有关。DNMT1属于DNA甲基转移酶家族,其过度识别在人类t细胞,b细胞,髓系恶性血液病,表明DNMT1可能在肿瘤的维护起到至关重要的作用[46,47]。Nectin-3粘连蛋白家族成员,参与调节粘附连接的形成和被报告一种新型生物标志物在肿瘤发生。它也表明,Nectin-3可以通过相互作用导致淋巴细胞外渗Nectin-2 [48]。SMC3的功能(染色体结构维护3)描述了诱导肿瘤发生,和它的表达可以在CD8表达下调+T细胞免疫治疗后(49]。
然而,这项研究仍有一些局限性。首先,电抗器,网络的建设主要是基于生物信息学分析,及其调控机制需要进一步的实验。此外,相关分析的结果之间的签名和免疫细胞浸润和中投公司负监管基因需要在额外的群组研究中进行验证。
5。结论
这项研究确定一系列DEcircRNAs, DEmiRNAs, DEmRNAs和建立一个在光电子能谱ESCA-associated网络。此外,我们成功地开发了一个相关的几种预测模型,该模型可以准确预测临床结果,镜子免疫微环境,并提供个性化的治疗光电子能谱的病人。
数据可用性
所有这些数据集生成的研究可以发现在癌症基因组图谱(https://portal.gdc.cancer.gov/)和NCBI基因表达综合(GSE131969和GSE53625)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
古银和SH设计和写的手稿。JX和我分析了研究数据。JT和KZ回顾和修订后的手稿。所有作者同意最后的手稿。
补充材料
补充表1:引物用于存在。(补充材料)