文摘
多发性骨髓瘤(MM)骨髓疾病的特点是溶骨的骨组织破坏导致骨痛、骨折、椎崩溃,和脊髓受压的患者。在最初诊断毫米,几乎80%的病人患有骨疾病。早期诊断和干预毫米骨病可能提高治疗效果和患者的生存。新的临床前模型需要开发新的诊断标志物的骨骼结构变化尽可能早的疾病。在这里,我们报告一个概念验证,同系的,intrafemoral MOPC315。BM MM小鼠模型只是成熟的BALB / c小鼠早期变化的检测和表征MM-injected动物的细胞外基质(ECM)。生物荧光成像(BLI)体内证实骨髓瘤移植与高100%的动物肿瘤细胞接种后21天内破骨细胞活动。积极的早期迹象骨营业额被高分辨率观察外骨表面microcomputed断层扫描(microCT)。同步加速器相影像微型计算机断层扫描(PCE-CT)显示本地微体系结构差异突出许多活跃的站点的侵蚀和新骨千分尺规模。相关的背散射电子成像(BSE)和共焦激光扫描显微镜可以直接比较的矿化和nonmineralized矩阵皮质骨的变化。 The osteocyte lacunar-canalicular network (OLCN) architecture was disorganized, and irregular-shaped osteocyte lacunae were observed in MM-injected bones after 21 days. Our model provides a potential platform to further evaluate pathological MM bone lesion development at the micro- and ultrastructural levels. These promising results make it possible to combine material science and pharmacological investigations that may improve early detection and treatment of MM bone disease.
1。介绍
诊断为多发性骨髓瘤(MM)的患者中,80%已经患有MM骨病,表现出溶骨的或骨量减少,骨组织破坏严重疼痛和骨折的症状(1]。由于MM骨疾病发病率和死亡率高,和生活质量严重影响skeletal-related病态(1,2]。MM是很少可以治愈的,是第二个最常见的血液肿瘤在美国和欧洲的年龄调整患病率六每100000人/年,年龄69岁(3]。病理细胞克隆在骨髓中浆细胞分泌过量的单克隆免疫球蛋白。MM细胞广泛地渗入骨髓或成长为多个局部病变。在晚期,骨髓病变发展。MM细胞抑制成骨细胞分化和刺激破骨细胞功能(4)导致增加骨吸收和骨蚀穿孔骨骼病变特点以及骨量减少。当前黄金标准的治疗包括磷酸盐的使用,当地的辐照,整形干预(1]。到目前为止,MM的治疗没有成功地治疗骨骼病变或再生骨组织即使没有活动性疾病的迹象5]。迫切需要新的方法导致更好的检测和改善监测骨结构变化尽可能早的疾病过程,理想情况下之前公开的溶解病变发展。这对未来改进诊断是至关重要的,新颖的治疗发展,提高MM患者的生活质量,典型的老年病人。
临床前动物模型是必不可少的上面和制定新的诊断标志物。他们也必须更好地理解细胞外基质之间的相互作用和肿瘤细胞。尤其是对人类MM骨病,可靠的小鼠模型便于追踪病变形成,扩张,在疾病的早期阶段和本地化,因为他们进一步帮助基准和量化疾病严重程度。我们之前建立了小鼠MOPC315。BM MM模型(6]。广泛的溶骨的骨疾病证明5至8周后静脉注射肿瘤细胞在年轻6 BALB / c小鼠。老鼠重复地屈从于截瘫和骨髓MOPC315.BM的增长。Luc细胞(6]。
自MM在人口老龄化是普遍的,是很重要的检查只是成熟(成人)的骨头,骨头与年轻的发展很大的不同,在矿化组织自然经历了广泛的(重新)模型(7,8]。骨代谢,骨架构和适应性骨形成和吸收显著不同的成年老鼠的骨头与骨头的年轻老鼠(9]。较高的骨形成和吸收活动相比,年轻的(6周)成熟(16周)老鼠与更高频率不断增长的溶骨的骨转移在体内的乳腺癌和前列腺癌模型10]。这不过是非常不同的在人口老龄化主要受MM疾病,正常骨营业额很低的地方。因此需要一个伟大的小说,同系的MM骨病的只是成熟的模型。
在这里,我们描述一个intrafemoral (i.f)小鼠MM模型,疾病在哪里使用MOPC315.BM道。Luc细胞(6,11,12]。这同系的模型创建(i)在成年小鼠建立控制MM模型,(2)跟踪疾病的发展随着时间的推移,和(3)毫米疾病主要限制在一个特定的骨骼。我们进一步用模型(iv)关联MM移植体内生物发光成像(BLI)和(v),以方便使用多尺度高分辨率三维映射,多通道材料表征方法。
2。材料和方法
2.1。Intrafemoral注射和生物荧光成像(BLI)
26-week-old雌性BALB / c小鼠获得查尔斯河(Sulzfeld,德国)。地方当局批准所有动物实验(55.2 dms - 2532 - 2 - 31日Regierung Unterfranken,维尔茨堡,德国)。这项研究是依法进行更换,减少,细化(3 rs)原则。BALB / c小鼠注射PBS (n= 1)或105luciferase-positive MOPC315.BM。Luc细胞(n= 10)[6),直接进入右股骨髁部之间,通过膝表面,进入骨髓腔。老鼠牺牲在7天(n= 2),11天(n= 2),15天(n= 3),21天(n注射后= 3)。BLI体内执行确认MOPC315.BM。Luc细胞移植和监测肿瘤恶化随着时间的推移前面描述的(6]。老鼠通过颈椎脱位牺牲。PBS控制鼠标是牺牲了21天。MM骨骼疾病活动的严重程度量化使用生活图像4.4 (PerkinElmer,麻萨诸塞州,美国),和图表创建与棱镜7软件(美国圣地亚哥GraphPad)。腿节解剖,固定在4%多聚甲醛48小时,转移到70%的乙醇。
2.2。Tartrate-Resistant酸性磷酸酶染色(陷阱)
对于tartrate-resistant酸性磷酸酶(陷阱)染色,样品在增加浓度的乙醇脱水,沾染了0.02 wt. %罗丹明6 g(美国圣路易斯AppliChem),并且准备冷嵌入有机玻璃(PMMA) (Technovit 9100、贺利氏Kulzer Wehrheim,德国)。核复染色是通过使用梅尔的苏木精(MHS32,σ,德国)申请20秒,洗水,法蓝0.1%氢氧化铵。数字光学显微镜(VHX-S550E,日本基恩士、Neu-Isenburg、德国)是用于图像彩色部分。
2.3。Microcomputed断层扫描(MicroCT)成像
microcomputed断层扫描(microCT)成像、样本保存在乙醇的气氛。每个骨头都安装在一个2毫升聚乙烯醇(PVA)瓶(Sarstedt、Numbrecht、德国),在styropore集中稳定,填充聚酯泡沫饱和与70%乙醇。MOPC315.BM。Luc样本扫描使用Skyscan 1172(力量microCT, Kontich,比利时)2μm和13.2μm有效像素大小、x射线源设置为70 kV 1毫米厚铝过滤器、2 s曝光时间,和1800年预测。数据重建(NRecon力量microCT, Kontich,比利时),检查在2 d(马里兰州ImageJ 1.52 d,国立卫生研究院,美国)和3 d (CTvox,力量microCT, Kontich,比利时)来识别区域的高营业额和溶骨的病变。
PMMA-embedded腿节扫描使用EasyTom 160 (RX解决方案、Chavanod、法国)。扫描参数45 kV, 45μ2.5,μ米体素的大小,一帧每秒,平均8帧,和1120年的预测。重建扫描执行预测使用RX X-Act软件解决方案。
2.4。同步加速器相影像(PCE) MicroCT成像
侧上方区域扩展∼直径1.5毫米长,覆盖整个骨扫描在ID19欧洲同步加速器辐射设备(欧洲同步辐射实验室,法国格勒诺布尔)。同步加速器PCE-CT扫描记录使用34 keV谐波pink-beam模式和650 nm有效像素大小,采用45毫米样本之间的传播距离和探测器(交响乐团闪烁体和PCO边缘相机)。典型的扫描要求∼5000射线投影,300 ms曝光时间,不断旋转360°使用所谓的一半的样本采集模式。ESRF内部代码是用来重建数据,提高对比通过Paganin-based过滤δ/β比500 (13]。
2.5。背散射电子成像(疯牛病)
背散射电子(BSE)成像进行调查骨骼形态学和矿物含量(亮灰色对应高矿物含量)与皮质病变区域。使用高分辨率microCT感兴趣的区域被确定。控制角连续切片进行公开PMMA块表面。BSE图像得到利用环境扫描电子显微镜(范FEG-ESEM广达600年,范公司晚宴过后,美国)。这个显微镜操作在低真空(0.75托)、加速电压的12.5 kV, 9.9毫米的工作距离,和光斑尺寸为4.014]。在100 x放大拍摄的图像合并在一起。成像条件后建立了定量测量的背散射电子成像协议矿物密度分布在人类骨活检(15]。
2.6。荧光共焦激光扫描显微镜(样品形貌)
关联成像的骨细胞lacunar-canalicular网络(OLCN)上执行相同的暴露表面用有机荧光共焦激光扫描显微镜(样品形貌,徕卡TCS SP8 DLS多光子,位于德国)(16]。OLCN可视化使用λ激= 514海里/λ发射= 550 - 650 nm激光放大40 x,石油目标,0.75变焦,6块,60μ总深度为0.4米μm步长。多个图像被合并。
网络特性,我们使用了一个建立协议基于先前发表的工作(17,18]。简而言之,原始样品形貌数据分段自动区分微管和基于他们的庞大的缺损。所有数据集被评估相同的分割参数集。平均缺损体积计算通过计算分割空白像素点的总数除以脱漏。分段泪小管被场大病,呈现到一个3 d网络进一步的定量分析。使用这个网络,然后我们计算的微管的密度量化单位骨小管卷的总长度,不包括缺损体积。
3所示。结果
3.1。Intrafemoral注射和局部移植
MOPC315.BM接种。Luc细胞移植导致100%十的老鼠,体内的光点(数字1(一)和1 (b))。明确建立MOPC315.BM的迹象。Luc殖民地观察早在第七天(图1(一))。BLI信号增加注射之后(图1 (b))和局部注射对股骨(图1(一))。所有小鼠存活整个实验没有痛苦和肿瘤的迹象出现稳步增长在21天的腿节实验。所有BLI迹象总是局限于注射右股骨(数字1(一)和1 (b)),但我们不能排除这种可能性,微转移到了其他网站(如肝)。BLI信号已被证明与测量血清MOPC315.BM。Luc分泌免疫球蛋白的水平,因此选择MOPC315监测肿瘤的生长。BM模型(6]。
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3.2。MOPC315检测。BM细胞和破骨细胞的活动
安乐死后,股骨的解剖和分析特征MM骨骼疾病的迹象。纵向的部分PMMA-embedded骨头(14]沾染了陷阱,揭示高破骨细胞活动的骨小梁MM-injected老鼠(数字2(c)和2(d))与PBS-injected骨头(数字2(一)和2(b))。
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3.3。溶骨的骨结构变化检测到同步加速器相影像MicroCT
低分辨率microCT扫描MM-injected腿节没有显示出明显的骨骼结构改变在7天,11日,15日和21后接种(补充图1)。同样,重建高分辨率microCT和PCE-CT PBS-injected骨头的图片显示没有迹象的溶骨的骨结构的变化在接种后21天(数字3(一个)和3 (b);数据4(一)和4 (b))。相比之下,MM-injected股骨,高分辨率microCT扫描特性强化骨吸收的迹象显示在接种后21天(数字3 (c)和3 (d);数据4 (c)和4 (d))。高骨营业额和空化观察外骨表面,如多个战壕和槽(图所示3 (c))。微妙的微体系结构的差异进一步表现出来的成像使用PCE-CT(图3 (d))。溶骨的骨结构变化被认为在横截面的千分尺规模MM-injected骨头(数字4 (c)和4 (d))。骨头周边表现出整体参差不齐的外观与众多网站的侵蚀(图4 (c)箭头),混合区显示低密度新形成的骨(图4 (d)深色的灰度,与#)表示,与成熟并存骨(图4 (d)光明的灰度)。皮质骨和形状不规则的荷包病变(图“下班”4 (d)黑色的箭头)。骨超微结构特征的腿节在更早的时间点在11(数据未显示),每天15(图5接种后显示骨小梁的中断(图5 (b))与低密度新形成的骨,骨愈合的迹象在注入的区域(图5 (d)),观察不同侧左股骨(数字5(一个)和5 (c))。PCE-CT图像显示形状不规则的溶骨的病变已经在15天(数字5(e)和5(f))。
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3.4。矿化骨细胞和Nonmineralized矩阵变化Lacunar-Canalicular网络
3 d效果图lab-CT透露大蛀牙在皮质骨近端股骨PBS(图6(一))和MOPC315.BM。Luc cell-injected鼠标(图21天6 (d)),相应的超皮质血管连接外表面与骨髓(电影S1MM-injected鼠标),最近发布了(19]。相关的背散射电子成像(疯牛病;数据6 (b)和6 (e))和共焦激光扫描显微镜(样品形貌;数据6 (c)和6 (f))允许直接比较的矿化和nonmineralized矩阵皮质骨的变化。疯牛病MM-injected骨头的成像显示不规则小和大蛀牙的形式分布于整个大脑皮层MM-injected骨的骨,对应于完好无损(∗)和改变(#)骨细胞缺损以及当地的矿化程度(图的变化6 (e))。PBS-injected骨头只显示完整(∗)骨细胞缺损(图6 (b))。OLCN可视化是样品形貌与罗丹明染色骨腔后(16),结合nonmineralized表面(数字6 (c)和6 (f))。在PBS-injected腿节,只有组织良好(∗)OLCN观察(图6 (c)和电影S2和S3)。大、形状不规则的骨细胞缺损被认为在一个混乱OLCN架构在MM-injected骨头(图6 (f),表示#;电影S4)。相比之下,小扁椭圆形的骨细胞与组织OLCN安排在层状结构中可见骨膜地区(图6 (f)表示,∗)。rhodamine-stained样品的样品形貌成像显示在第二个地区感兴趣的一个类似的混乱和组织OLCN相邻(补充图S2)。
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高倍率的图像MM-injected股骨的骨细胞形态(图6 (f))大,形状不规则的骨细胞裂陷在混乱微管网络架构(图7(一)旁边)扁平骨细胞缺损组织为层状结构(图7 (b))。量化的两个地区感兴趣的骨细胞缺损体积和微管的密度MM-injected股骨显示混乱区域有一个大的缺损体积(365μ米3(0.137±0.11)和稀疏的微管的密度μ米/μ米3PBS-injected骨(249)相比,地区μ米3;0.155±0.09μ米/μ米3;分别)。
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骨细胞与其他细胞骨细胞和骨骨膜或骨内膜的表面,如粘膜细胞、基质细胞,成骨细胞,和/或破骨细胞,通过一个错综复杂的微管网络(20.,21]。连接的OLCN骨髓腔内膜表面显示MM-injected股骨(图的网络中断7 (c))。PBS-injected股骨,网络组织薄片平行于骨表面和微管垂直于它(图7 (d))。
4所示。讨论
我们的结果显示MM骨病在成年早期26-week-old使用MOPC315.BM BALB / c小鼠。Luc细胞。使用26-week-old老鼠的理由是,它已经证明,这些老鼠达到骨骼成熟度状态(9,22,23]。虽然住房26-week-old老鼠更加昂贵,费时,和棘手的年轻老鼠相比,它确定模型的相关性研究MM骨效果只是成熟的动物,尽管我们都知道,有价值的研究使用年轻岁的动物。我们的目的是开发一个类似尽相关模型实际成年人群,尽管老鼠没有osteonal骨头和人类一样。人类MM疾病发展与媒介69岁人口老龄化起初诊断。它已经表明,与年龄相关的变化BALB / c骨架模仿那些在人类衰老24]。惯性矩增加,而皮质面积保持在小鼠的衰老,这是符合人类长骨头骨内膜和骨膜扩张(24]。同时,减少骨小梁体积分数在老年小鼠与骨小梁损失在年长的人24]。进一步,断裂能量的减少老年小鼠中发现与韧性的下降在研究人体皮质骨(24]。在这方面,年轻的老鼠(6到16周大)不会像人类衰老的骨代谢。动物年龄我们选择使它的可行性研究阶段的快速毫米骨病和测试新的治疗方案。
我们的新开发的同系的模型局部承压和显示未来潜力描述疾病的不同阶段超微结构水平。它大大不同于先前建立同系的模型如5 tmm模型,在两个截然不同的使用毫米细胞系:(i)中5 t2mm细胞或(ii)更积极的5 t33mm细胞。在这两种情况下,MM细胞必须静脉注射(注射)注入年轻6周大的老鼠溶骨的病变出现只有11∼16周后,当老鼠终末期疾病和肿瘤25,26]。而有用的一些研究,主要病变在这些模型不是本地化一个特定骨(26),在我们的模型一样。积极的5 MOPC315.BM t33mm模型。Luc模型输液注射后(6),肿瘤生长在多个器官包括nonhematopoietic组织。老鼠常常屈服于疾病没有一定的迹象在长骨骼病变。所有这些很难跟踪MM骨骼疾病发展的特定阶段,我们MOPC315.BM挑战。绕开Luc模型。
我们新建立的模型只是成熟的骨头BALB / c小鼠为研究提供了一个独特的工具MM骨病在疾病进展的不同阶段,至少3周后MM细胞注入。这里显示的结果提供了第一个见解的定量数据BLI老鼠3、7、11、15、21天后i.f MOPC315.BM。Luc细胞接种,定性数据基于高分辨率microCT PCE-CT和共焦和电子显微镜,检测微妙的概念证明的超微结构变化在细胞外基质MM-affected骨头。模型是加强监禁一个特定的骨骼,从而最大限度地减少动物痛苦,提高本地化,这是必不可少的在小区域限制使用高分辨率的表征方法。
检测陷阱染色显示活跃的破骨细胞活动增加证明了这一点在MOPC315.BM溶骨的疾病。Luc-injected老鼠。在未来的研究中,我们的模型可以用于抑制成骨细胞的检测,这是一个标志性的骨髓瘤骨病。表达标记等成骨分化osteocytic sclerostin标志,牙本质基质蛋白1,和成纤维细胞生长因子23日以及成骨的标记碱性磷酸酶、骨γ-carboxylglutamic acid-containing蛋白和骨桥蛋白,可能是PBS -和MOPC315.BM相比。通过免疫组织化学分析Luc-injected腿节。
当代研究骨组织经常雇佣microCT决议下来5∼10微米。高分辨率microCT到下面一个测微计具有挑战性的,但重要的是识别和描述骨细胞的长度尺度。尽管越来越多的研究高分辨率microCT synchrotron-based PCE-CT扫描揭示结构属性与目标分辨率低于100纳米,在现实的样品的效果。因此,结合高分辨率与同步PCE-CT microCT,可以检测溶骨的骨结构sub-micrometer规模的变化。PCE-CT,所有骨隔间可能在3 d可视化,包括细微的差别在骨的矿化程度27]。通过这种方式,重要的密度差异和梯度同步加速器beamlines ptychography采用先进的迭代方法,和他们也能够空间地图下面的小变化< 100纳米的分辨率,在齿效果样本牙质[28]。MM-affected骨头未来的研究将提供洞察MM骨骼疾病的早期阶段。
我们发现监测活动增加骨界面。此外,补充分析允许使用疯牛病和样品形貌的检测骨超微结构的变化,单一的骨细胞的缺陷和微管网络的纳米尺度揭示空间网络体系结构的改变。大、形状不规则的骨细胞裂陷在混乱中检测到OLCN建议局部改变骨重建,可能表明增加骨破坏的perilacunar空间MM-injected腿节。除了改变大小和形状的骨细胞的缺陷,破坏微管网络架构是指示性的骨骼病理MM骨骼疾病模型。的确,众所周知,骨超微结构的变化导致病理条件下,如骨质疏松症。最近的一项研究在小鼠骨质疏松模型调查lacunar-canalicular渗透率的影响和血管在流体孔隙度大小和显示,这是一个显著降低骨质疏松性条件与切除卵巢的老鼠模型(29日]。这减少流体损害mechanosensory骨细胞的功能和可能导致老年性骨质疏松在绝经后骨质疏松症29日]。
我们的模型从而为结合互补铺平了道路描述细胞外基质超微结构形态,更深入地理解潜力巨大的病理变化在MM的所有阶段的疾病。这些信息是至关重要的发展新一代的治疗方法。
总之,我们开发了一个体内,在MM疾病模型,只是成熟(26周)BALB / c小鼠影响老鼠的腿节。这个模型将允许未来结合生物材料科学和药理学研究的早期发现和治疗MM。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
FJ, PZ和交流是负责研究设计和起草了手稿。FZ,美联社,IMJ AC, PZ、陆地收集数据。IMJ FZ, AR, AC, PZ、陆地进行数据分析。FZ, IMJ, AC, PZ、陆地解释数据。BB负责细胞系的贡献。所有作者批准了最终版本的手稿。
确认
作者感谢Georg杜达(朱利叶斯·沃尔夫研究所,夏洛蒂柏林,德国)访问microCT。作者还要感谢Daniela年代Garske亚历山大和珍妮特Steffen优秀的技术支持和Van Tol求助OLCN的定量分析。这项工作是财务支持的德国研究基金会的资助FJ (JU 426/5-1)。作者承认欧洲同步加速器辐射设备(ESRF) ID19 beamtime。交流是由艾美奖Noether格兰特的德国研究基金会(CI 203/2-1)。IMJ由洪堡研究奖学金资助的博士后研究人员。
补充材料
补充图S1:低分辨率lab-CT图像代表股骨的腹侧和背视图MM-injected骨头在7天(a)、(B) 11日,(C) 15日分别和(D) 21。补充图2:电子和共焦显微镜的腿节注射MOPC315.BM骨超微结构特征。在21天Luc细胞。(A)的3 d渲染microCT扫描,(B)近端股骨BSE图像,和(C)的样品形貌成像rhodamine-stained样本显示的详细视图区域的矩形表示B Bv表明联接血管,Bm表明骨髓,Pe表示骨膜。2.5电影S1:高分辨率lab-CT(立体像素大小μ米)的电影PMMA-embedded股骨近端注入MM细胞后21天。影片显示,大型空腔皮质骨通道连接的外表面骨髓。电影对应于图6 (d)。电影S2: OLCN PBS-injected股骨沾罗丹明和可视化荧光共焦激光扫描显微镜。静态图像对应于图6 (c)。放大40倍,石油目标0.75变焦,6块,60μ总深度为0.4米μm步长。电影S3: OLCN PBS-injected股骨沾罗丹明和可视化荧光共焦激光扫描显微镜。低于该地区区域细节视图显示的矩形图6 (a)。放大40倍,石油目标0.75变焦,6块,60μ总深度为0.4米μm步长。电影S4: OLCN MM-injected股骨沾罗丹明和可视化荧光共焦激光扫描显微镜。静态图像对应于图6 (f)。放大40倍,石油目标0.75变焦,6块,60μ总深度为0.4米μm步长。(补充材料)