用于早期乳腺癌检测和分子分型的游离循环MicroRNAs的鉴定

摘要

早期检测是实现乳腺癌的死亡率降低的关键。癌症患者的血清中循环无细胞的microRNA目前的分析已成为早期发现肿瘤，并预测它们的分子分类的有前途的新的无创生物标志物。用于该研究的理由是，以确定无细胞微RNA的特异亚型分子概况用于血清早期检测乳腺癌。被选定为在血清中循环微RNA评价五十四个27年龄匹配的对照早期乳腺癌。54例患者分子分类（管腔A，管腔B，管状B Her2阳性，HER2，三阴性）。NanoString平台用于数字检测和定量的标记800微小RNA探针，并比较在血清微小RNA表达从乳腺癌病例与对照的总体差异。我们确定了42最显著（P≤0.05，1.5倍）的差异表达在用于进一步研究各分子亚型循环微RNA。这些微小RNA的，19人显著差异患者表达于管状B与管腔A，八呈现，10在管状B HER 2阳性，和四个在HER2亚型富集。AUC是高与合适的灵敏度和特异性。对于三阴性亚型的miR-25-3p有最好的准确性。 Predictive analysis of the mRNA targets suggests they encode proteins involved in molecular pathways such as cell adhesion, migration, and proliferation. This study identified subtype-specific molecular profiles of cell-free microRNAs suitable for early detection of breast cancer selected by comparison to the microRNA profile in serum for female controls without apparent risk of breast cancer. This molecular profile should be validated using larger cohort studies to confirm the potential of these miRNA for future use as early detection biomarkers that could avoid unnecessary biopsy in patients with a suspicion of breast cancer.

1.介绍

乳腺癌是女性最常见的癌症，在全球拥有2012年全球确诊，估计167万新发病例[1]。乳腺癌在临床上和生物学上都是高度异质性的，AJCC第7版乳腺癌分期指南建议使用基于5种分子亚型的分类:管腔a、管腔B、管腔B HER2阳性、HER2富集和三重阴性[2]。在诊断疾病的程度强烈与预后相关联，因此早期检测初期疾病的有效率的和非侵入性方法可用于成功治疗和改善存活[键3]。

乳房X射线摄影是目前用于早期检测乳腺癌的最好方法，但它具有一定的局限性，由于高的假阳性和不必要的应力，这些诊断的错误可能导致[4，五]。活检表示用于确定诊断的金标准过程，虽然该过程是侵入性的，并且还可能是痛苦的。乳腺癌新多基因谱面板现已有售，如DX的Oncotype（基因组健康，USA）MammaPrint（Agendia的，荷兰）和Prosigna / PAM50（NanoString，USA）;然而，这些测定法被设计用于评估肿瘤复发的风险和不适合于早期癌症检测[6]。事实上，存在的非侵入性方法一个严重短缺基于诊断的敏感性和特异性乳腺癌的生物标志物适合用于肿瘤的两个早期检测和亚型分类[7]。

液体活组织检查，例如血液样品，较少侵入性的并且更容易获得相比于基于组织的活检。对于许多人类肿瘤，包括乳腺癌，从血清中循环微RNA（miRNA的）的生物标志物分析的是用于不同疾病的预后的诊断和评价[最有效的非侵入性的一个8]。外周血miRNA和其他体液的广泛稳定性与相对容易检测和评估品牌循环的miRNA理想的生物标志物一起被用作液体活检[9]。此外，越来越多的证据表明，恶性乳腺上皮细胞可将miRNAs释放到外周血中，因此对这些miRNAs的分子谱分析为开发新的液体活检技术，用于早期乳腺癌的检测和评估提供了机会[10，11]。最近，我们的研究小组发现两种循环mirna在侵袭性乳腺癌中可能是抑癌基因[12]。

在乳腺癌中，一些miRNAs已经被报道为转移、复发、预后或治疗反应的潜在生物标志物[13，14]。实例包括的miR-155在乳腺癌中上调[15]。另一项研究显示了miR-195的循环水平在患有乳腺癌的妇女相比，健康妇女[升高（I-IV期）16]。然而，在目前，很少有研究发现显著改变的miRNA生物标志物是适用于早期诊断，乳腺癌的检测使用。

在这项研究中，我们使用nCounter®技术（NanoString技术，西雅图，WA，EUA）来识别从早期乳腺癌患者的液体活检样品中的miRNA施加复用的基因表达分析。我们的54名巴西乳腺癌患者的血清中的42临床相关的循环，差异表达的miRNA目前的分析。从这些miRNA，我们选择了能够区分女性乳腺癌患者与健康女性匹配的控制，而这种类型的癌症风险的生物标志物的新的子集。

2。材料和方法

2.1。研究设计和患者

本研究为病例对照研究，回顾性收集生物样本和临床资料。早期(CS I和II)病例(n=54)是从巴雷托斯癌症医院(BCH)诊断的更大系列乳腺癌患者中选择的，具有以下特征:年龄40-69岁;无乳腺癌复发;无家族史/MIRIAD >10%;肿瘤分期和分子亚型的确定;以及化疗或激素治疗前血清的可用性。根据2011年圣加伦国际早期乳腺癌主要治疗专家共识，纳入乳腺癌病例按分子亚型进行分类。

入选病例按年龄(±3岁)与27例对照组相匹配。对照组为在BCH预防科做乳房x线照相术的健康女性，Gail风险模型小于1.66，乳房x线照相术结果为BIRADS 1或BIRADS 2，并采血。

所有的生物样品从巴雷图斯肿瘤医院肿瘤生物资料库检索。本研究是通过巴雷图斯肿瘤医院的伦理委员会（方案n°二千○十六分之一千二百十二），按照赫尔辛基宣言。

2.2。从血清中提取RNA

总RNA分离回收从400uL的由miRNeasy血清/血浆试剂盒从病例和对照获得的血清，包括RNA酶的DNase步骤（Qiagen公司，盖瑟斯堡，MD，USA）。使用NanoDrop N-100分光光度计（NannoDrop产品，Wilmington，DE的）进行RNA定量。

2.3。NanoStringnCounter®系统试验

利用采用nCounter®分析系统（NanoString技术，美国西雅图）的nCounter®人v3的miRNA表达面板进行miRNA表达分析。简言之，将大约100 ng总RNA进行预处理标签结扎接着用记者代码集和捕获探针（nCounter®人力V3的miRNA表达测定法）杂交。样品使用的NanoString PrepStation在加工和固定到所述的nCounter盒，将其放置到nCounter®数字分析仪用于图像捕获（视场280）和数据采集。归一化是使用由Markowitz等建立的标准程序进行。使用R中环境中的Aromalight包（Bioconductor的）。

2.4。microrna的目标预测

目标预测采用miRDIP (microRNA数据集成门户:http://ophid.utoronto.ca/mirDIP/)。目标基因由五种算法(DIANA, RNA22, TargetScan, microrna.org，和RNAHybrid)独立选择，使用至少四种算法中存在的一些选择标准。我们只考虑了前1%的靶基因，包括那些已经被癌症基因指数数据(NCI)确认为与乳腺癌有关的靶基因。为了进一步确定所选基因与乳腺癌的关系以及与这些基因相关的分子通路，我们使用了Cytoscape上的插件ReactomeFI(3.6.0版，华盛顿州西雅图)。选择p值低于0.01的分子通路，以及包含至少3个基因的通路。相互作用网络由Cytoscape完成[13]。

2.5。统计分析

进行考虑样本的正态分布的统计分析。进行学生t检验，使用Bioconductor的multtest包。倍数变化估计，下（AUC）的操作特性曲线（ROC）面积，灵敏度和特异性分析，以测定差异表达的miRNA的精确度。使用R中的程序包ROCR（Bioconductor的）进行ROC曲线分析。从GGPLOT2和ComplexHeatmaps包（Bioconductor的）产生从该分析得到的所有图像。

3.结果

3.1。研究人群

的54例早期乳腺癌（例）的临床病理特征总结在表1。早期乳腺癌病例的中位年龄为54.6岁(范围41-69岁)。对照组(27例)按年龄(±3岁)与早期乳腺癌匹配，中位年龄(42-67岁)54.3岁。


特征	值（N，％）

年龄，年
Median	54.6
范围	41-69
分子亚型
Luminal A	12（22.2％）
Luminal B	12（22.2％）
Luminal B HER2 positive	12（22.2％）
Triple negative	12（22.2％）
HER 2+	6（11.1％）
分期，N
Stage I	21（38.9％）
Stage II	33（61.1％）
肿瘤大小(TNM)
T1	30 (55.6%)
T2	20 (37%)
T3	4（7.4％）
淋巴结状态(TNM)
N0	33（61.1％）
N1	21（38.9％）
组织学类型
导管	44（81.5％）
Others	10（18.5％）

恶性肿瘤的TNM分型:T表示原发肿瘤的大小;N描述受累的区域淋巴结;M表示远处转移。

3.2。乳腺癌癌症病例差异表达miRNA的

所有病例进行分层，根据临床阶段I和II以及通过分子亚型（管腔A，管腔B，管状B Her2阳性，HER2，和三阴性）。这种分层是用于专门从病例和对照区分的miRNA标志物用于乳腺癌的早期发现的。

通过NanoString技术确定的800种miRNA中，21有显著差异表达与血清相比被上调在乳腺癌病例血清该被下调，该管腔A亚型包括11个miRNA和10的miRNA（P≤0.05，1.5倍）从匹配的健康对照（图1)。

腔管腔B亚型中，有11个mirna表达显著差异(P≤0.05,1.5倍)，其中6个mirna在乳腺癌患者血清中表达下调，5个mirna表达上调(图)2)。

腔内B HER2阳性亚型中，与健康对照相比，乳腺癌患者血清中有12个mirna显著差异表达(P≤0.05,1.5倍)，其中8个mirna下调，4个mirna上调(图)3)。

对于HER 2富集的亚型，4种miRNA有显著差异表达（P≤0.05，1.5倍），包括被下调的是3种miRNA中但在乳腺癌病例与匹配的健康对照相比，血清中上调一种miRNA（图4)。

在三阴性亚型中，乳腺癌患者血清中miR-25-3p与匹配的健康对照相比仅上调(P≤0.05,1.5倍)(图)五)。

3.3。循环的miRNA作为生物标志物用于乳腺癌亚型的评价

为了评价的miRNA作为生物标志物用于检测乳腺癌血清中的准确性，我们确定的每个miRNA的接受者操作特征（ROC）曲线，灵敏度和特异性。我们认为ROC曲线下（AUC）的区域0.8作为用于进一步调查的截止和我们确定了36个42倍差异的miRNA作为亚型合适的生物标志物管腔A，管腔B，管状B HER2阳性和HER2富集（表2)。对于三阴性，的miR-25-3p显示的0.74稍低的AUC。


分子亚型	的miRNA	FC	灵敏度	特异性	钍	AUC

Luminal A型	HSA-MIR-18B-5P	-1.58	67％	83％	2.54	0.82
	HSA-MIR-23A-3P	1.91	67％	100％	4.12	0.89
	HSA-MIR-25-3p	3.56	92％	83％	3.08	0.92
	HSA-MIR-487B-5P	-2.27	100％	92％	3.32	0.94
	HSA-MIR-30E-3P	-2.05	100％	83％	2.85	0.92
	HSA-MIR-122-5p	3.03	83％	83％	5.39	0.86
	HSA-MIR-132-3p	-2.29	100％	75％	2.57	0.86
	HSA-MIR-196A-5P	2.24	92％	83％	3.17	0.83
	HSA-MIR-301B-5P	1.54	83％	83％	3.13	0.83
	hsa - mir - 335 - 5 - p	1.69	75％	83％	2.75	0.85
	HSA-MIR-376A-3P	2.20	83％	83％	3.53	0.83
	HSA-MIR-526B-5P	-1.60	67％	83％	3.04	0.83
	hsa - mir - 543	-1.84	67％	92％	3.64	0.89
	HSA-MIR-548ah-5P	1.69	75％	83％	3.34	0.84
	hsa - mir - 627 - 5 - p	-2.24	83％	92％	4.12	0.89
	HSA-MIR-873-3p	2.11	100％	83％	3.13	0.90
	HSA-MIR-887-5p	-1.75	83％	83％	3.21	0.87
	HSA-MIR-3614-5p	-1.58	83％	75％	3.41	0.81
	hsa - mir - 6503 - 5 - p	-1.76	67％	92％	3.33	0.83

管腔B型	HSA-MIR-146A-5P	-1.67	83％	84％	3.20	0.83
	HSA-MIR-188-5p	-1.60	83％	83％	3.79	0.83
	HSA-MIR-203A-5P	1.87	75％	100％	2.64	0.80
	HSA-MIR-502-5p	1.69	75％	100％	2.91	0.83
	HSA-MIR-548ar-5P	1.90	67％	100％	5.05	0.81
	HSA-MIR-548A-5P	1.85	83％	83％	2.71	0.85
	HSA-MIR-548ah-5P	1.75	67％	83％	3.69	0.81
	HSA-MIR-128-1-5p	-1.53	100％	75％	2.64	0.80

管腔B型HER2 +	HSA-MIR-25-3p	2.73	75％	83％	3.32	0.82
	HSA-MIR-378D	-2.65	67％	92％	4.31	0.83
	hsa - mir - 379 - 5 - p	1.87	67％	83％	3.13	0.85
	HSA-MIR-449B-5P	-1.65	67％	83％	3.10	0.83
	HSA-MIR-582-5p	-2.05	67％	75％	3.84	0.80
	hsa - mir - 615 - 3 - p	1.78	67％	100％	2.96	0.83
	HSA-MIR-887-5p	-1.74	67％	92％	3.71	0.82
	HSA-MIR-888-5p	-1.62	83％	75％	3.38	0.86
	HSA-MIR-933	1.53	83％	83％	2.47	0.89
	HSA-MIR-1302	-1.54	83％	75％	3.27	0.80

HER2 +	HSA-MIR-548ar-5P	3.07	100％	77％	5.24	0.97
	HSA-MIR-584-3p	-1.53	100％	100％	4.45	1.00
	hsa - mir - 615 - 3 - p	-1.62	100％	84％	4.20	0.94
	hsa - mir - 1283	-2.24	100％	100％	6.09	1.00

用ROC曲线失调miRNA的准确性0.8。FC：倍数变化;日：阈值;AUC：曲线下面积。

在这些36种miRNA，21被下调和16被上调用的miR-615-3p在管状B HER 2阳性的情况下，但也正在HER2-富集肿瘤（图下调被上调6和7)。42个循环mirna的亚型特异性(表)2）表明，19种miRNA显著差异患者管腔A分子亚型，患者管状B亚型呈递8种miRNA，患者管状B呈现10种miRNA呈现表达HER 2阳性亚型，4种miRNA在患者的亚型呈递HER2富集，而在三阴性亚型仅一种miRNA。

图7

乳腺癌患者的血清上调的miRNA的维恩图。维恩图显示出16倍上调的miRNA，包括管腔A和管腔B之间的miR-548ah-5P常见，HER2和管腔B，和管腔A与管状B HER 2阳性之间miR25-3p公共端之间的miR-548ar-5P常见。她2 (a);(b)腔的一个;(c)腔的B;（d）管状B HER2阳性。

3.4。实用在网上分析

为了鉴定差异表达miRNAs的潜在靶标mrna，我们鉴定了五种乳腺癌分子亚型中每个亚型的top表达(miR-25-3p, Fold change 3,56)和top表达(miR-378d, Fold change: -2,65)的mirna(图)8)。

（一个）

（b）中

（C）

（d）

（e）中

图8

差异表达的分子亚型乳癌的miRNA。火山情节展现在乳腺癌不同分子亚型的差异表达的miRNA的轮廓。此图表明的倍数变化（x轴）和P值(轴)。绿色圆圈代表下调的miRNAs，红色圆圈代表上调的miRNAs。黑色圆圈表示没有显著表达的mirna。以P值截断值0.05和1.5倍变化确定显著性。乳腺癌分子亚型分析:(a)腔内a -箭头表示最高上调的miRNA (miR-25-3p);(b)腔的b;(c) luminal B HER 2阳性-箭头表示最高下调的miRNA (miR-378d);(d) HER2-enriched;(e) -三倍。

我们确定使用在线预测工具miRDIP为的miR-378D和miR-25-3p的靶基因。我们无法确定预测的miR-378D的靶基因，但也有预测的miR-25-3p 14个靶基因。

在这些miR-25-3p预测靶基因中，我们发现4种分子通路(整合素信号通路、EPHB前向信号通路、FoxO信号通路和Ras信号通路)对细胞粘附、迁移和增殖的调控具有统计学意义。这些分子通路也与靶基因NRAS重叠见图S1在补充材料进行全面的图像分析）。

4.讨论

乳房x线摄影筛查是检测早期乳腺癌病变的黄金标准工具，但它有几个局限，如假阳性结果，并不是所有女性都很接受，因为它是一种非常不舒服的方法[17，18]。另外，乳腺癌被分类在不同组织学和分子亚型，其本鲜明度的侵袭性[17，18]。目前，只有从常规活检程序获取的组织样品可以是用于这种类型的肿瘤的组织学和分子分类是有用的。因此，用于乳腺癌筛查的液体活检方法可以提高乳腺摄影灵敏度，并且还可以是用于分子分类很有帮助[19，20]。

miRNAs作为癌症生物标记物在过去几年中受到了广泛关注，因为使用常规方法从血浆或血清中检测它们的可能性可以适应临床实验室常规[21，22]。此外，这些循环的miRNA已经与不同类型的癌症的存在相关联23，24]。因此，我们假设，肿瘤特异性的循环的miRNA的鉴定可用于早期发现乳癌以及用于乳腺癌的不同亚型的识别分子生物标记物。

最微创生物标志物用于乳腺癌本发明的低精度已经描述的。乳腺癌微创生物标志物的一个很好的例子是在CA 125，血清生物标记，演示了69％的特异性，只有23％的敏感性[25]。其他的生物标志物的血清诸如CEA和CA 15-3仅报告是有效的乳腺癌患者的小于15％[26]。

我们研究的一个重要发现是，的miR-25-3p可分辨出患者健康对照组三阴性乳腺癌（最积极的亚型）。MIR-25-3p还发现在三阴性乳腺癌组织和细胞系[中上调27]。我们的预测分析表明，BTG2是miR-25-3p的假定目标，因此它似乎有可能，这可能的miRNA在三阴性乳腺癌靶向BTG2促进细胞增殖。我们发现，miRNA是在三阴性乳腺癌预后的重要标志物。例如，下调的miR-221-3p与用于三阴性乳腺癌的预后不良相关联的生物标志物[28]。然而，很少有研究，因为这种积极的分子亚型的大多数情况下是在一个先进的阶段检测到使用三阴性乳腺癌的早期诊断进行。

在我们的研究中，可能是由于采样引起的实验变量影响了12例三阴性病例与健康对照组的比较。此外，众所周知，与激素受体组(luminal A, luminal B, luminal B HER2阳性和her2富集)相比，三阴性分子亚型的临床和生物学行为更加异质性，我们能够根据miRNA表达进行区分。尽管在我们的研究中，在富含her2的分子亚型中发现的循环mirna的准确性非常好，但我们认为有必要使用更大的队列来验证这些mirna，以提高统计效力，因为我们的分析只有6名患者。

考虑到本研究是回顾性的，没有任何治疗方法的血清乳腺癌样本较少，确定Gail风险的对照组小。因此，需要进行更大规模的前瞻性研究，以确定最可靠的循环miRNA特征，从而使用避免不必要活检的微创方法改进乳腺癌的临床治疗。miR-25-3p是否可以作为三阴性乳腺癌的特异性早期检测生物标志物，还需要进行更广泛的研究。

5。结论

因此，在这种病例对照研究我们确定了分子的miRNA签名作为以增加的精度为每个分子亚型非侵袭性的生物标志物（管腔A，管腔B，管状B HER2阳性和HER2富集的乳房）。未来的研究将被要求验证使用较大的同伙这些miRNA的临床应用。总的来说我们的研究结果表明，独立的miRNA可在血清中检测到的患者早期乳腺癌和它们的差异表达可以与特定分子亚型相关联。因此，使用分子生物标记物的液体活检方法可以在乳腺癌与潜在筛选例程被采用以减少不必要的侵入性手术。

数据可用性

的功能分析和用于支持该研究的结果差异表达的miRNA的数据是请直接从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称，有兴趣就本文发表任何冲突。

致谢

我们感谢巴雷图斯肿瘤医院生物银行从患者的生物样品管理的技术支持。作者想感谢杰里米·翰博士仔细校对英语并提供稿件的建设性的批评。这项工作是由来自基金会圣保罗州的研究支持（FAPESP过程2015 / 21082-0）和劳动坎皮纳斯的公安部（科研，预防，职业癌症的教育）的资助。

补充材料

表S1: miR-25-3p靶基因预测和反应体确定的分子通路。（补充材料）

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肿瘤学杂志

诊断，预后和预测性生物标志物在乳腺癌

摘要