循环癌症干细胞细胞外囊泡作为一种新型生物标志物临床结果评估

文摘

最近推出的“精密医学”概念在肿瘤学推动癌症研究关注动态测量的生物标志物能够预测反应小说抗癌治疗以改善临床结果。最近,细胞外的参与囊泡(EVs)癌症病理生理学被描述,并给予他们释放所有细胞类型在特定的刺激下,电动汽车也被建议作为癌症的潜在生物标志物。用于研究电动汽车的技术、流式细胞术临床高潜力。这里,我们最近应用开发和简化的流式细胞术方法循环EV枚举,子类型化,隔离来自群体的转移和局部晚期nonhaematological癌症患者(N= 106);性别和年龄健康志愿者样本进行分析。大范围的癌症相关的标记被用来分析差异的外周血循环EV患者和健康志愿者之间的表型,以及相关的临床结果。最后,EVs从病人和控制被fluorescence-activated孤立的细胞分类,蛋白质和他们的货物被蛋白质组学分析。结果表明,电动汽车在癌症患者数量明显高于健康志愿者,如前所报道。更有趣的是,结果还表明,癌症患者提出更高浓度的循环CD31 + endothelial-derived和肿瘤癌症干细胞CD133 + CD326 -电动汽车,相比健康的志愿者。此外,更高水平的CD133 + CD326−EVs显示与一个贫穷的整体存活率显著相关。此外,EV货物证明差异蛋白质组学分析的蛋白质含量和功能之间循环电动汽车在癌症患者和健康对照组。总的来说,我们的数据表明,血液循环癌症干细胞电动车也可以作为癌症诊断和预后的生物标志物。

1。介绍

肿瘤治疗大大改变了过去几年,由于更好的理解生物过程导致肿瘤发展和进展。老治疗模式克服了“精密医学”的概念,旨在管理定制的疗法。因此,癌症患者大大受益于小说的可用性组织和血液生物标志物能够更好地预测响应新的抗癌治疗和改善临床结果在选定的患者群体。然而,诊断、治疗和随访的癌症患者仍遭受缺乏肿瘤病理过程和药理反应的动态可衡量的指标。

过去几十年已经看到越来越多的参与兴趣细胞外囊泡(EVs)癌症生理病理学,和他们的潜在作用癌症生物标记已经突显出(1- - - - - -3]。

EVs粒子自然交在细胞外微环境,包含丰富的货物的DNA, RNA, microrna,蛋白质,脂类和代谢物4,5]。描述了三个主要的子类型的电动汽车,基于它们的大小和生源论:液,外皮层,也称为微泡(MVs)或微粒子,和凋亡的身体。液源自endosomal系统,他们的直径范围从30到150海里。EVs的向外公布的初露头角的质膜和测量直径100到1000纳米。凋亡的身体,这是注定要由细胞程序性细胞死亡,是异构的大小直径从200到5000纳米(6]。

几项研究已经描述了电动汽车作为调停人的角色在细胞间串扰信号(短期和有氧条件下7- - - - - -12]。此外,分子货物的转移促进靶细胞的反应不同,修改微环境和调节免疫机制13]。

它已经表明,电动汽车参与许多疾病的发病机制,包括癌症(2,9,14,15]。这两个在体外和在活的有机体内研究了电动汽车在癌症生物学的积极作用。特别是电动汽车参与血管生成,肿瘤进展和转移,tumour-stroma互动,进一步的生物过程(16- - - - - -23]。一些证据表明肿瘤细胞产生更高的电动汽车数量而非恶性的细胞(24]。

有趣的是,肿瘤提取EVs港口货物丰富蛋白质和基因与电动汽车相比来自正常细胞(25,26]。根据这些观察,外周血循环电动汽车可以被认为是一个繁荣的潜在生物标记物的来源(27- - - - - -31日),在这种情况下,显性描述血液循环肿瘤提取的电动汽车的基础上,分析癌症相关的表面蛋白表达的尝试(32- - - - - -34]。此外,最近的在活的有机体内研究展示了一种可能的预后和预测作用的EV亚型在癌症患者34- - - - - -37]。

目前,研究人员正在产生一个巨大的努力识别的新疾病EV表型,可能有助于开发新的治疗方法(38,39]。的确,大电动汽车可以很容易地从外周血分离和特征是多种技术,如流式细胞仪(7- - - - - -10,14]。出于这个原因,外周血循环癌症相关的识别和描述提出了电动汽车作为一种新型的液体活检方法,这可能可以避免更多侵入性组织活检,扩展分子表征早期诊断的好处,和监测时间和空间异质性的肿瘤细胞。

鉴于该研究领域的相关性越来越高,我们进行了一个观察前瞻性研究,以阐明肿瘤提取电动汽车的作用,既是在癌症患者诊断和预后标记。我们专注于流式细胞仪鉴定和蛋白质组学描述周围血液循环的电动车,目的是识别新的可能的标记来检测和描述循环癌症相关的EV亚种群通过比较分析电动汽车亚型在转移性癌症患者和健康志愿者。最后,这些发现都与患者的临床结果,为了探索电动汽车的潜在的预后和预测作用。

2。材料和方法

2.1。病人

这个观察前瞻性研究是经当地伦理委员会批准。所有受试者参与这项研究给书面知情同意。外周血(PB)从106年样本获得的转移和局部晚期nonhaematological癌症患者和25名健康的志愿者,从临床肿瘤学部门招募(“党卫军。Annunziata”医院、基、意大利)。所有注册对象的人口学特征补充表中进行了综述1。样本收集的基线,在前或随后的癌症治疗行之前,当时的放射学评估。PB样本收集患者和健康志愿者在相同的条件。

2.2。细胞外囊染色流式细胞术

从每个参与主体,两个柠檬酸钠管(生物科学(BD),正欲圣何塞,CA,美国裁判454387)被用来收集外周血样本,使用21 G针头。样本处理4小时内流血。第一次收获的PB管是丢弃venepuncture-induced血管损伤的影响降到最低40,41]。值得注意的是,phalloidin被添加到混合试剂染色事件破坏细胞膜,鉴于其绑定到f -肌动蛋白(10,42]。染色后进行一个已经描述了协议(10]。详细,第一步,试剂混合制备了通过添加FITC-conjugated phalloidin(必要时)和液晶(BD Biosciences-Catalogue, # 626267,定制工具包),和所有试剂的详细表1(面板面板面板1或2或3)被添加到195μl (PBS 1 x,然后5μl(全血被添加到混合。经过45分钟的染色(RT,在黑暗中),500年μl PBS 1 x是添加到每个管,和1×10 (6通过流式细胞术]事件/样本记录(FACSVerse BD生物科学)。

避免免疫复合物的形成和不具体的背景与抗体集合,每个抗体原液离心机在使用它之前,在21000年12分钟。

2.3。细胞外泡流式细胞仪收购

触发器阈值设置在通道中液晶发出(allophycocyanin (APC)通道;阈值= 200/262,144),而为了避免失去感兴趣的事件,没有应用阈值对散射参数。信号脉冲高度(H)测量和代表向前散射(FSC),侧面散射(SSC),任何荧光信号。EV散射特性建立了罗塞塔校准和验证的系统(Exometry、阿姆斯特丹、问),如前所述[43),通过运行Megamix-Plus珠子(Byocitex,马赛,法国)在同一光电倍增管(PMT)放大用于电动汽车检测。每个抗体/板中使用的试剂滴定(8“滴定法)测定条件下;稀释的基础上建立了实现最优信号噪声比(44]。非特异性荧光的评估是通过收购获得荧光- 1 (FMO)和同形像控制45,46]。

Reagent-only和buffer-only控制进行分析,我们发现建立APC通道触发阈值如前所述,在这两种情况下,收购几乎没有产生事件的时间间隔期间所需的样本采集(∼1分钟)。1%的样本被解决特里同x - 100为了验证液晶染色目标完整的电动汽车。

薪酬评估使用CompBeads (BD)和single-stained荧光样品。数据分析使用FACSDiva v 6.1.3 (BD) FACSuite v 1.0.6.5230 (BD)和FlowJo v 10(美国TreeStar、亚什兰或)软件。细胞外泡人数得到的体积数。这种多色流式细胞术方法允许电动车浓度的分析和子类型化最近提交的专利(欧洲专利申请号EP19164567.0)。

2.4。控制细胞外战略分析和子类型化

2.4.1。面板1

补充图1显示了一个代表SSC-H dotplot FSC-H,用于设置一个地区在一个血小板(plt)下降。这样一个区域被定义为一个“platelet-free区域。”事件的“platelet-free区”然后在LCD-H / Phalloidin-H dotplot,和电动汽车被当成LCD-positive / phalloidin-negative点(补充图1 b)。因此,电动汽车(LCD + / phalloidin−事件)分析了CD45-H / CD133-H dotplot,和CD45 +事件是封闭的(补充图1 c)。CD45-negative逻辑门集合,以及由此产生的人口标注在CD326-H / CD133-H dotplot(补充图1 d)。几个EV表型在这里确认(CD133 + / CD326 -;CD133 + / CD326 +;CD133 - / CD326 +)。

2.4.2。小组2

电动汽车被确定为LCD-positive / phalloidin-negative事件,在“platelet-free区域,”中描述的补充图1- - - - - -B。电动汽车被代表CD31-H / CD41a-H dotplot(补充图1 e),和事件显示CD31 + / CD41a +表型被确定为血小板源电动车(PLT-EVs)。PLT-EVs-negative逻辑门集合,以及由此产生的人口标注在CD45-H / CD31-H dotplot(补充图1 f)。CD45 +事件确定为leukocyte-derived电动汽车,而CD31 + / CD45−隔间里被定义为endothelial-derived EV人口。

2.4.3。板3

的事件中所描述的“platelet-free区”被确定为补充图1然后在一个LCD-H / CD235a-H dotplot;鉴于大多数phalloidin +事件在这个领域下降导致CD235a +(未显示),电动汽车在这里确认为LCD-positive / CD235a-negative点(补充图1克)。这些事件进行分析CD45-H / CD90-H dotplot,和CD45 +事件是封闭的(补充图1 h)。CD45-negative逻辑门集合,以及由此产生的人口标注在CD29-H / CD90-H dotplot(补充图1我)。几个EV表型在这里确认(CD90 + / CD29 -;CD90 + / CD29 +;CD90 - / CD29 +)。

2.5。细胞外泡分离Fluorescence-Activated细胞排序

细胞外囊泡(100中分离了出来μ喷嘴)通过使用FACSAria三世细胞分选仪(BD生物科学)从整个外围血液样本的基础上他们的积极性phalloidin LCD和消极,加上他们SSC-H和FSC-H特性。postsorting纯度被重新分析纯化样品评估,推荐,纯度一直高于90% (47]。最近出版的,这里所描述的EV分离方法允许电动车准备了免费的获得可溶性污染物传播通常影响电动车样品纯化(即使用最先进的技术。、超速离心法)(10]。

2.6。细胞外泡Label-Free蛋白质组学

池净化EVs二百万人死于肺癌患者用于蛋白质组学研究。已经出版,分离电动汽车的数量(通过执行的计算使用fluorescent-activated细胞分选仪)可作为归一化参数用于蛋白质组学分析(7,10]。典型的消化协议filter-aided样品制备(FASP)一夜之间进行了37°C使用胰蛋白酶(Promega,麦迪逊,WI)。EV-digested蛋白质从每个样本一式三份分析了液相色谱串联质谱(质/ MS),使用Proxeon EASY-nLCII(热费希尔科学、意大利米兰)色谱系统耦合Maxis高清UHR-TOF (BrukerDaltonics GmbH是一家现代化、不来梅、德国)质谱计。肽被加载在捕获列C18(2厘米L, 100μm ID, 5μm ps,热费希尔科学),然后分开的赞誉PepMap100 C18 (75μL m ID, 25厘米,5μm ps,热费希尔科学)纳米级色谱柱。流量被设定在300 nL /分钟,总运行时间90分钟,已经描述(7]。质谱仪是正离子极性和汽车MS / MS操作模式(数据采集(DDA)的依赖),使用N₂作为CID碎片碰撞气体。前体在350到2200之间米/z(不含1220 0 - 1224 0。5米/z)的首选电荷状态从+ 2 + 5(不含单电荷离子)和绝对强度超过4706项被选中的碎片的最大周期时间3秒。前体是积极排除在收购后选择30秒。隔离宽度和碰撞能量MS / MS碎片按照国家质量和电荷的前体离子,与将参考大规模(1221 .9906锁米/z)在线采集,在整个运行。

2.7。Label-Free蛋白质组学分析的数据处理

定量计算蛋白质组学数据分析是由一个自由的平台,1.3.3.4 MaxQuant版本。(大生物化学研究所、Martinsried、德国),使用MS / MS谱的原始数据文件。峰列表,生成MaxQuant,搜索使用仙女座[48)肽搜索引擎针对UniProt数据库(2018 _04发布分类智人;20874蛋白条目)补充经常观察到的污染物和包含正向和反向序列。多样性是一个因为label-free量化。胰蛋白酶消化模式指定了两个错过了分裂。Carbamidomethylation的半胱氨酸(C)被定义为固定的修改和用于蛋白质量化,而氧化蛋氨酸(M)被设置为变量修改。最低7个氨基酸的肽长度设置,搜索空间是有限的,最多4600 Da的肽质量。为每个肽MaxQuant使用个人质量公差;最初的最大前体质量公差是默认设置为0.07第一搜索和Da 0.006 Da在主搜索,和片段质量公差将达0.1。2分钟的保留时间公差用于对齐任何时间采集样本之间的转变。错误发现率(罗斯福)在蛋白质水平组为2%,而在肽水平被设定为1%。 Protein identification was performed with at least one unique peptide. Intensity-based absolute quantification (iBAQ) in MaxQuant was performed on the identified peptides to quantify protein abundance in mixture.

2.8。统计分析

统计分析了使用SPSS 21.0版和GraphPad棱镜(GraphPad软件公司,拉霍亚、钙、美国)软件。人口数据提供了与中值95%置信区间。确切概率法是用来评估不同的年龄和性别健康对照组和癌症患者之间,表示。

比较评估电动汽车数量的非参数克鲁斯卡尔-沃利斯H测试,如拨款。中位总生存期(OS)评估使用kaplan meier曲线估计量。在生存分析,事件建立了癌症相关的死亡。logrank测试是用来比较值操作系统。Cox比例风险模型来计算风险比。数据截止2019年2月成立。

统计学意义是接受的 。

疾病控制率(DCR)被用来定义反应者和nonresponders和相对比例和比率根据CD133 + CD326−EV计算阈值进行评估。截止值和接收操作符生成特征(ROC)曲线,和相应的曲线下的面积(AUC)报道,表示。ROC曲线确定的最优截止值Youden指数。

3所示。结果

3.1。电动汽车和电动汽车亚型在癌症患者

外周血循环分析了电动汽车在晚期癌症患者和健康志愿者;电动汽车的总量和浓度不同的EV亚种群进行分析。

固体肿瘤immunophenotypical列表标记测试根据文献[49- - - - - -52]。这个列表包括以下:EpCaM (CD326), CD133, CD90、CD29。建立了许多不同的EV亚种群通过结合不同的标记(CD133 + CD326−, CD133−CD326 +, CD133 + CD326 +, CD90 + CD29−, CD29 + CD90−, CD90 + CD29 +)。外周血循环leukocyte-derived (CD45 +)和endothelial-derived (CD31 + / CD45 - / CD41a)电动汽车水平也被评估。

确认之前报道的数据(53),我们表明,电动汽车的总体血药浓度导致癌症患者明显高于健康志愿者(癌症患者:中值= 14308电动汽车/μl;95%可信区间4368 - 70763;健康的志愿者:中值= 5207电动汽车/μl;95%可信区间1751 - 13531;值= 0.000001)。我们进一步分层癌症患者人群根据原发肿瘤的网站。如图1和报告在表2,更高浓度的全电动汽车被发现在所有癌症患者群体的年龄——健康控制的准确性。

我们进一步分析了EV亚型浓度差异癌症患者和健康对照组(表2和图1)。流式细胞仪数据显示,癌症患者提出更高浓度的CD31 + endothelial-derived和CD133 + CD326−肿瘤癌症干细胞电动汽车相比,健康志愿者。截止值CD133 + CD326−EV水平区分癌症患者和健康对照组(82.5电动汽车/被识别了μl)的敏感性和特异性0.69和0.84,分别为(补充图2摄氏度)。

更高浓度的CD31 +电动汽车已确定在乳腺癌和大肠癌患者,而更高浓度的CD133 + CD326−EVs曾被观察到在肺癌、乳腺癌、结直肠癌患者。值得注意的是,增加了10倍浓度的上皮承诺癌症干细胞EV族群(CD133 + / CD326 +)检测在肺癌患者中,与健康受试者相比,尽管这样的一个子集之间没有显著改变所有癌症患者和健康对照组。乳腺癌患者也显示低水平的CD29 + CD90 + /−和CD326 + CD133−比健康的主题。

3.2。电动汽车的癌症患者预后的作用

然后我们调查了EV浓度是否可能与临床结果。基于比较分析的结果在癌症患者和健康志愿者之间,我们专注于一个可能的相关性,CD31 +,或CD133 + CD326−EV浓度和总癌症患者的总体生存队列或癌症的子组(图2)。我们观察到电动汽车相关的浓度没有明显差异在总生存期(OS),当所有癌症患者进行分析(HR 1.36, 95%可信区间0.81 - -2.30, )。更高的平均操作系统中检测出病人显示降低外周血EV计数,但这样的生存优势并不显著整体癌症人口(补充表2)。得到了相同的结果,当CD31 +电动汽车进行分析(补充表2)。虽然较低的患者数量的循环CD31 +电动汽车(< 120电动汽车/μl)提出了一个更高的生存概率,这个结果并不支持在整个人口统计学意义(补充表2)。

否则,一个显著的统计上的显著差异,操作系统检测两组患者之间显示不同浓度的CD133 + CD326−电动汽车在整个癌症人口(HR 2.79;95%可信区间1.51 - -5.17, ;补充表2/图2)。这两组之间的截断值是118.5电动汽车/μl。中等操作系统在组患者低没有达到CD133 + CD326−EV, 8个月的平均操作系统相比,患者更高浓度的CD133 + CD326−EVs(图2(一个)和补充表2)。值得注意的是,任何年龄或性别方面的差异这两个组之间患者证明(补充表3)。此外,我们根据癌症生存分析分层子组,集中我们的注意力在肺癌和结肠癌患者,导致我们的研究人群中最丰富的人群(如补充表所示2)。

我们表明,肺癌患者高CD133 + CD326−EV浓度高死亡率的2.6倍,较低的相比CD133 + CD326−EV外围血药浓度(HR 2.60;95%可信区间1.26 - -5.37; ;图2 (b)补充表2)。当我们进一步分层的病人的治疗,我们观察到,这种优势也证实的首次治疗肺癌患者(数据没有显示)。没有区别的性别和年龄分布之间的两组肺癌患者证明(补充表3)。

可能的相关性CD133 + CD326−EV水平和临床受益于癌症治疗是探索在整个队列和肺癌患者。我们观察到,几乎60%的患者达到响应或稳定的疾病抗癌治疗后循环EV水平较低的基线(优势比1.83;95%可信区间1.30 - -13.8; ;补充表4)。此外,更高的CD133 + CD326−EV浓度检测在一个大比例的患者经历了一个渐进疾病(78.4%,补充表4)。类似的研究结果报道肺癌组患者(补充表4)。

如外周血样本收集的基线和在第一个疾病放射学评价,修改EV水平在癌症治疗进行分析(补充表5和6)。特别是,我们研究如何变化的CD133 + CD326−EV水平与疾病状态有关。有趣的是,我们观察到,减少电动车经常水平进步的相关疾病的时候第一个放射评价(优势比0.33;95%可信区间0.13 - -0.84; )。因此,66.7%的回答者患者提出增加或稳定CD133 + CD326−EV水平(优势比1.46;95%可信区间1.04 - -2.05; ,补充表7)。

3.3。肺癌患者的蛋白质分析电动汽车货运

电动汽车样本选择和well-classified患者群影响肺癌(N= 6)了,货物和相关蛋白质进行分析和比较健康志愿者(N= 3)。全部和完整的电动汽车被当成液晶+ / phalloidin−事件和由fluorescence-activated细胞排序。高纯度(> 90%),达成和2.0×10 (6)从每个条件排序EVs被猎枪蛋白质组学的方法,分析了一式三份已经描述(10]。确定蛋白质的列表,每个条件,至少在一个复制补充表中被报道8,主要分为“vesicle-mediated运输”(去:0016192; )报道在图3(红点),确认使用的隔离协议的效率。报道补充图所示3,我们发现48 EV蛋白质在健康受试者和42蛋白质EVs从癌症患者(补充图3;补充表8)。发现有趣的是,六个蛋白质只有在癌症EVs和三个人的“信息粘连”过程,报道补充图所示2 b;(红点, )。否则,十二个蛋白质,其中大部分是有关“肽酶活动的监管”(补充图3;:0052547)过程,确定了从健康的志愿者只有在电动汽车。

最后,一个创新路径分析(IPA),基于定量蛋白质组学数据的识别蛋白质,。数据报告图4强调30多个识别蛋白质允许激活“肝损伤,”有毒的函数在癌症电动汽车( ,z分数= 2.621)。上游国际监管机构的分析,基于先验知识之间的预期影响转录监管机构和他们的目标基因54),然后执行。结果表明,“106年锌指蛋白”,这是参与胰岛素受体信号通路,是癌症的主要上游激活(值= 2.9E−06,z分数= 2.0)。

4所示。讨论

全球癌症死亡的第二大原因(55]。新的生物标记需要改善癌症病人的诊断和评估结果(56]。细胞外囊泡释放所有的细胞类型,反映出每个病人的生物的细胞复杂性(57]。电动汽车能够传输特定的DNA片段,靶细胞rna, mi-RNAs和蛋白质。EV生物内容和电动汽车使他们的物理耐久性高合适的和有前途的材料是一个稳定的和敏感的癌症生物标记物的来源58]。因此,电动汽车的生物复杂性的描述可能代表一个可靠的代理病人的病理生理状态。很少有研究被发表体外描述的外围EV亚型在癌症患者32- - - - - -34]。此外,所有的协议依赖于许多preanalytical浓缩步骤而导致产物生成。电动车我们开发了一个简化的流式细胞术方法描述,不需要任何preanalytical浓缩过程,因此依靠非操纵材料和允许一个更可靠的病人情况(7,10,59]。这种方法被应用来分析电动汽车浓度,在癌症患者群体的表型。有趣的是,我们表明,癌症患者表现出明显高于外周血循环EVs的浓度。鉴于在癌症细胞间串扰尤其活跃,这强大的信息交换可能是反映在高循环水平的电动汽车。这一发现与最近的文献指出协议EVs癌症的病理生理作用特点(57]。为了分析电动汽车参与癌症的复杂性,我们分析了不同的EV亚型,可能与肿瘤发病机制有关。在这样一个背景下,有趣的是,endothelial-derived EVs显著增加,浓度,在癌症,特别是在结肠癌患者。众所周知,结肠癌是高度依赖于肿瘤neovasculogenesis [60],我们计划扩大我们的研究群结肠癌患者为了理解内皮电动汽车的潜在生物标记物预测或监控antiangiogenetic治疗结果。

另一方面,我们的数据强烈建议一个角色CD133 + CD326−EVs在癌症的发展。事实上,CD133最初确定为造血干细胞表面抗原和标记其他胚胎上皮细胞。目前,CD133,与缺乏CD326 [61年],广泛认可为干细胞标记,尽管其全球生物功能仍不理解(49]。事实上,EVs源于癌症干细胞显示相同的亲代细胞表型(62年]。在这种背景下,我们体现出统计上显著的增加CD133 + CD326−癌症干细胞在癌症患者(EVs )。截止值CD133 + CD326−EV水平区分癌症患者和健康对照组(82.5电动汽车/被识别了μl)具有高敏感性和特异性。这意味着,如果证实了进一步扩大研究,循环CD133 + CD326−电动汽车可以代表一个潜在的癌症筛查和诊断的有效工具。此外,我们的研究结果显示很强的相关性之间的CD133 + CD326−EV浓度和病人的临床结果。详细,高水平的癌症干细胞EVs (> 118.5 EV /μl)在整个癌症病人组与不良预后相关,总生存期。此外,CD133 + CD326−EV浓度也与临床反应率,考虑到高水平的EV特征子集的大多数病人(78.4%)没有回应抗癌疗法。这些发现整个群癌症患者均获得和被证实,当我们分析了肺癌患者最代表了我们的设置。这些结果符合穷人预后作用增加癌症组织中CD133的表达,已经描述的几项研究[63年]。这表明可能的积极作用的CD133抗原在恶性肿瘤的病理生理机制,并强烈支持的水平CD133 + EVs外周血中循环可能反映了复杂的场景描述细胞肿瘤的框架。

作为一个开放的方法了癌症的分子描述电动汽车,我们进行了定量蛋白质组学分析肺癌EVs,强调差异蛋白表达,反过来,可能参与癌症相关的生物过程。特别是Desmoplakin (DSP), Desmocollin-1 (DSC1) Desmoglein-1 (DSG1),和小脯氨酸蛋白2 (SPRR2A)确定只有在肺癌EVs和造成“信息粘连”的过程,正如已经描述,扮演一个关键的角色在癌症的发展和进展64年]。此外,30多个识别蛋白质允许激活“肝脏病变”的有毒癌症EVs函数。汇集和分析科目中,有趣的是,一个病人提出多个肝转移时的观察,而另一个病人已经开发了肝转移几个月后血液样本集合。然而,在更大的群组研究中进行进一步的研究与肝转移的癌症患者需要了解这一发现的生物和临床意义。

总之,这些结果表明,电动汽车可以代表代理标记肿瘤的复杂性,能够捕捉,在每一个时刻,疾病的发展状况和/或对治疗的反应。

因此,研究表型、浓度和货物的电动车可以打开小说未来的液体活检。

数据可用性

科学数据用于支持本研究的结果中包括文章和文件的补充信息。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Brocco d和Lanuti p .同样这项工作。

补充材料

补充表1:病人的特点。补充表2:生存分析。补充表3:单变量分析CD133 + CD326−电动汽车。补充表4:临床受益率评估根据CD133 + CD326-EV浓度。补充表5:癌症患者的基线EV浓度。补充表6:EV浓度在癌症患者在第一次放射学评估。补充表7:变异CD133 + CD326−EV水平基线浓度,根据临床受益反应评估。补充表8:蛋白质列表中确定电动汽车与健康对照组(8 a)和肺癌患者(8 b)。补充图1面板1:(A)一个地区(“platelet-free区”)的血小板(plt)秋天是画在一个SSCH / FSC-H dot-plot。(B)“platelet-free区”事件被代表LCD-H / Phalloidin-H dotplot和电动汽车被当成LCD-positive / phalloidin-negative点。 (C) EVs (LCD+/phalloidin− events) were analysed on a CD45-H/CD133-H dotplot and CD45 + events were gated; a CD45-negative logical gate was then set, and the resulting population was plotted on a (D) CD326-H/CD133-H dotplot, where CD133+/CD326−, CD133+/CD326+, and CD133−/CD326 + EVs were identified. Panel 2: (E) EVs identified as shown in A and B were represented on a CD31-H/CD41a-H dotplot, and events showing the CD31+/CD41a + phenotype were identified as platelet-derived EVs (PLT-EVs); a PLT-EVs-negative logical gate was set. (F) The PLT-EV-negative population was plotted on a CD45-H/CD31-H dotplot, and CD45 + events were identified as leukocyte-derived EVs, while the CD31+/CD45− compartment was defined as the endothelialderived EV population. Panel 3. (G) The “platelet-free area” events were identified as described in A and then represented on an LCD-H/CD235a-H dotplot; EVs were identified as LCD-positive/CD235a-negative dots. (H) Those events were analysed on a CD45-H/CD90-H dotplot, and CD45 + events were gated. A CD45-negative logical gate was set. (I) The resulting population was plotted on a CD29-H/CD90-H dotplot, where CD90+/CD29−, CD90+/CD29+, and CD90−/CD29 + EVs were identified. Supplementary Figure 2: ROC curves were calculated to determine the power of total EV (a), CD31 + EV (b), and CD133 + CD326− EV (c) concentrations as a discriminator of patients and healthy volunteers. Supplementary Figure 3: (A) Venn diagram of the identified proteins in healthy control (HC) pooled EVs and in lung cancer polled EVs. (B) Three of the six proteins (reported as red dots) identified only in cancer EVs resulted from the “cell-cell adhesion” process ( )。(C)十蛋白质识别从健康的志愿者只有在电动汽车的“调节肽酶活动”(去:0052547)。(补充材料1)

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