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肿瘤学杂志/2019/文章
特殊的问题

细胞信号通路的改变是实体肿瘤靶向治疗的一个目标

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研究文章|开放获取

体积 2019 |文章编号 2902985 | 11 页面 | https://doi.org/10.1155/2019/2902985

胸膜间皮瘤细胞株的激酶活性筛选可能发现铂类化疗患者治疗耐药的新机制

萨布丽娜博尔歇特，1，2 Pia-Maria Suckrau，1 迈克尔Wessolly，1，2 埃琳娜Mairinger，1，2 Balazs Hegedus，3 托马斯·海格，1，2 托马斯·赫罗尔德，1，2 Wildfried E. E.埃伯哈特，4，五 耶利米亚Wohlschlaeger，1，6 克莱门斯Aigner，3 艾格尼丝Bankfalvi，1，2 库尔特·维尔纳•施密德1，2et al。 罗伯特·f·h·沃尔特，1，五 费边D. Mairinger1，2

1病理，大学医院埃森，杜伊斯堡 - 埃森大学，埃森，德国研究所

2德国癌症协会(DKTK)，合作地点大学医院埃森，Hufelandstrasse 55, 45122，德国埃森

3德国埃森，杜伊斯堡-埃森大学附属埃森大学医院，西德肺中心，鲁兰克尼克胸外科和胸腔镜

4德国埃森杜伊斯堡-埃森大学附属埃森大学医院西德癌症中心肿瘤内科

五德国埃森，杜伊斯堡-埃森大学，埃森大学附属医院，西德肺中心

6德国弗伦斯堡Diakonissenkrankenhaus病理学

学术编辑器:Ewa Sierko
收到了 04年9月2019年
公认 2019年12月3日
发布时间 2019年12月23日

摘要

背景。恶性胸膜间皮瘤(MPM)是一种罕见的，主要与石棉相关，生物学上高度侵袭性的肿瘤，并与悲观的预后。以铂为基础的化疗组成的多模式治疗是治疗的选择。铂类化合物疗效较差的原因仍不清楚。激酶活性可能影响细胞对这些治疗方案的反应。材料和方法。对于这种探索性研究中，我们筛选响应于顺铂和良性对照成纤维细胞（MRC-5），用于总体磷酸化模式不同MPM细胞系（NCI-H2452，NCI-H2052，和MSTO-211H）以及激酶活性相对于到基于顺铂的治疗剂的细胞应答。我们使用高度创新的技术PamGene分析细胞激酶的细胞系在高通量的方式。通过使用酶的活性和基于荧光的测定法进行，包括凋亡，坏死，以及细胞存活率细胞状态分析。结果。顺铂改变细胞磷酸化模式，影响细胞周期、迁移、粘附、信号转导、免疫调节和凋亡。在顺铂反应细胞中，AKT1和GSK3B的磷酸化水平降低，但在耐顺铂NCI-H2452细胞中不受影响。顺铂反应细胞系中JNK1/2/3的磷酸化水平升高，而在耐顺铂的NCI-H2452细胞中磷酸化水平降低。结论。激酶的磷酸化和活性可能在细胞对细胞抑制剂的反应中发挥关键作用。顺铂的影响磷酸化模式与顺铂耐药的细胞显着特征。这些改变会对细胞周期，迁移，粘附，信号转导，免疫调节，以及相应的肿瘤细胞的凋亡一个显著影响。根据我们的结果，P38或JNK1 / 3，或通过抑制AKT1，例如诱导，BIA-6，可能是由细胞凋亡响应于基于顺铂的治疗的感应提供积极的协同效应，因此潜在地提高了临床MPM患者的预后。

1.介绍

恶性胸膜间皮瘤(MPM)是一种罕见的，主要与石棉相关的肿瘤，预后不良[1，2]。在美国，每年约有2500例间皮瘤新确诊病例，预计间皮瘤发病率将稳步下降[1，3，4]。相比之下，欧洲间皮瘤的发病率持续上升[1，2，五-7]。

除了培美曲塞，铂化合物是标准的化疗药物，也是MPM化疗的标志[8]。临床中培美曲塞与顺铂联合使用[9或卡铂[10-13]。含铂的方案具有比含有非铂类组合一个更大的活性[14]。顺铂治疗的有效率仅为14%，中位生存期不到7个月[15]。卡铂治疗导致相似的反应速率范围从6至16％[15]。铂类化合物这种效果较差的原因至今仍不完全清楚。

铂的细胞毒性是通过与铂共价结合，通过化学改变DNA碱基形成大量的DNA加合物[13]，导致DNA链间和(1和2或1和3)链内交联[16-23]。铂类化合物阻止正常细胞复制并触发细胞凋亡[18，22，24，除非基因组DNA加合物被修复[21]。

抗肿瘤药物如铂类化合物的耐药性与多种机制有关。自20世纪90年代初以来，人们就知道参与抗肿瘤耐药发展的几种蛋白的活性受蛋白磷酸化的调控[25]。特别是蛋白激酶C和其他蛋白的作用已经被描述过[26]。在过去十年里，我们的铂诱导的细胞凋亡的潜在作用的认识已经通过一些参与细胞凋亡的主要成分和工艺规范其激活的标识大大增加。已建议在细胞凋亡涵盖发挥作用的有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）激酶家族，具体的p42 / 44 ERK，p38蛋白和c-Jun N-末端激酶（JNK），环AMP依赖性蛋白激酶（PKA），蛋白激酶B（PKB）或AKT和蛋白激酶C（PKC）[27]。此外，已知不同DNA损伤基因(如ATM或ATR)的磷酸化水平影响细胞对含铂药物诱导的复制应激反应[28]。此外，已经显示在卵巢癌和肉瘤细胞中表达组成型活性JAK2顺铂显著抑制酪氨酸磷酸化和JAK2激酶活性以剂量和时间依赖的方式[29]。

在此背景下，我们的目的是调查总体磷酸化模式在基于顺铂治疗的细胞反应的影响，以及激酶活性。因此，我们分析了使用高度创新的技术PamGene以高通量的方式细胞激酶不同MPM细胞系。

2.材料和方法

2.1。细胞培养

MPM细胞系MSTO-211H（双相亚型和适度顺铂敏感）和以及细胞系NCI-H2452（肉瘤样亚型和顺铂抗性）中的Roswell Park Memorial研究所中培养的NCI-H2052（上皮样亚型和顺铂敏感）（RPMI）-1640培养基（赛默飞世尔科技，马萨诸塞州，美国）。人肺成纤维细胞系MRC-5被用作对照细胞系。MRC-5细胞在最小必需培养基（赛默飞世尔科技）中培养。所有的培养基补充有10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素（赛默飞世尔科技）。

2.2。与顺铂MPM细胞系的治疗

在每个细胞系进行分析顺铂对激酶活性的影响。Therefore, 1.6 × 10五细胞/孔接种于24孔板。在37℃和5% CO的条件下孵育12小时后2,10μ顺铂的M（Selleckchem，休斯敦，USA）加入到细胞中。After 48 h of incubation with cisplatin, protein isolation was performed according to the protocol 1160 from the PamGene platform (PamGene International B. V., Wolvenhoek, Netherlands). Therefore, cells were lysed by using M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent containing HALT phosphatase inhibitor cocktail and HALT protease inhibitor cocktail EDTA-free (Thermo Fisher Scientific). Lysed cells were harvested by using a cell scraper. Lysates were stored in 5–20 μl的温度为- 80℃。

根据制造商的说明，使用蛋白质测定试剂盒，通过荧光定量(Qubit, Thermo Fisher Scientific)测定蛋白质浓度。

2.3。蛋白酪氨酸激酶分析

蛋白酪氨酸激酶分析（PTK测定，PamGene）根据制造商的说明书进行。PamChip®-4采用30分的阻断步骤制备μl的2% BSA (PamGene)。主混料采用PTK PamChip阵列试剂盒(PamGene)制备。5μg取样品蛋白裂解液。按照mastermix的要求，将ATP (4mm) 1:25稀释。

2.4。丝氨酸/苏氨酸激酶试验

根据厂家说明进行丝氨酸/苏氨酸激酶检测(STK检测，PamGene)。PamChip®-4采用30分的阻断步骤制备μl的2% BSA (PamGene)。主混合物通过使用STK PamChip阵列试剂盒（PamGene）制备。0.5 μg取样品蛋白裂解液。按照mastermix的要求，将ATP (4mm) 1:25稀释。

2.5。激酶活性测定

应用BioNavigator软件(PamGene)对PTK和STK测定结果进行分析。

使用BioNavigator软件(PamGene)对结果进行图像分析和log2变换。基于底物磷酸化模式，使用激酶上游分析算法(BioNavigator)估计每个特异性激酶的激酶活性。根据每个激酶的特异性对每个激酶进行分类，并计算依赖性水平。为了观察顺铂治疗前后激酶活性的变化，使用KinHub平台(http://www.kinhub.org/kinmap/)。

2.6。统计分析

统计和图形分析的特定磷磷酸化水平进行了与[R统计编程环境（V3.2.3）。

在开始探索性数据分析之前，采用Shapiro-Wilk检验对数据的正态分布进行检验。在此基础上，采用了参数检验和非参数检验。对于二分变量，Wilcoxon Mann-Whitney秩和检验(非参数)或双面学生检验Ť-检验(参数)。对于大于两组的序数变量，使用Kruskal-Wallis检验(非参数)或ANOVA(参数)来检测组间差异。

使用Fisher精确检验分析了双二分列联表。为了检验排序参数与两组以上的相关性，采用皮尔逊卡方检验。计量变量之间的相关性采用Spearman秩相关检验和皮尔逊积矩相关系数进行线性建模。

由于多个统计测试，所有 使用错误发现率(FDR)调整值。统计学显著性水平定义为 后调整。

3.结果

3.1。顺铂治疗揭示了不同的磷酸化模式

对比顺铂处理(黑色条形图)和中剂(灰色条形图)，MRC-5细胞磷酸化磷酸化的变化较小(图)1、绿酒吧)。MSTO-211H细胞(蓝色条)在顺铂治疗期间出现磷酸化变化。与其他MPM细胞系相比，MSTO-211H在其磷酸化模式中有一个独特的簇。在治疗期间，与其他两种MPM细胞系相比，可以观察到类似的磷酸化模式的改变。未经处理，MSTO-211H细胞可检测到类似的磷酸化模式。然而，某些磷光石表现出明显增强的信号。NCI-H2052(红色条)和NCI-H2452(黄色条)的磷酸化模式重叠，并表现出更强的多个磷磷酸化，但未暴露在顺铂上。MRC-5一般呈现轻微的磷酸化，而不考虑各自的磷光石和处理。


图1
细胞和治疗之间磷酸化模式的热图。MRC-5由上的绿色指示所示ÿ轴，并显示比较顺铂治疗和介质时次要的磷酸化的变化。蓝色指示灯（ÿ-axis)显示MSTO-211H，显示该细胞系在顺铂治疗期间发生磷酸化变化。与其他MPM细胞系相比，MSTO-211H细胞具有明显的磷酸化模式。在治疗期间，可以看到其他两种MPM细胞系磷酸化模式的轻微转变。NCI-H2052(红色)和NCI-H2452(黄色)的磷酸化模式重叠，在治疗过程中表现出更强的多个磷光磷酸化。相反，MSTO-211H细胞的磷酸化水平呈中度到轻度升高。相比之下，MRC-5细胞普遍存在轻微的磷酸化，而与各自的磷光石和处理无关。

总的来说，54个磷酸在顺铂治疗期间磷酸化水平显著改变。52例显示由于治疗导致磷酸化状态降低，而2例(PPR1A和FOXO3)显示磷酸化诱导。在图2，与磷酸化最显著的变化10磷酸化位点后，用顺铂处理所示（ 数值显示在Suppl中。表格1)。酪氨酸磷酸化phosphosite的显著减少全球可概述。没有丝氨酸/苏氨酸激酶生物学相关的意义进行了监测。


图2
10个影响顺铂治疗的磷。在ÿ轴，相应蛋白的磷酸化位被示出。Ëach box summarizes the results for all four cell lines, being measured in triplicates (dark blue = medium and light blue = cisplatin). To make the results comparable, theX轴描绘了一个无量纲ž分数。一个显著的，全面的减少酪氨酸磷磷酸可以观察到。监测的丝氨酸/苏氨酸激酶无显著性差异。图集中在前10个变化上，因为以后的箱线图将会重复出现。总的来说，77个磷酸在顺铂治疗期间磷酸化水平显著改变。 值在Suppl中被描述。表格1。

通过比较不同细胞系间磷酸化水平的显著变化，发现有62种改变。大部分差异[29在MSTO-211H和MRC-5对照细胞株(Suppl)之间可以观察到。表格2)。热图显示的结果显示，所有目标的信号都明显减少。NCI-H2452和MRC-5之间有15个差异，同样，都是低磷酸化水平。在NCI-H2052和MRC-5之间，在肿瘤细胞中可以观察到10个显著的高磷酸化位点。MSTO-211H和NCI-H2452之间，NCI-H2452细胞中，3个磷酸(CD3Z, EGFR，和GSK3的ase)磷酸化水平较高，4个磷酸(EFS, ENOG, EPHA7，和PTN6)磷酸化水平较低。在NCI-H2052和MSTO-211H之间，以及NCI-H2052和NCI-H2452之间，未观察到磷酸化水平的显著变化。

3.2。不同磷酸化模式对顺铂反应的影响

总的来说，磷磷的高磷酸化(Suppl。表格3）导致对顺铂的治疗抗性。一般情况下，24个磷酸化位似乎影响到基于顺铂的治疗方案的细胞应答。各磷酸化位示于增刊。表格3。其中，ESR1、LAT、PTN12和PTN6的高磷酸化抑制凋亡作用最强。circos图(图3)描述了激酶高或低磷酸化的频率以及它们对顺铂的反应性。


图3
Circos用顺铂处理后的高或低的细胞凋亡比例相关高和低磷酸化的磷酸化位的曲线图。高和磷酸化位点的磷酸化的低分别表示用“+”或“ - ”。
3.3。生物相关性和受影响的细胞途径

分析各细胞系MAPK信号通路(KEGG hsa04010)、细胞周期(KEGG hsa04110)和肿瘤通路(KEGG hsa05200)的磷酸化模式。绿色标签表示顺铂磷酸化的诱导，红色标签表示磷酸化的降低(Suppl)。数据1-3)。在MAPK信号通路中，顺铂可降低各细胞系中受体酪氨酸激酶(特别是EGFR、EPHA2和KDR)以及RASA1、RAF1和AKT1的磷酸化。在细胞周期通路中，顺铂降低了各细胞系的GSK3B、CDK2和CDK1，在癌症通路中，顺铂降低了GSK3B、AKT1、PDGFRa/b、PLCG1/2和CDK2的磷酸化。在NCI-H2452细胞中，顺铂对磷酸化的抑制作用较其他细胞系弱(红色表示)。

在NCI-H2052和MSTO-211H中，促进细胞粘附/迁移和膜特性的蛋白簇对顺铂处理有显著的反应。EPHA1(增刊。数字4BEPHA2(增刊)。数字4C),EPHA7(增刊。数字4DEFS(增刊)。数字6 b），EPB41，PTK2B（增刊图6 d)， FER, FES, KIT。数字5A)、PXN、PECAM1、PDGFRB、KDR数字6，而在顺铂治疗期间，ZAP70显示了类似的磷酸化变化 后Bonferroni校正;表格1)。该PTK磷酸化位点的磷酸化在一般的成纤维细胞是很低的。在NCI-H2452，顺铂治疗导致相对于所提到的蛋白的低磷酸化减少的。相反，NCI-H2052表现出更强的减少提到的磷酸化位点的磷酸化。MSTO-211H显示的中间到强响应相对于还原的磷酸化的顺铂治疗期间。顺铂治疗导致EFS磷酸化大的变化，如磷酸化的显着的方式的所有细胞系降低（ )。在MRC-5细胞中，在顺铂治疗期间，磷光石不再磷酸化。EFS的结果显示在Suppl中。数字6 b。
Phosphosites 价值 Bonferroni-adj。 价值
酪氨酸-蛋白磷酸酶非受体型11 (EC 3.1.3.48)(蛋白-酪氨酸磷酸酶2C) (PTP-2C) (PTP-1D) (SH-PTP3) (SH-PTP2) (SHP-2) (Shp2). _ptn11 - 57_67_q06124 1.58Ë−10 1.40Ë−08年
-烯醇化酶(EC 4.2.1.11)(2-磷酸- d -甘油水解酶)(神经烯醇化酶)(神经元特异性烯醇化酶)(NSE)(烯醇化酶2)_ENOG_37_49_P09104 2.23Ë−10 1.99Ë−08年
酪氨酸蛋白磷酸酶非受体类型6（EC：3.1.3.48）_PTN6_531_541_P29350 6.41Ë−09年 5.71Ë−07
Paxillin._PAXI_24_36_P49023 8.74Ë−09年 7.78Ë−07
酪氨酸蛋白激酶JAK2 (EC 2.7.10.2) (janus kinase 2) (JAK2 -2)_JAK2_563_577_O60674 3.28Ë−08年 2.92Ë−06
胚胎fyn相关底物(HEFS)_EFS_246_258_O43281 3.38Ë−08年 3.01Ë−06
甲型肝炎病毒细胞受体2、t细胞免疫球蛋白和粘蛋白含域蛋白3、t细胞膜蛋白3 4.21Ë−08年 3.75Ë−06
原癌基因酪氨酸蛋白激酶fes/Fps (EC 2.7.10.2) (C-Fes)_FES_706_718_P07332 5.51Ë−08年 4.91Ë−06
b细胞抗原受体复合物相关蛋白-链前体(ige -alpha) (MB-1膜糖蛋白)(表面igm相关蛋白)(膜结合免疫球蛋白相关蛋白)(CD79a抗原)_CD79 A_181_193_P11912 5.72Ë−08年 5.09Ë−06
酪氨酸蛋白激酶FRK (EC 2.7.10.2) (fynrelated kinase) (nuclear tyrosine protein kinase RAK)_FRK_380_392_P42685 6.73Ë−08年 5.99Ë−06
NA_ART_004_EAIYAAPFAKKKXC_NA 7.47Ë−08年 6.65Ë−06
酪氨酸蛋白激酶JAK1 (EC 2.7.10.2) (janus kinase 1) (jakus -1)_JAK1_ 1027_1039_P23458 8.05Ë−08年 7.17Ë−06
胰岛素受体底物2_IRS2_626_638_Q9Y4H2 9.51Ë−08年 8.47Ë−06
肝细胞生长因子受体前体(EC 2.7.10.1) (HGF受体)(散点因子受体)(SF受体)(HGF/SF受体)(Met原癌基因酪氨酸激酶)(c-Met)_MET_1228_1240_P08581 1.22Ë−07 1.08Ë−05
Paxillin._PAXI_111_123_P49023 1.42Ë−07 1.26Ë−05
磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基(PI3-kinase p85亚基)(pttin -3-kinase p85-) (PI3K)_P85 A_600_612_P27986 1.81Ë−07 1.61Ë−05
原癌基因酪氨酸蛋白激酶受体ret前体(EC 2.7.10.1) (C-ret)_RET_1022_1034_P07949 1.89Ë−07 1.68Ë−05
1-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸磷酸二酯酶-1 (EC 3.1.4.11)(磷酸肌醇磷脂酶C) (plc - -1)(磷脂酶- - -1)(PLC-II) (PLC-148)_PLCG1_764_776_P19174 2.18Ë−07 1.94Ë−05
蛋白酪氨酸激酶2的β（EC 2.7.10.2）（粘着斑激酶2）（FADK 2）（ - 富含脯氨酸的酪氨酸激酶2）（细胞粘附激酶测试版）（CAK测试版）（钙依赖性酪氨酸激酶）（CADTK）（相关粘着斑酪氨酸激酶）（RAFTK）_FAK2_572_584_Q14289 2.55Ë−07 2.27Ë−05
Linker for activation of T-cells family member 1 (36 kDa phospho-tyrosine adapter protein) (pp36) (p36-38)_LAT_249_261_O43561 2.63Ë−07 2.34Ë−05
肥大/干细胞生长因子受体kit (EC:2.7.10.1)， CD117_KIT_930_942_C942S_P10721 2.91Ë−07 2.59Ë−05
酪氨酸蛋白激酶zapo -70 (EC 2.7.10.2) (70 kDa zeta相关蛋白)(syk相关酪氨酸激酶)_ZAP70_313_325_P43403 2.92Ë−07 2.60Ë−05
细胞分裂蛋白激酶1 (EC:2.7.11.22, EC:2.7.11.23)、细胞分裂蛋白激酶1、细胞分裂控制蛋白2同源物、p34蛋白激酶(CDK1)_CDK1_9_21_P06493 2.94Ë−07 2.61Ë−05
促红细胞生成素受体前体(epor)_EPOR_361_373_P19235 4.82Ë−07 4.29Ë−05
1-磷脂酰肌醇4,5-二磷酸磷酸二酯酶-2 (EC:3.1.4.11)(磷酸肌醇磷脂酶c - -2) (PLC-IV)(磷脂酶c - -2) (plc - -2)_PLCG2_1191_1203_C1200S_P16885 5.38Ë−07 4.79Ë−05
血小板内皮细胞黏附分子前体(PECAM-1) (EndoCAM) (GPIIA’)(CD31抗原)_PECA1_708_718_P16284 5.64Ë−07 5.02Ë−05
血小板内皮细胞粘附分子前体（PECAM-1）（EndoCAM）（GPIIA'）（CD31抗原）_PECA1_706_718_P16284 5.64Ë−07 5.02Ë−05
细胞周期蛋白依赖性激酶2（EC：2.7.11.22）细胞分裂蛋白激酶2（EC 2.7.11.22）（P33蛋白激酶）_CDK2_8_20_P24941 6.07Ë−07 5.40Ë−05
RAC-a丝氨酸/苏氨酸激酶(EC:2.7.11.1) _AKT1_320_332_P31749 8.65Ë−07 7.70Ë−05
肝配蛋白A型受体7前体（EC 2.7.10.1）（酪氨酸 - 蛋白激酶受体EHK-3）（EPH同源激酶3）（受体蛋白酪氨酸激酶HEK11）_EPHA7_607_619_Q15375 8.96Ë−07 7.98Ë−05
血管内皮生长因子受体2前体(EC 2.7.10.1) (VEGFR-2)(激酶插入域受体)(蛋白酪氨酸激酶受体Flk-1) (CD309抗原)_VGFR2_989_1001_P35968 1.15Ë−06 0.00010243
髓鞘蛋白零样蛋白1_MPZL1_236_246_O95297 1.16Ë−06 0.00010287
酪氨酸蛋白磷酸酶非受体型6 (EC:3.1.3.48)_PTN6_558_570_P29350 1.30Ë−06 0.00011555
原癌基因酪氨酸蛋白激酶FER（EC 2.7.10.2）（P94-FER）（C-FER）（酪氨酸激酶3）_FER_707_719_P16591 1.47Ë−06 0.00013057
表皮生长因子受体前体(EC 2.7.10.1)(受体酪氨酸蛋白激酶ErbB-1)_EGFR_1165_1177_P00533 1.68Ë−06 0.00014992
配对中胚层homeobox蛋白2(配对相关homeobox蛋白2)_PRRX2_202_214_Q99811 1.84Ë−06 0.00016357
3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1 (EC 2.7.11.1) (hPDK1)_PDPK1_2_14_O15530 2.07Ë−06 0.00018412
受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2前体(EC 2.7.10.1) (p185erbB2) (C-erbB-2) (neu原癌基因)(酪氨酸激酶型细胞表面受体HER2) (MLN 19) (CD340抗原)_ERBB2_870_882_P04626 2.73Ë−06 0.00024328
t细胞表面糖蛋白CD3 epsilon链，t细胞表面抗原T3/Leu-4 epsilon链，CD3e_CD3E_182_194_P07766 2.84Ë−06 0.00025288
3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1 (EC 2.7.11.1) (hPDK1)_PDPK1_369_381_O15530 3.02Ë−06 0.00026873
肝细胞生长因子受体前体(EC 2.7.10.1) (HGF受体)(散点因子受体)(SF受体)(HGF/SF受体)(Met原癌基因酪氨酸激酶)(c-Met 3.42Ë−06 0.0003046
Ras gtpase激活蛋白1 (gtpase激活蛋白)(GAP) (Rasp21 protein activator) (p120GAP) (RasGAP)_RASA1_453_465_P20936 4.01Ë−06 0.00035652
B和t淋巴细胞衰减器，B和t淋巴细胞相关蛋白，CD272_BTLA_252_262_Q7Z6A9 4.20Ë−06 0.00037375
40号核糖体蛋白S6(磷酸蛋白NP33)_RS6_228_240P62753 1.57Ë−05 0.00139465
早期E1A 32 kDa 2.12Ë−05 0.00188822
酪氨酸 - 蛋白激酶JAK3（EC：2.7.10.2）（Janus激酶3）（JAK3）_JAK3_974_986_P52333 2.20Ë−05 0.00196214
camp依赖的蛋白激酶ii型调节亚单元_kap3_107_119p31323 2.76Ë−05 0.00245874
胰岛素受体底物1_IRS1_890_902_P35568 3.07Ë−05 0.00272913
Ephrin a型受体2前体(EC 2.7.10.1)(酪氨酸蛋白激酶受体ECK)(上皮细胞激酶)_EPHA2_765_777_P29317 7.62Ë−05 0.00677916
原癌基因酪氨酸蛋白激酶LCK (EC 2.7.10.2) (p56-LCK)(淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶)(LSK) (t细胞特异性蛋白酪氨酸激酶)_LCK_387_399_P06239 0.00012233 0.01088757
t细胞表面糖蛋白CD3 zeta链前体(t细胞受体T3 zeta链)(CD247抗原)_CD3Z_77_89_P20963 0.00013128 0.01168433
蛋白4.1(4.1带)(P4.1) (EPB4.1) (4.1 R)_41_654_666_P11171 0.0001331 0.01184597
Pleckstrin(血小板p47蛋白)_PLEK_106_118P08567 0.00013359 0.01188922
酪氨酸蛋白激酶zapo -70 (EC 2.7.10.2) (70 kDa zeta相关蛋白)(syk相关酪氨酸激酶)_ZAP70_485_497_P43403 0.00014176 0.01261638
Ephrin a型受体1前体(EC 2.7.10.1)(酪氨酸蛋白激酶受体EPH)_EPHA1_774_786_P21709 0.00019104 0.01700258
糖原合酶激酶-3 (EC:2.7.11.26)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶GSK3B (EC:2.7.11.1)_GSK3B_210_222_C218S_P49841 0.00030404 0.0270594
受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2前体(EC 2.7.10.1) (p185erbB2) (C-erbB-2) (neu原癌基因)(酪氨酸激酶型细胞表面受体HER2) (MLN 19) (CD340抗原)_ERBB2_679_691P04626 0.00041011 0.0364998
RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸 - 蛋白激酶（EC 2.7.11.1）（RAF-1）（C-RAF）（CRAF）_RAF1_332_344_P04049 0.00051147 0.04552087
表格1
顺铂治疗后显著磷酸化的变化（ 价值观和Bonferroni-adjusted 值)。

顺铂导致AKT1磷酸化的降低，影响三个AKT1磷酸中的一个(Suppl)。数字6摄氏度)。磷酸化的MRC-5细胞是低的，而不管处理的。NCI-H2052表明治疗过程中AKT1的磷酸化最强的变化。类似的结果发现PTK2B（增刊图6 d)，是AKT1的上游调节因子。顺铂治疗NCI-H2052和MSTO-211H时磷酸化水平降低，而其他细胞系表现出较小的反应。PDGFRB和KDR磷酸化也出现了上述相似的磷酸化变化。两者都有助于AKT1的激活。

另外的蛋白质介导间和细胞内信号转导（ARAF，EPHA1，EPHA2，EPHA7，KIT，PTPN11，PIK3R1，PTPN6，和KDR）显示类似的结果，如所描绘的增刊。数据4-6。磷酸化的变化是多余的结果之前提到的。

治疗过程中，BTLA、CD3E、CD247、CD79A、PTK2B、HAVCR2、PECAM1和ZAP70调节免疫反应并显示差异磷酸化。NCI-H2052表现出顺铂治疗过程中这些蛋白质的磷酸化最强的下降。此外，磷酸化相比调查了其它细胞系治疗前高得多。类似的高磷酸化也NCI-H2452发现治疗前，但磷酸化相比，NCI-H2052治疗期间减少较少。磷酸化MSTO-211H低得多相比于其他两个MPM细胞系。在治疗期间，只有磷酸化的微小降低被用于蛋白质调节免疫反应进行监测。MRC-5磷酸化一般较低，但在治疗期间降低到不可测量的程度。

蛋白驱动细胞周期控制的磷酸化显示出在治疗期间（CDK1，CDK2，EPHA1，EPHA2，EPHA7，ENO2，PTK2B，FER，FES，FRK，KIT，PDGFRB，和KDR）的重大变化。这些变化类似于上面给出的结果。再次，NCI-H2052表现最强的变化，其次是NCI-H2452。类似的，但与一般的低磷酸化，MSTO-211H是与其他两个MPM细胞系相媲美。再次，MRC-5呈现与所报告的蛋白质的通常低的磷酸化和降低期间疗法在大多数情况下，磷酸化缺席由于顺铂处理。

3.4。上游激酶分析

激酶树木对于每种细胞系（增刊创建。图9-9 d)。在所有四种细胞系中，受影响最大的激酶是酪氨酸激酶家族(如ALK、FES和ZAP70)和CMGC激酶(如CDK1、CDK2和ERK1)。

如乐谱图和火山图所示。数据7-8），NCI-H2052细胞显示在FGFR1，FES，以及ALK的激酶活性的2.5-3倍的降低，由于顺铂治疗，具有高特异性得分（2，暗红色），用于相应的磷酸化位。在NCI-H2052，以及在MRC-5细胞，ERK1 / 2和CDK1的激酶活性为2.3倍增加，由于顺铂处理。在MRC-5细胞，HER2，FLT3，和EGFR的激酶活性显示出非常强的降低（6-9.5倍）具有高特异性（2，暗红色）10各自的磷酸化位。在MSTO-211H细胞，激酶活性通过10个磷酸化位具有高度特异性降低（3-4倍）。激酶活性略有下降（0.4-0.7倍）在NCI-H2452为FAK1，罗恩，SRC，CK1和COT。

4.讨论

铂化合物是标准的化疗药物，也是MPM与培美曲塞联合化疗的标志[三十]。然而，含铂治疗方案表现出不满意的反应。因此，我们研究了MPM细胞系对顺铂的不同反应(NCI-H2052:高凋亡反应，MSTO-211H:稀疏凋亡反应，NCI-H2452:无反应)。我们筛选细胞整体磷酸化模式以及激酶活性与细胞对基于顺铂的治疗的反应。我们使用高度创新的技术PamGene分析细胞激酶的细胞系在高通量的方式。

在我们的研究中，我们可以证明在所有细胞系的磷酸化模式，由于顺铂治疗差异。总体而言，增加的磷酸化后，除了顺铂的指示自适应机制从顺铂的效果逃跑。在ESR1的特别高的磷酸化，LAT，PTN12和PTN6显示出抗凋亡作用。PTN12具有去磷酸化的功能，从而影响细胞信号级联[31]。它去磷酸化细胞酪氨酸激酶，如ERBB2和PTK2B。ERBB2编码HER2/neu，通过RAS-MAP激酶途径刺激增殖抑制细胞凋亡[32，33]。在NCI-H2452细胞中，与其他细胞系相比，ERBB2的磷酸化水平没有降低。因此，提示该机制在该细胞系中发挥作用，支持其对顺铂的耐药。

治疗过程中，BTLA、CD3E、CD247、CD79A、PTK2B、HAVCR2、PECAM1和ZAP70调节免疫反应并显示差异磷酸化。BTLA的激活导致CD8的抑制+癌症特异性t细胞(34]。BTLA显示，所有细胞系降低磷酸化水平，但我们没有发现在细胞状态分析鉴别磷酸化模式的任何细胞的影响。尽管如此，我们推测这是关于顺铂治疗MPM患者的一个重要因素。抗性机制可能是通过激酶抑制剂的挑战，调节对顺铂的免疫应答。

Gao等研究发现，AKT在GSK3B和PTEN的表达和磷酸化升高与细胞活力、迁移和凋亡相关，这可能与乳腺癌化疗耐药性有关[35]。在NCI-H2052中，我们可以降低顺铂对AKT1和GSK3B的磷酸化，从而诱导该细胞系凋亡。顺铂处理和未处理的NCI-H2452细胞AKT1磷酸化无明显变化。AKT抑制剂苯并噻吩嘧啶衍生物(BIA-6)可有效阻断肺癌细胞中PI3K/AKT通路，并呈剂量依赖性，增加细胞凋亡[36]。根据我们的数据，铂基治疗可能具有协同效应。BIA-6也有可能提高顺铂在NCI-H2452细胞中的效率。

在NCI-H2052和MRC-5细胞中，由于顺铂治疗，p38和ERK1/2的激酶活性增加。Hsieh等人也评估了鼻咽癌ERK1/2和p38磷酸化水平的升高，并通过caspases的激活观察了这一影响[37]。这证实了我们的观察，因为NCI-H2052和MRC-5对顺铂的凋亡反应最高。凋亡率较低的MSTO-211H细胞中，p38和ERK1/2的活性略有增加，而无反应的NCI-H2452细胞中，p38激酶活性下降。

Zhao等人观察到，在含铂药物治疗期间，高表达磷酸化的c-Jun n -末端激酶(JNK)导致卵巢癌细胞凋亡增加，进而导致p53表达水平升高[38]。这支持了我们在NCI-H2052和MRC-5中观察到的，在耐顺铂的NCI-H2452细胞中，JNK1/2/3活性升高，JNK1/3磷酸化降低。Bar等发现活化转录因子3 (ATF3)是顺铂细胞毒性的重要调控因子，在铂敏感的肺癌细胞中由于顺铂的治疗而被激活[39]。在铂敏感细胞中，顺铂诱导JNK的激活，从而诱导ATF3。在他们的耐药细胞系中，JNK的诱导缺失。在他们的研究中，他们测试了fda批准的组蛋白去乙酰化酶抑制剂vorinostat与顺铂一起对肺癌细胞系Calu-6和NCI-H23细胞的协同细胞毒性。由于NCI-H2452细胞中JNK仍有活性，因此在该细胞系中检测该组蛋白去乙酰化酶抑制剂也是很有意义的。

5.结论

激酶的磷酸化和活性可能在细胞对细胞抑制剂的反应中发挥关键作用。顺铂治疗导致MPM细胞系和肺成纤维细胞系磷酸化模式的改变。这些改变对细胞周期、迁移、粘附、信号转导、免疫调节和细胞凋亡都有影响。与对顺铂有反应的细胞相比，对顺铂耐药的MPM细胞表现出明显的磷酸化模式，表明其具有特异性的敏感性。我们的结果表明，通过BIA-6抑制AKT1，或通过另一种途径诱导MAPK通路的p38或JNK1/3，可能通过诱导以顺铂为基础的治疗的凋亡反应而产生正的协同效应，从而可能提高患者的临床结果。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的数据是可用的，请相应的作者。

的利益冲突

所有作者指出，他们没有利益申报冲突。

作者的贡献

罗伯特·f·h·沃尔特(Robert F. H. Walter)和费边·d·迈林格(Fabian D. Mairinger)对这项研究同样做出了贡献。

补充材料

增刊。图1:A: NCI-H2502, B: NCI-H2452, C: MSTO-211H, D: MRC-5的MAPK信号通路。增刊。图2:A: NCI-H2502, B: NCI-H2452, C: MSTO-211H, D: MRC5的细胞周期通路。增刊。图3:A: NCI-H2502, B: NCI-H2452, C: MSTO-211H, D: MRC-5的肿瘤通路。增刊。图4:所有细胞系中A: ARAF, B: EPHA1, C: EPHA2, D: EPHA7的磷酸化水平。对于每个细胞系，在顺铂治疗(Cis)之前和之后的磷酸化水平被描述。增刊。 Figure 5: phosphorylation level of A: KIT, B: PTPN11, C: PIK3R1, and D: PTPN6 in all cell lines. For each cell line, phosphorylation levels are depicted before (medium) and after cisplatin treatment (Cis). Suppl. Figure 6: phosphorylation level of A: KDR, B: EFS, C: AKT1, and D: PTK2B/FAK2 in all cell lines. For each cell line, phosphorylation levels are depicted before (medium) and after cisplatin treatment (Cis). Suppl. Figure 7: score plots and volcano plots of PTK upstream kinase analysis: A: score plot of PTK upstream kinase analysis for NCI-H2052 cells. B: volcano plot of PTK-upstream kinase analysis for NCI-H2052 cells. C: score plot of PTK-upstream kinase analysis for NCI-H2452 cells. D: volcano plot of PTK-upstream kinase analysis for NCI-H2452 cells. E: score plot of PTK-upstream kinase analysis for MSTO-211H cells. F: volcano plot of PTK-upstream kinase analysis for MSTO211H cells. G: score plot of PTK-upstream kinase analysis for MRC-5 cells. H: volcano plot of PTK upstream kinase analysis for MRC-5 cells. Suppl. Figure 8: score plots and volcano plots of STK upstream kinase analysis: A: score plot of STK upstream kinase analysis for NCI-H2052 cells. B: volcano plot of STK upstream kinase analysis for NCI-H2052 cells. C: score plot of STK upstream kinase analysis for NCI-H2452 cells. D: volcano plot of STK upstream kinase analysis for NCI-H2452 cells. E: score plot of STK upstream kinase analysis for MSTO-211H cells. F: volcano plot of STK upstream kinase analysis for MSTO211H cells. G: score plot of STK upstream kinase analysis for MRC-5 cells. H: volcano plot of STK upstream kinase analysis for MRC-5 cells. Suppl. Figure 9: kinase-tree of A: NCI-H2052, B: MSTO-211H, C: NCI-H2452, and D: MRC-5. Suppl. Table 1: 顺铂治疗期间受影响的磷酸化位点的值。增刊。表2：显著改变了不同的细胞系之间的磷酸化水平。增刊。表格3: association of phosphosite phosphorylation (“+” = high and “−” = low phosphorylation) to apoptosis ratio of cells after cisplatin treatment.（补充材料）

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