PPAR提高癌症细胞通过自噬诱导化疗敏感性

文摘

PPARα(peroxisome-proliferator-activated受体α)发挥了至关重要的作用调节炎症和癌症,而PPAR的监管机制α癌症细胞自噬还不清楚。在这里我们发现PPARα增强的自噬在HEK293T、SW480希拉细胞系,是PPAR的独立α转录活动。PPARα诱导凋亡Bcl2蛋白质降解导致释放Beclin-1 / VPS34复杂。一直沉默,PPARα推翻了这个事件。PPARα全身的自噬显著抑制肿瘤的生长和增强SW480癌细胞对化疗药物的敏感性。此外,PPARα受体激动剂SW480癌症细胞化疗敏感性增加。这些发现揭示了小说的PPAR机制α/ Bcl2 /自噬途径抑制肿瘤发展和增强化疗的敏感性,这是一个潜在的药物对癌症治疗的目标。

1。介绍

作为核激素受体家族之一,peroxisome-proliferator-activated受体α(PPARα配体依赖性转录因子)。配体PPAR绑定和激活α二聚化rxr(类维生素a X受体)导致绑定peroxisome-proliferator响应元件(PPRE: AGGTCA AGGTCA N, N是任何核酸)调节目标基因的表达,参与动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖、炎症和癌症(1- - - - - -7]。临床观察表明,PPAR的表情α造成乳腺癌和卵巢癌的生存(8,9]。PPAR的合成配体α包括非诺贝特、氯贝酸和wyeth14,643抑制肿瘤细胞增殖2,5]。作为核受体,PPARγ诱发NFκB / p65和MUC1-C独立于其转录活性[泛素化和降解2,3]。同样,PPARα作为E3连接酶诱导Bcl2泛素化和退化导致癌细胞凋亡增加化疗药物反应(6]。凋亡蛋白、Bcl2抑制自噬信号通过绑定Beclin-1抑制Beclin-1 / VPS34复杂[10]。自噬了胞质材料(蛋白质、脂质等)或细胞器(线粒体、细胞核等)为降解溶酶体,也是一个进步的养分循环(11]。自噬作用癌细胞生存在营养不足;然而,癌症细胞消耗所有的地窖组件导致细胞死亡(11,12]。其他报告显示,ligand-activated PPARα上调自噬通过PPAR AML12细胞或肝α介导autophagy-associated基因表达式(13),而在这里,我们发现PPARα诱导肿瘤细胞自噬独立的转录活动释放Beclin-1 / VPS34复杂。

2。结果

2.1。PPARα诱发自噬独立的转录活动

免疫印迹分析表明,PPARαSW480的shRNA沉默显著降低LC3-II水平,海拉,HEK293T细胞系(图1(一))。转染GFP-LC3 SW480细胞显示PPAR质粒α沉默自噬小体的形成和减少GFP-LC3 puncta(图1 (b)),这是与透射电子显微镜分析(图一致1 (c))。Ligand-activated PPARα促进自噬诱导autophagy-associated AML12细胞或肝脏的基因表达式(LC3a LC3b,等等)。13]。为了进一步检测是否PPARα介导的自噬是参与autophagy-associated基因表达式,qPCR进行分析。结果表明,PPARα没有显著的影响(SFigure autophagy-associated基因表达式。1)。相比之下,PPAR的过度α在SW480细胞增加了LC3-II水平(图2(一个))和GFP-LC3 puncta(图2 (b)),它没有影响(SFigure autophagy-associated基因表达式。2),这表明PPARα提升癌症细胞自噬独立的转录活动。我们先前的结果表明,PPARα诱导凋亡Bcl2蛋白质泛素化和退化6]。进一步的分析表明,PPARα诱导Bcl2退化,虽然没有影响SW480细胞(SFigure caspase-3的激活。3),这表明PPARα全身Bcl2退化没有对癌细胞凋亡的影响。

2.2。PPARα介导Bcl2降解增加Beclin-1 / VPS34复杂

我们的研究结果表明,PPARα诱导肿瘤细胞自噬对autophagy-associated基因表达式没有影响。为了进一步检测PPARα诱导肿瘤细胞自噬独立于其转录活性,PPARα核位置信号(NLS)被删除和SW480细胞中过表达。结果表明,PPARα/ΔNLS没有定位到核免疫印迹分析(图3(一个)),而PPARα/ΔNLS仍然诱导自噬(图3 (b))。这些研究结果进一步证明了PPARα介导的自噬是独立的转录活动、Bcl2与Beclin-1导致中断Beclin-1 / VPS34复杂和自噬抑制[14]。我们之前发现PPAR的显示α充当E3泛素连接酶诱导Bcl2[泛素化和降解6]。与此一致的是,细胞质PPARα减少Bcl2蛋白质含量相应增加LC3-II水平(图3 (b))。进一步检测是否Bcl2 PPAR降解α导致Beclin-1 / VPS34复杂的增加,免疫沉淀反应进行了分析。结果表明,PPAR的过度α增加了Beclin-1 / VPS34复杂与Bcl2蛋白质含量的减少(图有关3 (c))。相比之下,PPARαshRNA沉默逆转这一事件(图3 (d)),这表明PPARα介导Bcl2降解增加Beclin-1 / VPS34复杂导致自噬诱导。

2.3。PPARα/自噬信号抑制肿瘤的发展

检测PPAR的效果α介导的自噬在肿瘤进展,异种移植肿瘤模型。结果表明,PPARα促进肿瘤的生长(图shRNA沉默4(一)重量(图)和增加肿瘤4 (b))。免疫印迹分析利用肿瘤溶解产物表明沉默PPARαLC3-II水平降低和增加Bcl2蛋白质水平(图4 (c))。这些发现表明,PPARα介导的自噬抑制肿瘤恶化,参与Bcl2蛋白质水平降低。

2.4。PPARα受体激动剂提高Autophagy-Mediated肿瘤抑制

SW480细胞被PPAR对待α受体激动剂(安妥明);结果表明,安妥明显著增加自噬体(图积累5(一个))。为了进一步检测是否PPAR agonist-induced自噬α依赖,PPARα与安妥明shRNA沉默SW480细胞治疗。结果表明,PPAR保持沉默αLC3-II水平没有显著影响反应安妥明(图5 (b)),这表明安妥明PPAR诱导自噬α端依赖的方式。进一步分析表明,安妥明Bcl2蛋白质水平降低(图5 (c))。此外,PPAR激动剂α并不影响(SFigure autophagy-associated基因表达式。4)。试验表明,PPAR异种移植小鼠模型α受体激动剂安妥明显著抑制肿瘤的生长(图6(一)重量(图)和肿瘤6 (b))。的在活的有机体内肿瘤组织进一步证明兴奋剂安妥明Bcl2蛋白质水平降低和增加LC3-II水平(图6 (c))。这些发现表明,PPAR激动剂增强autophagy-mediated肿瘤抑制α端依赖的方式,并没有参与autophagy-associated基因表达式。

2.5。PPARα/自噬信号增加化疗对肿瘤细胞的敏感性

进一步检测自噬与化疗药物之间的相互作用,SW480细胞治疗与化疗药物(喜树碱、紫杉醇、依托泊苷、顺铂),结果表明,虽然这些药物LC3-II水平增加,PPAR的过度α显著增强这个事件(图7(一))。相比之下,PPARα沉默吞噬细胞抑制化疗药源性(图7 (b)),这表明PPAR化疗药物诱导自噬α端依赖的方式。以上数据表明,配体诱导自噬PPARα端依赖的方式。与此一致的是,安妥明增强cisplatin-induced自噬,在PPAR终止α沉默SW480细胞(图7 (c))。这些发现表明,PPAR激动剂增强化疗药源性自噬α端依赖的方式。在活的有机体内异种移植小鼠模型分析表明,安妥明与顺铂明显抑制肿瘤的生长(图7 (d)重量(图)和减少肿瘤7 (e))。的在活的有机体内肿瘤组织进一步证明了氯贝酸受体激动剂/顺铂显著增加LC3-II水平(图7 (f))。这些发现表明,PPARα/ Bcl2 /自噬信号增加化疗对癌细胞(图7 (g))。

3所示。讨论

自噬是一种守恒的生化分解过程提供胞质材料或细胞器降解溶酶体,也是一个进步的养分循环(11]。自噬起着重要的作用在癌症细胞代谢适应生存,消化细胞内蛋白质和细胞器以应对营养不足(11,12]。尽管饥饿下自噬增加细胞的生存压力,长期自噬没有新营养补给主要消耗所有可用的基质和死亡(autophagy-associated细胞死亡)11,12]。因此,自噬是II型程序性细胞死亡(12]。作为核转录因子,PPARα在调节基因转录中起着重要的作用。其他报告显示,ligand-activated PPARα通过PPAR AML12细胞或自噬增加肝脏α介导autophagy-associated基因表达式如LC3a和LC3b肝细胞或肝组织(13]。然而,PPAR的效果α癌症细胞自噬还不清楚。在这里我们发现PPARα显著诱导肿瘤细胞自噬,这是独立于其转录活性。同样,PPAR激动剂增强癌症细胞自噬α端依赖的方式,也是PPAR独立的α转录活动。这些发现揭示PPAR的新机制α介导肿瘤细胞自噬。作为凋亡蛋白,Bcl2与Beclin-1导致中断Beclin-1 / VPS34复杂和自噬抑制[14]。原癌基因,Bcl2抑制细胞凋亡在癌症发展,广泛表达于各种恶性肿瘤,如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌(15],它起着至关重要的作用在正常组织内稳态的维持和不受控制的细胞增殖(12,16]。我们之前的研究表明,PPARα是独立于其转录活性诱导Bcl2[泛素化和降解6];在这里我们发现PPARα细胞质Bcl2蛋白质水平降低和增加LC3-II水平。进一步的分析表明,PPARα介导Bcl2退化导致增加Beclin-1 / VPS34复杂的形成,促进自噬的过程(14]。我们进一步发现PPAR的关系α/ Bcl2 /自噬在肿瘤恶化信号。受体激动剂(安妥明)显著降低Bcl2蛋白质含量和增加PPAR自噬和抑制肿瘤的发展α端依赖的方式,这表明PPARα可能是一个潜在的药物对癌症治疗的目标。更重要的是,化疗药物(喜树碱、紫杉醇、依托泊苷、顺铂)被PPARαdependent-induced自噬形成;类似的结果发现PPAR激动剂α/顺铂信号增强的自噬和随后提升癌症肿瘤细胞化疗敏感性和抑制。综上所述,PPARα/ Bcl2 /自噬信号促进自噬和增强肿瘤抑制和化疗对癌细胞(图7 (g))。

4所示。材料和方法

4.1。细胞培养、试剂

人类胚胎肾细胞系HEK393T写明ATCC®(crl - 11268™),人结肠癌细胞株SW480 (ccl写明ATCC®- 228™),和人类宫颈癌细胞系海拉(写明ATCC®CCL-2™)从写明ATCC购买。这些细胞在DMEM培养补充10%胎牛血清(的边后卫,Gibco)。安妥明购买从多伦多研究化学公司。紫杉醇是从Ruibio purchansed。顺铂是东京购买的化学工业。依托泊苷和喜树碱从合肥Bomei购买中国的生物技术。嘌呤霉素购买从生活的技术。

4.2。质粒

人类PPARα质粒是前面描述的7),定点诱变突变的方法。质粒转染了turboFect转染试剂按照制造商的指示(热科学)。PPARαshRNA质粒是前面描述的7]。

4.3。免疫印迹和抗体

LC3b抗体购自罗福斯生物制剂。肌动蛋白、GAPDH Bcl2, PPARα买来Sangon Botech(上海,中国)。二次抗体从杰克逊Immunoresearch购买。免疫印迹法是前面描述的7,17]。从三个独立的实验数据是一式三份。

4.4。实时定量聚合酶链反应

从SW480细胞总RNA提取了RNeasy工具包(Sangon生物技术)。信使rna表达水平由实时PCR分析工具包(豆类)。相对mRNA的表达水平正常化β肌动蛋白。褶皱的变化控制是通过使用ΔCt化验方法。

4.5。透射电子显微镜(TEM)

WT或PPARαshRNA沉默SW480细胞被固定在2.5%戊二醛在一夜之间在4°C。随后,样本处理1%的四氧化锇,嵌在树脂中。然后,样本切成70海里TEM分析部分(南京医科大学分析测试中心,NJMU)。

4.6。异种移植小鼠模型

异种移植肿瘤模型是前面描述的17]。ν/ν裸体小鼠(8周,女)获得线性实验动物合作(上海,中国)。稳定的PPARα选择沉默SW480细胞嘌呤霉素。SW480细胞(1 x10⁶在裸小鼠皮下注射。肿瘤体积测量每周通过使用数字卡尺在四个星期。此外,SW480细胞(1 x10⁶在裸小鼠皮下注射。两周后,小鼠治疗没有或与克罗(20毫克/公斤/天)或Clo +顺铂(3毫克/公斤)另一个两周的腹腔内注射。肿瘤体积= 1/2(长×宽²)。所有的研究进行了江苏大学动物保健委员会的批准。

4.7。统计分析

数据表示为均值±SEM。进行了统计比较学生的t测试或单向方差分析(方差分析)和Dunnett的测试。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

晋国Jianhua Mengli你,嘉明高,同样导致了这项工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81672711),由武进Sci &科技项耗资(WS201505),并通过向科学与科技项目(CJ20160003)。

补充材料

SFigure.1。沉默PPARα没有影响autophagy-associated基因表达式。SW480细胞转染控制成分或PPARαshRNA 36 h。信使rna提取qPCR分析。结果表示为±SEM手段(n = 4)。SFigure.2。过度的PPAR没有影响autophagy-associated基因表达式。SW480细胞转染与向量或PPARα质粒36 h。信使rna提取qPCR分析。结果表示为±SEM手段(n = 4)。SFigure。3所示。PPARα全身Bcl2退化没有对细胞凋亡的影响。与控制向量或Flag-PPAR SW480细胞转染α36 h。一组接受MG132 (20μ米)细胞溶菌作用前6 h。另一组接受cisplatinum (30μ米)细胞溶菌作用前6 h。细胞溶解产物受到免疫印迹。SFigure.4。Clo autophagy-associated没有影响基因的表达。SW480细胞治疗有或没有Clo 12 h。信使rna提取qPCR分析。结果表示为±SEM手段(n = 4)。(补充材料)

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