PLK1抑制联合免疫治疗在癌症治疗中的探索

摘要

背景。PLK1过表达是致癌的，并与各种癌症的不良预后相关。然而，目前的PLK1抑制剂取得的临床成功有限。另一方面，尽管免疫疗法在治疗许多难治性癌症方面显示出疗效，但大量患者对这种疗法没有反应。PLK1抑制与免疫疗法联合治疗癌症的潜力值得探索。方法。我们分析了PLK133种不同肿瘤类型的肿瘤免疫表达此外，我们还分析了PLK1抑制剂的药物敏感性与癌细胞株的肿瘤免疫之间的关系。此外，我们还探索了PLK1与肿瘤免疫显著相关的机制。最后，我们用实验验证了生物信息学分析的一些结果。结果。更高的癌症PLK1表达水平往往具有较低的免疫活性，如HLA表达降低，B细胞、NK细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞浸润减少。另一方面，肿瘤免疫升高可能增加了癌细胞对PLK1抑制剂的敏感性。PLK1与肿瘤免疫关联的主要机制可能在于肿瘤细胞周期和p53通路的异常。结论。我们的研究结果表明，PLK1抑制和免疫治疗联合可能实现协同抗肿瘤疗效。

1.介绍

PLK1 (polo样激酶1)是polo样激酶家族的一员[1，在细胞周期调节中起重要作用[2］。PLK1在调节细胞周期中的作用是多种多样的，包括控制有丝分裂进入，协调中心体和细胞周期，调节染色体分离，以及介导细胞分裂和减数分裂[2］.因此，PLK1功能异常会导致细胞周期异常，而细胞周期异常往往会刺激细胞增殖。事实上，大量研究表明，PLK1在多种癌症中过表达，其过表达与癌症患者的不良预后相关[3.］.因此，PLK1的抑制被认为是一种潜在的癌症治疗策略[4］.许多PLK1抑制剂已经在实验室或临床研究中进行了探索，如BI2536、volasertib、GSK461364、rigosertib、poloxin、poloxin-2和RO3280 [3.］.然而，到目前为止，这些探索性制剂均未用于临床[5］.

另一方面，最近癌症免疫疗法在治疗各种癌症方面显示出惊人的成功[6，7］.特别是，阻断免疫检查点CTLA4(细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4)、PD1(程序性细胞死亡蛋白1)和PD-L1(程序性细胞死亡蛋白1配体)在各种癌症的临床成功，包括黑色素瘤、肺癌、肾癌、膀胱癌、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤、以及具有MSI(微卫星不稳定)或DNA错配修复缺陷的癌症[6］.另一种值得注意的癌症免疫治疗策略是嵌合抗原受体(CAR) T细胞疗法，它已成功用于治疗难治性白血病和淋巴瘤[7］.尽管癌症免疫疗法取得了这些显著的成就，但仍有相当一部分患者对这些疗法反应有限或无反应[8］.为了预测患者对癌症免疫治疗的反应，已经探索了一些生物标志物，如肿瘤突变负担(TMB) [9，10], neoantigens [11], MSI [12，以及PD-L1表达[13］.此外，为提高癌症免疫治疗的疗效，免疫治疗与化疗、放疗或靶向治疗相结合的研究也在探索中[14］.例如，最近的一项研究表明，周期素依赖激酶4和6 (CDK4/6)抑制剂与免疫治疗结合可以促进抗肿瘤免疫[15］.

在本研究中，为了探索PLK1抑制剂与免疫疗法联合治疗癌症的潜力，我们分析了两者之间的相关性PLK1根据癌症基因组图谱(TCGA)数据，33种不同癌症的免疫细胞浸润表达和免疫活性(https://cancergenome.nih.gov/)。此外，基于癌症药物敏感性基因组学(GDSC)项目数据(http://www.cancerrxgene.org/)，我们分析了PLK1抑制剂的药物敏感性与癌症细胞系(ccl)的免疫细胞浸润和免疫活性的关系。此外，我们还探索了潜在的机制，其背后的重大关联PLK1表达与肿瘤免疫。

2.方法

2．1.数据集

基因表达谱(RNA-Seq, 3级)和基因体细胞突变(3级)的TCGA数据从基因组数据共享数据门户(https://portal.gdc.cancer.gov/）.分析的33种TCGA肿瘤类型见表1。基因表达谱(Affymetrix Human Genome U219阵列)和药物敏感性(IC50)的GDSC数据从Wellcome Sanger研究所网站下载:https://www.cancerrxgene.org/downloads。我们根据B细胞、自然杀伤细胞(NK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)、人类白细胞抗原(HLA)、调节性T细胞(Treg)和癌睾丸抗原(cta)的基因特征表达谱，分析了6种免疫细胞的富集水平和功能。这些基因标记见补充表S1。

2．2．癌症中免疫细胞类型或功能的活性评估

我们使用单样本基因集富集分析(ssGSEA)评分来量化癌症样本中免疫细胞类型或功能的活性(或富集水平)[16，17］.基因集合是免疫细胞类型或功能的基因特征集合。ssGSEA评分越高，免疫细胞类型或功能的活性越高。此外，我们通过ESTIMATE算法评估了癌症中的免疫浸润水平[18］.ESTIMATE输出免疫评分基于基因表达谱数据量化癌症中的免疫浸润水平。

2．3.细胞系和细胞培养

人肺鳞状细胞癌(sk - me -1)、多形性胶质母细胞瘤(U251)、子宫内膜癌(HEC-1B)和皮肤皮肤黑色素瘤(SK-MEL-2)的细胞来自美国类型培养收集(ATCC)。SK-MES-1和U251细胞在添加10%胎牛血清(FBS, GIBCO, USA)的DMEM (GIBCO, USA)中培养。HEC-1B细胞在添加10%胎牛血清的Roswell Park Memorial Institute-1640 (rmi -1640, GIBCO, USA)中培养。SK-MEL-2在添加10%胎牛血清的MEM (GIBCO，美国)中培养。所有细胞在37°C和5% CO的湿化培养箱中培养₂的气氛。在本研究中所做的所有实验中，细胞都是在对数生长期收获的。

２.４.反转录定量PCR (qPCR)分析

BI2536购自Selleck。用BI2536 (1μ米,48 h)。用Trizol (Invitrogen公司，美国)分离总RNA，用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher公司，美国)反转录成cDNA。用于qPCR的引物序列见补充表S2。用real-time PCR (RT-PCR) Master Mix (SYBR Green) (TOYOBO Co.， LTD, JAPAN)将引物在无核酸酶水中稀释。相对拷贝数是通过计算感兴趣基因相对的折叠变化差异来确定的β肌动蛋白。qPCR在ABI 7500 FAST和Applied Biosystems StepOnePlus RT-PCR机上进行。

2．5．流式细胞术

胰蛋白酶处理48小时后收集细胞，用PBS洗涤。细胞重悬在标记缓冲液中(PBS中添加10%胎牛血清和1% NaN3)，最终浓度为5×105 / ml，并用W6/32单克隆抗体(1:20,eBIOSCIENCE: 12-9983-42)在37℃无光下染色30分钟。然后用PBS洗涤细胞，使用LSRII 4-激光流式细胞仪(Becton Dickinson, USA)进行流式细胞分析。采用FlowJo软件对结果进行分析和MFI计算。

2.6。统计分析

我们计算了PLK1表达水平与另一个基因的表达水平之间的相关性PLK1表达水平和其他变量，包括基因集的富集水平(ssGSEA评分)、肿瘤突变计数和使用Spearman方法的药物敏感性(IC50)。的比较TP53癌症之间的突变率较高PLK1表达水平(上三分之一)和较低的癌症PLK1表达水平(低三分之一)，我们使用Fisher精确检验。我们使用Benjamini and Hochberg (BH)方法计算的错误发现率(FDR)对多次测试进行了调整[19］.FDR < 0.1的阈值用于确定统计学意义。所有的计算和统计分析均由R (https://www.r-project.org/)实现。实验数据采用Prism 5.0软件(GraphPad)进行分析，以均数±SD表示。的tP < 0.05为差异有统计学意义。

3.结果

３.１.PLK1肿瘤中的表达可能与免疫细胞浸润和免疫活性低下有关

我们发现PLK110种癌症(LUSC、TGCT、STAD、GBM、ESCA、PAAD、LUAD、UCEC、ACC和DLBC)的表达水平与免疫评分呈负相关，而4种癌症(KIRC、THCA、THYM和LGG)的表达水平与免疫评分呈正相关(Spearman相关，FDR<0.1)(图)1(一))。此外,高PLK1在13种癌症(LUSC、TGCT、ACC、STAD、ESCA、LIHC、HNSC、LGG、CESC、BRCA、LUAD、KICH和PAAD)中，表达水平与B细胞浸润丰富相关，而在5种癌症(THCA、THYM、PRAD、KIRC和UVM)中表达水平与B细胞浸润较少相关(Spearman相关性，FDR<0.1)(图)1 (b)）.值得注意的是，所有10个B细胞基因标记(BANK1，HVCN1，CD79B，RALGPS2，FCRL3，CD79A，BACH2，FCRL1，黑色,和BTLA)的表达呈负相关PLK19个在LUSC和STAD中表达(Pearson相关，FDR<0.1)(图1 (c)）.此外，在TGCT、PRAD、CESC、LIHC、KICH和STAD 6种癌症中PLK1与较高水平的NK细胞浸润相关，在1种癌症类型(LUAD)中，我们观察到相反的趋势(Spearman相关，FDR<0.1)(图1 (d)）.此外，我们将PLK1肿瘤中TILs的富集水平。我们发现PLK19种肿瘤(LUSC、TGCT、STAD、GBM、PAAD、ESCA、LUAD、ACC、DLBC)和4种肿瘤(KIRC、THYM、THCA、BRCA)中TILs的表达水平与富集水平呈负相关(Spearman相关，FDR<0.1)(图)1 (e)）.值得注意的是，在120个TILs基因中，有114个(95%)的基因与大肠杆菌表达呈负相关PLK1110个(92%)TILs基因在TGCT中表达(Spearman相关，FDR<0.1)。总的来说，这些数据表明这一比例有所上升PLK1在许多类型的癌症中，表达倾向于抑制免疫细胞浸润和抗肿瘤免疫。

３.２.PLK1HLA在癌症中的表达可能与HLA活性低下有关

HLA基因编码在肿瘤免疫调节中起重要作用的MHC(主要组织相容性复合体)蛋白[20.］.我们发现PLK1在12种类型(LUAD、LUSC、TGCT、GBM、ACC、UCEC、DLBC、STAD、KICH、ESCA、SKCM和UCS)中，HLA的表达与HLA活性呈负相关，而在3种类型(THCA、KIRC和LGG)中，我们观察到相反的趋势(Spearman相关，FDR<0.1)(图)2(一个)）.GDSC数据分析表明PLK1癌细胞株HLA活性与HLA表达呈负相关(Spearman相关，R=-0.12, P=2.0)10⁻⁴)(图2(一个)）.此外，我们发现分析的24个HLA基因中，大多数都显示出显著的负相关PLK1在12种癌症中PLK1表达与HLA活性呈负相关。例如，在两种肺癌中，所有的24个HLA基因都呈负相关表达PLK119个HLA基因在LUAD中表达(Pearson相关，FDR<0.1)(图2 (b)）.HLA基因22和21的表达呈负相关PLK1分别在TGCT和DLBC中表达。值得注意的是,抗原，HLA-DPA1，HLA-DQB1，HLA-DRA，HLA-DRB1，HLA-DRB5,和HLA-J一直与PLK1在12种癌症类型中的表达(图2 (b)）.综上所述，这些结果表明PLK1表达可能会抑制HLA在癌症中的活性。

基因突变产生的新抗原与抗肿瘤免疫有关[11］.我们发现肿瘤的PLK1表达水平显著高于肿瘤的体细胞突变总数PLK1TCGA表达水平(Spearman相关，R=0.46, P=2.57)10⁻²¹⁴)(图2 (c)）.而且，肿瘤的表达更高PLK1有明显更多的突变产生预测的hla结合肽[21而不是表达较低的肿瘤PLK1(Spearman相关，R=0.43, P=1.0310⁻¹⁸⁶)(图2 (d)）.它表明尽管PLK1上调与更高的TMB和更多的新抗原相关，它通过抑制HLA活性来抑制抗肿瘤免疫反应。

3.3。PLK1肿瘤中调节性T细胞活性降低可能与表达相关

Treg细胞在肿瘤免疫抑制中发挥重要作用[22］.我们发现PLK1表达水平与抑郁相关Treg 16癌症细胞富集水平(THYM、LUSC GBM、TGCT SKCM,马,UCEC,光电子能谱,UCS, UVM, OV, DLBC, LUAD, STAD,塞斯克,和KICH)在5与Treg细胞活性增强有关癌症(THCA, KIRC LIHC, BRCA, BLCA)(斯皮尔曼相关,富兰克林·德兰诺·罗斯福< 0.1)(图3.）.GDSC数据分析表明，高PLK1肿瘤细胞系中Treg细胞富集水平降低与表达水平相关(Spearman相关，R=-0.13, P=3.29)10⁻⁵)(图3.）.总之，这些数据表明PLK1在广泛的癌症中，Treg细胞的表达与Treg细胞活性呈负相关。

３．４．PLK1肿瘤中癌睾丸抗原的表达可能正相关

cta是在许多癌症中异常激活的免疫原性蛋白质[23］.令人惊讶的是，我们发现这个比例更高PLK1在33种癌症中，有31种的表达水平与较高的CTA富集水平显著相关(Spearman相关，FDR<0.1)(图)4(一)）.显然，是CTA基因ATAD2，CEP55，FANCA，KIF2C，NUF2，OIP5,PBK与PLK1在30种癌症类型中表达(Pearson相关，FDR<0.1)(图4 (b)）.223个CTA基因中有166个(74%)与大肠杆菌表达呈正相关PLK1145个(65%)CTA基因在KIRC中表达。此外，GDSC数据分析表明PLK1肿瘤细胞株中CTA表达水平与CTA富集水平呈正相关(Spearman相关，R=0.22, P=4.09)10⁻¹²)(图4(一)）.总的来说，这些数据表明更高PLK1表达与较高的CTA表现相关。

3．5．提高免疫活性倾向于增强癌细胞对PLK1抑制剂的敏感性

GDSC数据涉及癌细胞对数百种化合物的药物敏感性(IC50)，其中GW84368和BI-2536靶向PLK1。我们发现B细胞、NK细胞和TILs的富集水平与GW84368的IC50值呈负相关，B细胞和TILs的富集水平与BI-2536的IC50值呈负相关(Spearman相关，P<0.05)(图)5）.提示较高水平的B细胞、NK细胞或TILs可促进癌细胞对PLK1抑制剂的敏感性。这是合理的，因为较高水平的B细胞、NK细胞或TILs与较低水平的PLK1有关，这将需要较低浓度的PLK1抑制剂来抑制癌细胞增殖。此外，GDSC数据分析显示，GW84368和BI-2536的IC50值与癌细胞免疫评分呈负相关(Spearman相关，P<0.01)(图)5)，这再次表明，免疫活性的提高增加了癌细胞对PLK1抑制剂的敏感性。

3.6。PLK1抑制抗肿瘤免疫通过细胞周期调节

PLK1是细胞周期进展的重要调控因子之一[24］.不出所料，TCGA数据分析显示PLK1在所有33种癌症中，表达水平与细胞周期活性呈正相关(补充表)S3）.此外，我们的分析表明，高细胞周期活性倾向于抑制抗肿瘤免疫。例如，在20种癌症中，细胞周期活性与TILs富集呈负相关，而在3种癌症中，细胞周期活性与TILs富集呈正相关(Spearman相关，FDR<0.1)(图)6）.在21种癌症类型中，细胞周期活性与HLA富集呈负相关，而只有一种癌症类型与HLA富集呈正相关(图)6）.此外，在11种癌症中，细胞周期活性与B细胞富集呈负相关，而在5种癌症中，细胞周期活性与B细胞富集呈正相关(图)6）.有趣的是，细胞周期与CTA富集在33种癌症中的30种中呈正相关(Spearman相关，FDR<0.1)(补充表)S4）.此外，我们发现，在20种癌症类型中，细胞周期活动与免疫评分呈负相关，而在4种癌症类型中，细胞周期活动与免疫评分呈正相关(图)6）.总之，这些结果表明PLK1上调抑制抗肿瘤免疫通过增强癌症细胞周期活性。这与最近的一项研究一致，该研究表明，细胞周期抑制促进了抗肿瘤免疫[15］.

3.7。PLK1抑制增加MHC I类在多细胞系中的表达

我们使用PLK1抑制剂(BI2536)治疗癌症细胞系，并比较MHC I类(抗原，HLA-B，HLA-C，B2M,和TAP1基因和它们的蛋白质产物)在处理前和处理后的细胞系之间。我们观察到MHC I类分子在经过预处理的细胞株中表达明显增加，并且在所有四种不同的细胞株(LUSC, GBM, UCEC和SKCM)中检测的结果都是一致的(图)7）.本实验验证了生物信息学分析的结果PLK1HLA在不同类型癌症中的表达与HLA活性呈负相关。

4.讨论

PLK1是细胞周期的主要调控因子，其过表达在各种类型的癌症中都具有致癌性。因此，靶向PLK1可能在治疗广泛的恶性肿瘤中有希望。然而，目前的PLK1抑制剂取得的临床成功非常有限。另一方面，尽管免疫疗法在治疗许多难治性癌症方面取得了快速的临床成功，但相当多的患者对这种疗法没有反应。为了提高两种疗法的临床疗效，值得考虑PLK1抑制和免疫治疗相结合。为了探讨两种治疗方法结合的可能性，我们分析了两者之间的相关性PLK1不同类型肿瘤的表达和肿瘤免疫我们的生物信息学分析表明PLK1肿瘤高表达时，有抑制抗肿瘤免疫的趋势PLK1HLA表达水平通常较低，TILs浸润。此外，体外实验证实，PLK1抑制显著增加了HLA分子在各种癌症中的表达。PLK1抑制抗肿瘤免疫的主要机制是PLK1上调激活细胞周期，从而降低肿瘤免疫原性(图)8(一个)）.此外，我们发现癌症的PLK1表达水平明显高于TP53突变比癌症低PLK112种癌症的表达水平(Fisher’s exact test, FDR<0.05)(图8 (b))，表明PLK1上调与患病率呈正相关TP53突变。因此,较高的TP53癌症的突变率较高PLK1在这些癌症中，表达水平也可能是导致肿瘤免疫低下的部分原因(图)8(一个))，因为先前的研究已经证明野生型p53可以促进肿瘤免疫[25］.

的相关性PLK1免疫标记的表达可能受到其他因素的影响，如患者的年龄、性别、肿瘤分期和分级。我们重新分析了PLK1根据患者年龄(<60岁和≥60岁)、性别(男性和女性)、分期(早期(I-II期)和晚期(III-IV期)、分级(低分级(G1-2)和高分级(G3-4))分别进行免疫标记(免疫评分)的表达。当考虑这些协变量时，我们没有观察到统计相关性的显著变化(补充表)S5）.此外，我们进行了多元线性回归分析的相关性PLK1通过添加协变量“年龄”来进行表达和免疫标记。我们的结果表明PLK1表达和免疫标记不太可能受到变量“年龄”的影响(补充表)S6）.

推测PLK1抑制联合免疫治疗可能提高抗肿瘤疗效是合理的。首先，PLK1抑制能够促进肿瘤抗原呈递和抗肿瘤免疫浸润，通过加入免疫治疗可以进一步增强(图)8 (c)）.第二，癌症免疫治疗可能增强肿瘤的免疫原性，从而增加癌细胞对PLK1抑制剂的敏感性(图)8 (c)）.因此，PLK1抑制和免疫治疗联合应用在癌症治疗中可能有前景，尽管还需要进一步的实验和临床验证。

5.结论

PLK1可能抑制抗肿瘤免疫，而肿瘤免疫升高可能增强癌细胞对PLK1抑制剂的敏感性。提示PLK1抑制联合免疫治疗可能具有协同抗肿瘤作用。

缩写

PLK1:	Polo-like激酶1
CTLA4:	细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4
PD1:	程序性细胞死亡蛋白1
PD-L1:	程序性细胞死亡1配体
CDK4/6:	周期蛋白依赖性激酶4和6
尖:	肿瘤浸润淋巴细胞
HLA:	人类白细胞抗原
MHC:	主要组织相容性复合体
Treg:	调节性T
商品交易顾问基金:	Cancer-testis抗原
MSI:	微卫星不稳定
汽车:	嵌合抗原受体
三甲:	肿瘤基因突变的负担
罗斯福:	错误发现率
ssGSEA:	单样本基因集富集分析
TCGA:	癌症基因组图谱
GDSC:	癌症药物敏感性基因组学研究
进一步推动:	癌症细胞系
qPCR:	定量聚合酶链反应
rt - pcr:	实时PCR。

数据可用性

肿瘤组织的数据可从基因组数据公共数据门户下载(https://portal.gdc.cancer.gov/)，癌症细胞系的数据可从以下网站下载:https://www.cancerrxgene.org/downloads。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

李梦媛进行了数据分析，并帮助准备了手稿。刘志贤进行了实验并帮助准备了手稿。王小生构思了研究，设计了分析策略，并撰写了手稿。所有的作者阅读并批准了最终的手稿。

致谢

中国药科大学资助项目(no . 3150120001; no . 2632018YX01)。

补充材料

表S1:分析的6种免疫细胞类型和功能的基因特征。表S2:用于qPCR分析的引物序列表S3:之间的相关性PLK133种TCGA肿瘤的表达水平和细胞周期活性表S4: 33种TCGA肿瘤中CTA富集水平与细胞周期活性的相关性表S5:PLK1免疫评分的表达。表S6:多元线性回归分析PLK1通过添加协变量“年龄”来进行表达和免疫标记。（补充材料）

补充材料

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