通过循环肿瘤DNA的液体活检捕获肺癌基因组进化

摘要

恶性肿瘤的基因测序在揭示治疗靶点和通过基因组进化捕捉肿瘤对药物敏感性和耐药性的动态变化方面变得越来越重要。在肺癌中，目前的诊断和进展时的组织活检标准并不总是可行或实际的，可能低估了瘤内异质性。基因测序技术的进步使循环肿瘤DNA (ctDNA)分析能够获得靶向突变的信息，并捕捉实时达尔文进化的肿瘤克隆和选择性治疗压力下的耐药机制。从血浆、脑脊液或尿液中分析ctDNA的能力使我们能够全面地将癌症视为全身性疾病，并捕捉到肿瘤内的异质性。在这里，我们描述了这些最近在肺癌设置的进展，并提倡进一步的研究，并将ctDNA分析纳入靶向治疗的临床试验。通过以非侵入性的方式捕捉基因组进化，用于ctDNA分析的液体活检可以加速治疗发现，并为肺癌和其他实体肿瘤患者的精准医疗带来下一个飞跃。

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在当今精准医学时代，针对致癌基因驱动的肺癌的分子靶向治疗已被证明达到高达70%的初始反应率[1］.不幸的是，随着时间的推移，由于获得性耐药性的出现，这些药物不可避免地会失败[2，3.］.这些耐药机制可能在治疗压力下通过肿瘤克隆的达尔文进化而出现并持续存在[4］.在治疗过程中，对耐药恶性克隆有利的选择性压力可能改变肿瘤的分子结构及其相关的药物敏感性，需要重复活检以帮助指导进一步的治疗。然而，重复活检对患者来说往往是不切实际的，可能无法充分反映肿瘤内异质性，这两种情况都对临床护理和治疗进展构成了重大障碍[5］.循环肿瘤DNA (ctDNA)测序技术的最新进展使从血浆、尿液和脑脊液(CSF)中鉴定肿瘤衍生的体细胞改变具有高度的敏感性和特异性[6，7］.这些进展提供了一个独特的机会，以揭示靶向治疗获得性耐药的新机制，并以一种非侵入性和普遍可得的方式，即“液体活检”，捕捉肺癌分子亚群患者的基因组进化(图)1）.

液体活检可以相对容易地从血浆中获得(所需血容量:10-20 mL) [8]，腰椎穿刺(脑脊液需用:1-2 mL) [6，9]，或尿(需尿量30-50毫升)[10］.一旦获得液体活检，就可以提取无细胞DNA (cfDNA)，并使用任何一种技术分析肿瘤特异性改变。数字聚合酶链反应(PCR)和下一代测序(NGS)是ctDNA分析的主要方法。两种最常见的基于数字PCR的方法是液滴数字PCR (ddPCR)和beam(珠状、乳剂、扩增和磁性)[11，12］.这两种方法都利用了乳化液聚合酶链反应，在这种酶链反应中生成含有单个DNA片段的液滴，使得DNA分子能够独立地相互扩增。区分荧光标记探针的序列用来区分含有突变或野生型感兴趣等位基因的液滴。与传统的基于逆转录酶- pcr (RT-PCR)的方法相比，单个液滴的计数能够更精确地定量突变等位基因片段[13］.相比之下，杂交捕获NGS在测序前选择包含参考致癌突变的基因组部分，以增加分析的产量。简单地说，全基因组DNA库是通过连接适配器和PCR从细胞游离DNA生成的。然后，利用与这些区域互补的寡核苷酸或“诱饵”杂交捕获，从扩增文库中选择感兴趣的基因组区域，进行后续富集。在另一轮PCR后，富集文库被测序[14］.另一种方法，基于扩增子的NGS，利用多路PCR创建一个扩增寡集引物池，可用于标记各种重复体细胞突变的“热点”靶区[15］.

每种分析方法都有自己的诊断定位。数字PCR快速，允许在非常低的浓度下定量突变等位基因，而且相对便宜。然而，它需要对感兴趣的特定突变的先验知识，并且不能用于检测重排，除非确切的基因组断点是已知的，而且对多个突变的多重分析是具有挑战性的[16］.基于杂交捕获的NGS允许对数千个基因组位置进行多重分析，除了单核苷酸变异和短插入/缺失外，还可以很容易地检测重排和拷贝数变异。通过分子条形码和数字错误抑制技术，NGS技术的最新进展使ctDNA检测具有与数字PCR相似甚至更好的分析灵敏度[16，17］.然而，基于ngs的方法相对于数字PCR更昂贵，周转时间更长。

历史上，组织活检分析一直是研究靶向治疗肺癌患者获得性耐药的主要方法[18- - - - - -20.］.然而，需要在进展后获得重复活检通常是进行此类分析的一个重大障碍。最近的研究表明，在致癌基因驱动的肺癌中，血浆ctDNA可用于对靶向药物获得性耐药机制的早期识别和定义[21，22］.这包括检测的出现表皮生长因子受体患者血浆T790M表皮生长因子受体用厄洛替尼治疗的突变型肺癌，占大多数治疗失败的原因[13］.研究获得性耐药机制的重要性被最近开发的用于克服突变的第三代EGFR抑制剂进一步强调表皮生长因子受体T790M，包括最近获得FDA批准并已被采用为护理标准的奥西替尼[23］.在这种情况下，血浆中T790M的检测被证明与组织中T790M的检测一样可以预测奥西替尼的反应[2］.此外，对奥西替尼和罗替尼的新的耐药机制，如表皮生长因子受体C797S和L798I突变，以及前面描述的机制，如见过放大，激活突变PIK3CA已通过血浆ctDNA测序确定和/或特征(图2) ［24，25］.值得指出的是，通过纵向连续使用超灵敏血浆NGS检测，亚克隆突变可能在它们与临床相关之前就被检测到。在最近报道的AURA3试验中，血浆表皮生长因子受体T790M状态独立预测患者预后改善表皮生长因子受体接受奥西替尼与铂/培美曲塞化疗的突变型肺癌患者[26，27］.然而，与目前仅在疾病临床进展时转换治疗的护理标准相比，尚不清楚在组织T790M可能为阴性时，在血浆T790M处于亚克隆状态时早期检测T790M是否有利于启动新的靶向治疗。需要前瞻性的临床试验来回答这个问题。

Murtaza等人的一项研究探讨了在转移性肺、卵巢癌和乳腺癌患者中，液体活检获得与传统活检相同的突变信息的能力。在这项研究中，连续的血浆ctDNA样本在1-2年的过程中进行了评估，发现在治疗抵抗时突变等位基因比例增加[28］.这有助于证明，外显子组广泛的ctDNA分析可以补充传统的疾病进展活检，以捕获克隆进化的概念。随后，更具成本效益的靶向NGS方法也取得了类似的结果[17，27］.任何侵入性手术都有发病的可能;例如，从胸部活检报告的不良事件发生率，包括气胸，可能高达19% [29- - - - - -33］.随着ctDNA的广泛应用和方法学的进一步完善，利用这种无创方法来避免在病情进展时重复组织活检的需要的能力正在成为临床中的现实[34，35］.

除了简单地反映侵入性组织活检获得的信息外，ctDNA分析还可以提供一个更全面和综合的视角，了解多部位癌症的系统进化。原发灶和转移灶突变状态的不一致性已被证明高达28%和24%表皮生长因子受体和喀斯特，分别在25例IV期非小细胞肺癌(NSCLC)患者队列中[36］.此外，Chabon等人最近利用基于CAPP-Seq的ctDNA分析发现，46%的肺癌患者在接受一线EGFR TKIs治疗后存在多重耐药机制[25，而以往基于组织活检的研究仅报道了5%-15%的患者存在耐药性机制的异质性[20.- - - - - -22，25］.通过对体循环取样，CtDNA独特地能够解决系统性疾病的空间异质性和进化。通过这种方式，ctDNA有望成为我们诊断库中的下一个主要工具，帮助肺癌患者做出系统性治疗决定。

除了定义转移环境中的驱动突变状态外，ctDNA分析还可以用于分析中枢神经系统(CNS)和周围肿瘤组成的差异，最近Brastianos等人对这一现象进行了很好的描述[37］.在Pentsova等人的一项研究中，来自脑脊液样本的ctDNA被用于显示CNS腔室具有临床相关的基因组改变，这为监测原发性CNS肿瘤和转移性病变提供了希望[6］.单纯对原发肿瘤进行基因分型可能会错过中枢神经系统转移瘤的大量靶向治疗机会;然而，常规的脑活组织检查根本不可行。脑脊液(CSF)的CtDNA分析是一种新颖的方法，通过在床边或神经肿瘤学家办公室进行的微创手术腰椎穿刺来解决这一未满足的需求。

几项研究表明，涉及中枢神经系统的恶性肿瘤，无论是原发性中枢神经系统肿瘤还是转移性病变，都对获取外周血中代表中枢神经系统病变的ctDNA提出了独特的挑战，因为脱落物质可能无法通过血脑屏障(BBB) [38，39］.De Mattos-Arruda等人发现，在同一个体中，与血浆中的ctDNA相比，CSF中的ctDNA更丰富，更能代表CNS肿瘤遗传突变状态[9，39］.也有数据显示，中枢神经系统和外周对驱动靶向治疗的耐药机制存在差异，被认为是由于药物血脑屏障穿透减少。脑脊液中较低的药物浓度允许不同的选择压力，从而导致CNS室中不同的耐药机制[40，41］.在12名接受TKIs (EGFR, ALK, HER2，或BRAF)靶向治疗的进展性中枢神经系统疾病负担患者队列中，发现4名患者CSF ctDNA突变，使其对靶向治疗产生耐药性，而这种耐药性在外周血未见[19］.血浆和脑脊液库的平行分析可以提供一个独特和全面的肿瘤在体内进化的观点。肺癌和中枢神经系统转移患者脑脊液ctDNA检测的理想时间仍在研究中。一个概念是，当患者在中枢神经系统与周围不一致的腔室有临床进展时，考虑脑脊液ctDNA分析与血浆ctDNA比较，以寻找不同的突变谱，因为在这种情况下，脑活检通常是不可行的。随着脑脊液ctDNA的临床发展，我们可以在不进行侵入性脑活检的情况下发现中枢神经系统转移瘤的基因组谱和进化，并针对其特定的遗传畸变量身定制中枢神经系统靶向治疗。

鉴于液体活检的无创性质和快速改进的检测ctDNA的方法，实时微创监测耐药性机制的能力正在迅速成为现实。因此，我们主张将ctDNA分析纳入靶向治疗的临床试验，以系统地询问肺癌的基因组进化。继续的临床研究是至关重要的，因为我们将ctDNA纳入日常临床实践。在临床环境中优化液体活检检测的时间、频率和选择的研究，以及正在进行的有望降低ctDNA基因测序成本的技术改进，是帮助减轻未来患者经济毒性的关键。通过捕捉基因组进化，ctDNA分析可以加速治疗发现，并为肺癌和其他实体肿瘤患者的精准治疗带来下一个飞跃。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

作者要感谢Lauren Goldblum在Figure中创建插图的帮助1．纪念斯隆凯特琳癌症中心的作者得到了美国国立卫生研究院核心基金P30 CA008748的支持。

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