透明质酸酶抑制剂透明质酸霉素能抑制胰腺癌细胞的迁移和增殖

摘要

胰腺导管腺癌(PDAC)以透明质酸(HA)的加速产生和降解为特征，透明质酸是参与恶性肿瘤表型的细胞外基质的主要成分。特别是，透明质酸酶(HYAL)活性的增加在癌症进展中起着关键作用，至少部分是通过产生低分子量HA或HA小片段，这表明HYAL是癌症治疗的一个靶点。透明霉素是从一种海洋衍生的红霉素培养物中分离得到的新成员链霉菌属hyaluromycini作为透明质酸抑制剂。我们研究了透明霉素对PDAC细胞的抗肿瘤作用。我们检测了透明霉素对PDAC细胞增殖和迁移的影响。为了阐明透明霉素对PDAC细胞的作用机制，我们检测了透明霉素处理PDAC细胞后，条件培养基中低分子量ha的浓度。我们证明透明霉素可以抑制PDAC细胞的增殖和迁移。我们还发现，透明质霉素的这些抗肿瘤作用与低分子量ha浓度降低和核糖体蛋白S6磷酸化水平降低有关。我们的研究结果表明透明霉素是一种很有前途的治疗这种高侵袭性肿瘤的新药。

1.介绍

在癌症进展过程中，透明质酸(HA)作为细胞外基质的主要成分，在多种细胞过程中起着关键作用，包括增殖、粘附、迁移、侵袭、转移和耐药。这在胰腺导管腺癌(PDAC)中尤为明显，PDAC的普遍特征是富含HA的致密“纤维增生”间质。除了HA的异常产生，HA的加速处理(特别是降解)是癌细胞侵袭行为的核心。

透明质酸被一种叫做透明质酸酶(HYALs)的特殊酶降解。在以前的研究中，HYAL水平在各种癌症中被证明是升高的[1- - - - - -3.］．此外，在乳腺癌细胞中，高表达的HYALs比低表达的HYALs具有更强的侵袭能力[4］．我们报道了HYAL1在PDAC细胞系和组织中过表达，抑制HYAL活性显著抑制了PDAC细胞的迁移[5］．HYAL2首先将高分子量- (HMW-) HA切割成~ 20kda片段，然后被HYAL1进一步消化成更小的片段[6，7］．有趣的是，低分子质量(LMW-) HA或小HA片段，而不是HMW-HA，被认为是癌症侵袭和转移进展的必要因素[8］．我们也报道了低分子量ha刺激PDAC细胞迁移[9］．越来越多的证据表明，HYAL在肿瘤进展中起着关键作用。因此，靶向HYAL可能是一种潜在的癌症治疗方法。

在之前的研究中，一些HYAL抑制剂，如甘草酸、硫酸透明质酸(sHA)和葡聚糖硫酸酯已经被测试在癌细胞中具有抗肿瘤活性[8，10，11］．然而，之前没有报告测试HYAL抑制剂对PDAC的影响。透明霉素是从一种海洋衍生的红霉素培养物中分离得到的新成员链霉菌属hyaluromycini作为HYAL抑制剂[12］．重要的是，透明霉素对HYALs的抑制活性是临床常用的HYAL抑制剂甘草酸的25倍[12］．在本研究中，我们研究了透明霉素对PDAC细胞的抗肿瘤作用。我们还研究了透明霉素对PDAC细胞行为影响的可能分子机制。

2.材料和方法

２．１．细胞系和试剂

我们使用PDAC细胞系，BxPC-3和CFPAC-1(美国型培养收集，Manassas, VA, USA)。PDAC细胞系在RPMI1640培养基中(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)，添加10%胎牛血清(FBS) (Life Technologies)和1%链霉素和青霉素(Life Technologies) (5% CO)₂孵化器在37°C。透明霉素的分离以前有描述[12］．透明霉素溶于DMSO中，加入等量的DMSO作为对照。

2．2．细胞增殖实验

PDAC细胞镀于1 × 10⁵在含或不含不同浓度透明霉素的培养基中培养1、3、5天。台盼蓝染色后胰蛋白酶处理细胞并计数。

2．3．细胞迁移试验

细胞的迁移能力是通过跨孔细胞迁移实验来确定的，细胞培养插入物配有包含8μm孔隙(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)。下层腔室填充含有10%胎牛血清的RPMI1640。上部腔室充满4 × 10⁴PDAC细胞悬浮在含有1%胎牛血清的RPMI1640中。在迁移实验开始时，将透明霉素添加到上腔和下腔。培养24小时后，除去过滤器上部残留的细胞。用苏木精和伊红对膜底表面的细胞进行染色，并在每个样本中随机选择的5个显微镜视野中计数迁移到膜底表面的细胞数量。

2．4．低分子量ha浓度的测量

电池(1.0 × 10⁵在无血清培养基(RPMI1640无FBS)中培养24小时，收集培养基测量低分子量ha浓度。培养基样品在14000下离心通过Amicon Ultra-0.5离心过滤装置(MilliporeSigma, Darmstadt, Hessian, Germany)，以100 kDa截止，收集低分子量ha (<100 kDa) [8，13］．使用Quantikine ELISA透明质酸免疫分析法(R&D Systems Inc.， Minneapolis, MN, USA)测定低分子量透明质酸的浓度。实验重复三次，测定平均浓度。

2．5．细胞内信号通路分析

为了阐明透明霉素对PDAC细胞作用的调控机制，我们使用PathScan胞内信号阵列试剂盒(Cell signaling Array Kit, Trask lane, Danvers MA, USA)同时检测了PDAC细胞中18个磷酸化或裂解的重要且特征明确的信号分子。细胞在50岁时用或不用透明霉素处理μM.处理24小时后，收集细胞并根据制造商的说明检测PathScan胞内信号阵列试剂盒。

2．6．统计分析

采用SPSS统计软件21.0版(SPSS, Chicago, Illinois, USA)进行统计分析。学生的以及和Mann-Whitney用于组间比较。一个值< 0.05认为有统计学意义。

3.结果

首先，我们研究了透明霉素对PDAC细胞增殖的影响。用不同浓度的透明霉素处理两株PDAC细胞株BxPC-3和CFPAC-1。如图所示1，透明霉素抑制两种PDAC细胞系的生长呈剂量依赖性。虽然透明霉素的抗增殖作用是适度的浓度为12.5μM，治疗25μ在治疗后的5天内，M几乎完全抑制了细胞增殖。此外，50μ透明霉素的M明显减少细胞数量，提示细胞死亡的诱导作用。

然后，我们通过transwell细胞迁移实验确定透明霉素对PDAC细胞迁移的影响。经不同浓度(0-50μ在第1天(24小时)计数迁移的细胞，此时这些浓度对细胞增殖没有显著影响。透明霉素显著抑制BxPC-3在25和50时的迁移μM(图2)．

为了深入了解透明霉素的这些抗肿瘤特性，我们在不同浓度(0-50)处理BxPC-3后，测量了条件培养基中低分子量ha (<100 kDa)的浓度μhyaluromycin M)。与未处理的对照组相比，透明霉素处理后的低分子量透明质酸浓度在25浓度下显著降低μ米和50μ米(对于浓度;数字3.)．

最后，我们想确定参与观察到的透明霉素对PDAC细胞影响的信号通路。我们使用PathScan胞内信号阵列试剂盒(Cell Signaling Technology, Trask lane, Danvers, MA, USA)检测18个磷酸化或裂解的重要且特征良好的信号分子。用透明霉素治疗50μM作用24小时后，两种细胞系的核糖体蛋白S6磷酸化水平(Ser235/236)均下降(图)4)．

4.讨论

在本研究中，我们证明了透明霉素，一种新的HYAL抑制剂分离自海洋链霉菌属hyaluromycini，抑制PDAC细胞的增殖和迁移。我们还发现透明霉素的这些抗癌特性与低分子量ha水平的降低和核糖体蛋白S6磷酸化水平的降低有关。虽然还需要进一步的研究来验证这种药物的抗癌作用，但我们目前的结果表明，透明霉素是一种很有前途的治疗PDAC的药物。

在病理条件下，HA以不同的分子量存在，HA的大小在其对癌症进展的影响方面是重要的。特别是低分子量- ha，而不是高分子量- ha，更有可能促进癌症生长和转移[8］．我们还证明了直接向培养的PDAC细胞中添加低分子量- ha比HMW-HA更能增强其迁移能力[9］．因为HA被HYALs降解，加速HYAL活性与侵袭性肿瘤进展相关[3.］．例如，HYAL1(主要HYALs之一)的过表达导致前列腺癌和乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和转移增加[14，15］．

基于这些发现，增强HYAL活性被认为是癌症治疗的理想目标。事实上，以前的研究显示了几种HYAL抑制剂的抗肿瘤作用。例如，甘草酸是一种HYAL抑制剂，也被称为消炎药，它能抑制各种癌症的生长、迁移和转移，包括胶质母细胞瘤、肺癌和白血病[10］．此外，硫酸氢盐在60多年前被报道为睾丸HYALs的抑制剂[16]主要通过诱导前列腺癌细胞凋亡来抑制肿瘤生长[11］．此外，葡聚糖硫酸盐，一种HYAL抑制剂[17]，通过降低内源性低分子量ha水平来减少乳腺癌细胞的迁移和侵袭[8］．我们还证明了葡聚糖硫酸盐对HYAL活性的抑制显著抑制了PDAC细胞的迁移[5］．尽管葡聚糖硫酸盐具有HYAL抑制剂的作用，但它也被认为是一种强致癌物，用于炎症相关的小鼠结肠癌变模型[18，19］．我们的研究结果首次表明，透明霉素对PDAC细胞的抗肿瘤作用与低分子量ha水平的降低有关。由于透明霉素来源于天然海洋物种，且对HYAL具有强大的抑制活性，因此它可能成为治疗PDAC和其他癌症的有前途的抗肿瘤药物。

我们还发现，透明霉素治疗导致核糖体蛋白S6磷酸化水平下降，而S6是PI3K/Akt/mTOR通路的中介[20.］．类似地，其他HYAL抑制剂也被报道以这一途径为靶点。例如，以前的研究表明，甘草酸灭活Akt/mTOR/STAT3通路[10］．此外，硫酸化的HA抑制PI3K/Akt通路作为HA的主要信号靶点[11］．有趣的是，rpS6的过表达和磷酸化促进了非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[21］．因此，PI3K/Akt/mTOR通路失活可能是HYAL抑制剂抗肿瘤作用的潜在机制。然而，我们的研究显示，用透明霉素处理PDAC细胞后，核糖体蛋白S6的磷酸化水平下降，但Akt和mTOR的磷酸化水平没有下降。透明霉素可能不依赖于PI3K/Akt/mTOR通路靶向核糖体蛋白S6的磷酸化，但我们还需要进一步的研究来证实我们目前的研究结果。

5.结论

总之，我们证实了透明霉素通过降低低分子量ha水平，至少部分地抑制了PDAC细胞的增殖和迁移。

缩写

哈:	透明质酸
PDAC:	胰腺导管腺癌
HYALs:	透明质酸酶
高分子量:	高分子量
流明瓦:	低分子量
沙:	硫酸透明质酸
的边后卫:	胎牛血清。

相互竞争的利益

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。

致谢

作者感谢Ueda女士(日本北九州职业和环境卫生大学外科1系研究助理)提供的技术援助。

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