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肿瘤血管生成2012.

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研究文章|开放访问

体积 2012年 |文章ID. 794172 | https://doi.org/10.1155/2012/794172

Una Adamcic, Clorinda Castagna, Kanwal Minhas, Siranoush Shahrzad, Brenda L. Coomber那 “联合抗血管生成疗法对异种移植的人类黑色素瘤缺乏疗效“，肿瘤学杂志那 卷。2012年那 文章ID.794172那 9. 页面那 2012年。 https://doi.org/10.1155/2012/794172

联合抗血管生成疗法对异种移植的人类黑色素瘤缺乏疗效

Una Adamcic那1 Clorinda Castagna.那1 Kanwal Minhas.那1 Siranoush Shahrzad.那1 和 Brenda L. Coomber.1

1安大略省兽医学院生物医学科学系，圭尔夫大学，圭尔夫，加拿大

学术编辑：kalpna gupta
已收到 2011年4月30日
修改 05年8月2011年
公认 05年8月2011年
发表 2011年10月5日

摘要

抗血管生成治疗在理论上是一种很有前途的抗癌方法，但并不总是产生显著的肿瘤控制。因此，正在研究联合抗血管生成治疗以提高临床效益的策略。血管生成阻断的常见靶点包括内皮特异性受体，如Tie2/Tek，它通过周细胞的募集和成熟来表明血管稳定。在这里，我们报道了靶向Tie2抗血管生成治疗(TekdeltaFc)联合非靶向周期环磷酰胺(LDM CTX)(据报道也以抗血管生成方式起作用)在异种移植的人类黑色素瘤中的作用。单独而言，这些疗法显示了短暂的抗肿瘤活性，但在联合治疗中，没有显著降低肿瘤生长。此外，虽然TekdeltaFc导致治疗血管中周细胞覆盖率的预期增加，但LDM CTX单独或联合TekdeltaFc导致VEGF生成水平的增加。总的来说，我们的数据突出了抗血管生成方案结合时可能发生的分子相互作用的复杂性。

1.介绍

当以明显低于最大耐受剂量(MTD)的节律性剂量给药时，细胞毒性化疗药物可能具有抗血管生成特性，因此似乎没有严重或甚至没有细胞毒性副作用[1］．环磷酰胺（CTX），氮芥子烷基化剂，是低剂量衡量化疗的临床上最研究的药物[2那3.］．与MTD相比，低剂量环磷酰胺的衡量施用诱导肿瘤中遗传稳定内皮细胞的选择性凋亡（因此避难所抗药性）[4.那5.］．此外，研究表明，这种效应是由于血栓反应蛋白-1 (Thrombospondin-1)的过量产生，这是一种众所周知的、高度特异的、有效的内源性血管生成抑制剂[6.那7.］．有趣的是，在培养的卵巢上皮细胞中报道了血栓样蛋白-1和VEGF生产之间的反向关系，并且已显示LDM-CTX降低乳腺癌患者的VEGF水平[8.]，暗示VEGF表达与LDM-CTX诱导的血压素-1表达的可能关系。一般而言，当与靶向内皮细胞的抗血管生成抑制剂组合时，用LDM化疗治疗的癌症的抗肿瘤效应甚至更明显，靶向内皮细胞9.那10.］．Tie2受体主要在内皮细胞上发现，在正常脉管系统中组成型表达[11.］．因此，当我们的实验室确定缺乏Tie2表达的人类癌症中的血管时，令人惊讶。特别是，恶性黑素瘤具有评估的所有癌症类型的最高百分比（〜15％）的Tie2阴性血管[12.］．血管生长因子受体等血管生长因子受体的差异表达可能是由于肿瘤微环境条件，例如缺氧和低血糖症，这在氧气供应和消耗之间的不平衡和改变的能量需求之间发生13.-15.］．

Tie2在肿瘤脉管系统中的异质表达表明Tie2在肿瘤血管生成中的作用，然而，阐明Tie2表达在肿瘤中的功能意义所需使用特定的Tie2抑制剂Tekdeltafc，其是Tie2的人造细胞外结构域[16.］．由于血管生成素与Tie2细胞外结构域具有高亲和力，我们推断该抑制剂应该能有效地干扰血管生成素介导的Tie2活性。此外，我们假设肿瘤微环境至少是恶性黑色素瘤血管中Tie2表达缺失的部分原因，并研究了Tie2异质性是由严重缺氧或低血糖引起的可能性。

过量的肿瘤血管生成与转移性黑素瘤的预后差有关[17.］．因此，以肿瘤微血管为靶点的抗血管生成疗法已被广泛应用于临床试验，并与标准化疗方案相结合。在一项这样的研究中，抗血管生成的低剂量紫杉醇联合塞来昔布使15%的转移性黑色素瘤患者的病情稳定超过6个月[18.］．在使用抗vegf、贝伐单抗(Avastin)联合卡铂和紫杉醇治疗的黑色素瘤患者中也观察到临床益处[19.]，或与干扰素组合 -α.2 b (20.］．然而，迄今为止，尚未探讨Tie2抑制Tie2抑制对黑色素瘤血管生成，单独或与其他抗血管生成策略组合的影响。

最近的出版物表明，同时使用多种抗血管生成疗法与衡量细胞，低剂量化疗，从而靶向多于一个内皮细胞信号传导途径[5.那21.那22.］．为了确定靶向抗血管生成治疗(如Tie2抑制)是否可以通过非靶向抗血管生成治疗(如LDM CTX)增强反应，我们检测了这种联合方法对人类恶性黑色素瘤细胞异种移植的影响。

2.方法

2.1。细胞系和试剂

人黑素瘤细胞系WM239最初从患者的转移性病变中分离出[23.］．将细胞维持在Dulbecco的改性鹰培养基（Sigma-Aldrich），其补充有10％FBS（Invitrogen），丙酮酸钠（Invitrogen）和庆大霉素（Invitrogen），在5％Co中的37℃下在37℃下潮湿的气氛中2。Tie2抑制剂，鼠Tekdeltafc由Amgen提供。环磷酰胺（CTX）购自Sigma Aldrich。

2.2。肿瘤异种移植物的生长

下面描述的所有程序是根据加拿大动物护理理事会的准则和建议进行的，并受到圭尔夫本地​​动物护理委员会大学批准的。肿瘤异种移植物成立rag1.-免疫缺陷小鼠[24.]通过注入100 μ.L含0.1％BSA / PBS溶液 1 × 1 0. 6. 黄色素瘤细胞皮下侧面。每周测量肿瘤生长和使用等式估计的肿瘤大小：体积=长度×宽度2  × 0.5. Once tumors reached at least 100 mm3.，将小鼠随机分配到含有8只小鼠的四个处理基团中的一种中。如下处理小鼠14天：第1组收到250 μ.g tekdeltafc为250 μ.L i.p。每3天;第二组在饮用水中加入低剂量环磷酰胺(相当于30 mg/kg/d;水每周更换两次);第3组在饮用水中同时给予TekdeltaFc / 3 d和低剂量环磷酰胺;对照组小鼠250只μ.L i.p。每3天注射无菌PBS和未经处理的饮用水。每3-4天测量一次试验期间的肿瘤生长情况。

在安乐死前一小时，注射了小鼠I.P.含150毫克/千克低氧百货-1（Chemicon International Inc.）。由COSETH化的小鼠被安乐死2窒息，然后是颈椎脱位。将肿瘤从周围组织中解剖并切成碎片，嵌入在10月Cryomatrix（Fisher Scientific）中嵌入液氮中，在液氮中冷冻，固定在4％多聚甲醛（USB Corporation）中，用于24小时和石蜡包埋，或在液氮中冷冻冷冻并储存在-80°C以进行未来的蛋白质隔离。

2.3。肿瘤缺氧和坏死区域的定量

多甲甲醛固定石蜡嵌入8 μ.m厚切片脱脂，枸橼酸钠抗原回收(10 mM, pH = 6.0，煮沸8分钟，RT冷却15分钟)。抗原提取后，切片被洗涤，首先用Dako无蛋白块(Dako)封闭15分钟，然后用5%的正常山羊血清(Sigma-Aldrich)封闭30分钟。然后，用3%双氧水(Fisher Scientific)阻断内源性过氧化物酶活性15分钟，然后切片被洗涤，并在小鼠Hypoxyprobe-1抗体(Chemicon International)中(1:50)4℃过夜，然后用山羊抗鼠生物素化二抗(1:200)孵育30分钟。切片用rt.u. Vectastain Elite ABC试剂(Vector)洗涤30分钟，然后用底物试剂二氨基联苯胺(DAB)孵育2分钟。然后用水冲洗切片，使用Mayer 's苏木精溶液(水1:1稀释)(Sigma-Aldrich)进行反染色1分钟，并使用Aquapolymount (Polyscience)进行安装。总共，对20个肿瘤中的每个肿瘤进行了评估(4个治疗组中的每个治疗5个)。采用盲法，使用徕卡DMLB复合光学显微镜的20倍放大镜，配备Q成像QICAM fast1394数码相机，使用Q- capture软件，根据肿瘤大小，将某些切片细分为1至4个视野。通过强烈的棕色反应产物识别缺氧区域，坏死区域被识别为毗邻缺氧区域和缺乏完整的、清晰的细胞核(苏木精染色)。使用Optimas 6.0软件(Optimas, Houston)量化每个切片中缺氧和坏死的面积，并计算每个切片面积中缺氧/坏死或缺氧和坏死的百分比。

2.4。系列Tie2表达和微血管密度（MVD）

为了评估Tie2表达模式以及确定MVD，评估来自每个肿瘤的两个组织块。冷冻冻死，8 μ.M厚，使用调节至-20°C的低温恒温器切割。一旦切割，部分将在-80℃下储存直至进一步使用。对于免疫荧光染色，部分在室温下在冷却甲醇/丙酮（50：50）中在-20℃下固定在冷却甲醇/丙酮（50：50）中，然后风干。然后，在PBS中再水化部分并在室温下使用10％正常的山羊血清（Sigma-Aldrich），然后在室温下进行1小时，在室温下进行1小时，并与山羊孵育抗激会偶联20分钟（1：200;杰克逊免疫研究）。使用Dako蛋白 - 无蛋白质嵌段（DAKO）封闭切片15分钟，使用大鼠抗CD31抗体（1：50; HYCOLT生物技术）在4℃下在4℃下孵育过夜，其次是驴Antitrat FITC二次抗体30分钟（1： 100; Jackson ImmunoResearch) and 2 minutes in DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) (Dako) nuclear stain. Slides were then washed briefly in water and mounted using Fluorescent Mounting media (Dako). Entire sections were examined by epifluorescence microscopy using the 20x objective in a semiblinded fashion. MVD was determined by dividing the total number of blood vessels per field of view, to obtain a value expressed as number of blood vessels per mm2。

2．5．血管周细胞覆盖的定量

为了评估肿瘤血管的间质覆盖程度，评估来自每个肿瘤的两种嵌段。冷冻冻死，8 μ.M厚，如前所述固定，然后在PBS中再水化，使用0.05％Tween-PBS渗透10分钟，并在室温下使用10％正常的山羊血清（Sigma-Aldrich）封闭30分钟。将部分孵育在兔抗PDGFR的混合物中 -β（1：100;细胞信号传导技术）和生物素化大鼠抗CD31（1：60; HYCLUET）一抗在4℃下过夜。在PBS中洗涤部分，并在与Cy3（1：200; jackson免疫研究）缀合的山羊抗津贴二抗的混合物中温育，并在室温下缀合与alexa350（1：150; invitrogen）的链霉抗生物素蛋白，然后在室温下进行40分钟，然后是兔抗灭菌primary antibody for 30 minutes (1 : 100; Abcam, Cambridge, Mass, USA) conjugated to Alexa488 using the rabbit antibody labeling kit according to manufacturer’s protocol (Invitrogen). Sections were mounted in Fluorescent Mounting Media (Dako) and examined using epifluorescence microscopy as previously described. Five random fields were captured, and blood vessels were enumerated as CD31积极的/ desmin积极的/ PDGFR -β积极的或CD31积极的/ desmin负/ PDGFR -β负并表示为每节百分比。

2.6。异种移植肿瘤裂解物中VEGF水平的测定

可商购的人和小鼠VEGF ELISA试剂盒（R＆D Systems）用于量化来自每个治疗组（对照，Tekdeltafc，LDM CTX和Tekdeltafc + LDM CTX）的裂解肿瘤异种移植物中的VEGF水平。简而言之，冷冻肿瘤碎片（每组3-5个）在冰上被过漂化并使用一次性组织研磨机和细胞裂解缓冲液（细胞信号传导）裂解。如前所述收集蛋白质，并根据制造商的方案进行VEGF ELISA。相对于总肿瘤蛋白表达值。

2.7。统计分析

使用Microsoft Excel（Microsoft）完成计算初步摘要统计数据，例如平均值，标准偏差和标准错误。在所有样本上，使用Grubbs的测试，也称为ESD方法（极端学生化偏差），用于确定重要的异常值。从分析中识别并省略了异常值，如果有的话;进行ANOVA以确定组内和之间的重要性（ < 0. 。 0. 5. )．此外，如果组之间存在显着差异，则使用最低差异（Tukey）测试。数据显示为均值和标准错误。

结果

3.1。LDM CTX和Tekdeltafc在黑色素瘤异种移植物的影响

虽然CTX LDM和Tekdeltafc与对照相比表现出肿瘤生长的降低，但这些差异没有统计学意义（图1; > 0. 。 0. 5. )．令人惊讶的是，当CTX LDM和Tekdeltafc组合时也没有添加效果，因为这种双靶抗血管制度对任何时间点的对照同比对肿瘤生长也没有显着影响（图1; > 0. 。 0. 5. )．当评估肿瘤切片的细胞反应时(图2（a）)，我们发现在治疗组之间存活或缺氧区域的比例没有显著差异(图2（b）; > 0. 。 0. 5. )．然而，与对照组和联合治疗的肿瘤相比，CTX LMD治疗的肿瘤组织坏死和缺氧显著降低(图)2（b）; < 0. 。 0. 5. )．


图1
> 0. 。 0. 5. TekdeltaFc和LDM CTX治疗的人黑色素瘤癌细胞的体内异种移植。各治疗组的相对肿瘤生长情况:对照组、TekdeltaFc、低剂量节拍环磷酰胺(LDM CTX)和联合用药2周。各治疗组在任何时间点的肿瘤生长均无统计学差异()．
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（b）
图2.
< 0. 。 0. 5. 用Tekdeltafc和LDM CTX处理肿瘤异种移植物中缺氧和坏死区域的定量。（a）代表性低（5倍，左）和高（20倍，右）放大次数的缺氧免疫沉淀，用于肿瘤切片中的低氧百次加合物和组织坏死。深棕色区域是缺氧（箭头），浅棕色区域是可行的肿瘤（箭头），并且缺少棕色反应产物并含有降解核的区域是坏死组织（星号）。（b）在每个治疗组中定量平均可行组织，缺氧，坏死或缺氧和坏死，与对照组和组合相比，LDM-CTX处理的​​肿瘤中的坏死性和坏死加缺氧区域的比例差异显着差异（*)．

我们量化微血管密度（MVD）以及肿瘤异种移植部分中的Tie2阴性容器的比例染色，染色CD31和Tie2（图3.（一种））。Tie2阴性血管的平均数约为12.5％，证实我们先前发现Melanoma的Tie2血管异质性[12.];治疗组之间没有显着差异（ > 0. 。 0. 5. )．尽管与Tekdeltafc治疗组相比，在LDM-CTX处理的​​肿瘤中观察到下降的MVD，但这在统计学上没有统计学意义（ > 0. 。 0. 5. ） （数字3.（b））。


图3.
2 > 0. 。 0. 5. > 0. 。 0. 5. CD31和Tie2双免疫荧光染色。(a)用Cy3将Tie2荧光标记为红色，用FITC将CD31荧光标记为绿色。典型的tie2阳性血管用星号标记，典型的tie2阴性血管用箭头标记。(b)平均血管密度的量化(cd31阳性血管数/mm))。不同治疗组间血管密度差异无统计学意义()．（c）用Tekdeltafc和/或LDM CTX处理的​​肿瘤异种移植物中％Tie2阴性血管的量化。图表描绘了每个治疗组的平均％的Tie2阴性血管;组之间的差异没有统计学意义（)．
3.2。与低剂量CTX治疗相比，Tekdeltafc显着增加了肿瘤血管的周围覆盖率

对带有desmin和PDGFR-抗体的异种移植物冷冻切片使用三重免疫荧光β检测血管壁的细胞[25.］．血管分类为Desmin/PDGFR-β积极的或desmin / pdgfr-β负（数字4(一))．我们观察到统计上有显着差异（ < 0. 。 0. 5. )。tekdeltafc治疗的肿瘤有统计学意义( < 0. 。 0. 5. ）与所有其他组相比，平均覆盖率增加（图4 (b))．

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图4.
β β β β < 0. 。 0. 5. 血管和血管治疗肿瘤中的免疫染色。（a）图像显示使用抗体对CD31（Alexa 350;蓝色）的抗体染色的血管（alexa 350;蓝色），pdgfr-(Cy3;红色)，CD31/desmin/PDGFR-覆盖。星号标记壁球细胞的血管负（Desmin也没有PDGFR-）箭头表示血管患有正壁细胞标记物（Desmin和PDGFR-染色）。（b）用Tekdeltafc和/或LDM CTX治疗的肿瘤中血管周细胞覆盖的定量。TEKDELTAFC和所有其他治疗组之间的“稳定”血管的百分比率明显不同（*)．
3.3。Tekdeltafc和LDM CTX增加了VEGF表达

裂解来自各处理基团的肿瘤件，分析VEGF表达并表示为PG / mL，用于肿瘤裂解物中的总蛋白质归一化。人VEGF水平显着增加（ < 0. 。 0. 5. ）在Tekdeltafc和LDM CTX组合治疗的肿瘤与所有其他治疗组相比。此外，人类VEGF浓度明显高（ < 0. 。 0. 5. )，与对照组比较(图5（a）)．虽然在LDM-CTX处理的​​肿瘤中鼠VEGF水平最高，但ANOVA表明，小鼠VEGF水平没有显着差异（ > 0. 。 0. 5. ;数字5（b）)．

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图5.
< 0. 。 0. 5. > 0. 。 0. 5. VEGF在异种移植肿瘤中的表达。用ELISA法测定肿瘤裂解物中VEGF水平的浓度，并以pg/mL表达，归一化为肿瘤裂解物中的蛋白含量。(a)治疗组间人VEGF水平有显著差异(*)．在对照肿瘤中检测到最低的人VEGF浓度，而在组合治疗组中检测到最高VEGF浓度，表明Tekdeltafc和LDM CTX治疗单独和组合显着上调的黑色素瘤细胞VEGF表达。（b）治疗组之间的鼠VEGF没有显着差异（)．

4。讨论

肿瘤血管生成是一种有吸引力的治疗靶标，因为它是由最常见的，也许所有类型的人类癌症共享[26.］．考虑到肿瘤进展中血管生长的重要性，与细胞毒性化学疗法相比，靶向肿瘤内皮的方法可以提供对疾病的长期和更有效的控制。使用抗血管生成剂的优点是，在生理条件下，与肿瘤内皮细胞相比，正常内皮细胞与正在激发和迁移的肿瘤内皮细胞相比，这最大限度地减少了对正常内皮的可能副作用[27.］．此外，内皮细胞与癌细胞比癌细胞更稳定，并且抗血管生成剂递送不能不必渗透大笨重的质量。最后，抗血管生成疗法可以具有不同的作用方式干扰血管生成配体，其受体或下游信号，上游/递送内源性抑制剂，或直接影响肿瘤脉管系统[28.］．最近，很明显，癌细胞招募了各种骨髓来源的细胞，这些细胞也能够以直接和间接的方式促进血管系统[29.］．

TekdeltaFc(小鼠Tie2/Tek受体的胞外结构域与小鼠IgG的Fc部分融合)的作用机制涉及与Ang1和Ang2的高强度结合[16.］．示出了类似的抑制分子，extek通过螯合可用的血管发球率作为Tie2的强效抑制剂，以及与Tie2受体结合，抑制与细胞存活相关的磷酸化和下游信号分子[30.-32.］．有趣的是，Extek在鼠黑色素瘤模型中减少了肺转移的数量[33.］．采用不同版本的Tie2细胞外结构域作为抑制剂的其他研究取得了类似的肿瘤模型的效果[34.-36.］．

在我们的研究中，与Tekdeltafc治疗相比，LDM CTX对肿瘤血管密度有更深刻的影响，但这些差异并不重要。LDM CTX可以通过显着降低从骨髓的循环内皮细胞的动员，如前所述，通过显着降低肿瘤生长对肿瘤生长产生间接影响[37.］．有趣的是，用这些抗血管生成剂治疗肿瘤并未导致肿瘤组织的缺氧/坏死增加。这可以通过我们以前的一些工作解释，表明WM239细胞可以产生降低的血管依赖性，因此即使它们的血管密度降低，也可以增强存活率[38.[血管密度降低实际代表血管床的“归一化”，伴随着改善的灌注[39.］．这种机制与ldm - ctx治疗的肿瘤与对照组或联合治疗组相比坏死组织的数量最低的事实是一致的。

我们还观察到TekdeltaFc单独导致desmin/PDGFR-显著增加β与对照，LDM CTX或组合疗法相比，血管双阳性周围覆盖率。先前已经证明抗血管生成疗法通过增加的周刊覆盖率诱导血管的成熟来改善化疗的反应[27.那40］．肿瘤类型之间的周刊特征具有相当大的变异性，一些研究报告称成熟的周细胞是PDGFR-β阴性和desmin阳性[40]，而其他研究报告说肿瘤周套群可以具有重叠标记[41.］．有趣的是，pdgfr-β- 呈阳性/去灭敏阴性细胞更有可能从相邻容器中脱离[41.］．在异常的肿瘤脉管系统中，VEGF诱导微血管内内皮细胞的Ang-2表达[42.那43.］．通过与Tie2结合，Ang-2成为内皮细胞功能的自分泌调节剂;它是否充当激动作用者[42.那44.或拮抗剂[45.]是上下文依赖[46.］．现在已知在体外Ang-2抑制Ang-1的稳定效果，但如果Ang-1不存在[47.］．在我们的肿瘤模型中，TekdeltaFc可能导致大量表达的Ang-2的隔离，从而使Ang-1结合并使Tie2磷酸化，从而观察到周细胞覆盖率的增加。血管“正常化”与改善对细胞毒性化疗的反应有关[21.那48.[因此，在最大耐受剂量的情况下使用CTX而不是衡量衡量剂量可能更有效。

TekdeltaFc和LDM CTX单独在较早的时间点均导致肿瘤体积显著减少，但在两周治疗后未能做到这一点。这可能是由于大多数晚期恶性肿瘤产生多种血管生成因子，因此仅针对血管生成素(在TekdeltaFc治疗的肿瘤中)或仅针对VEGF(在ldm - ctx治疗的肿瘤中)可能不足以完全控制肿瘤[8.那28.那49.那50.］．肿瘤也可能对TekdeltaFc或LDM CTX产生耐药性，允许它们在最初的抑制后重新生长。有趣的是，TekdeltaFc和LDM CTX联合治疗的异种肿瘤移植的增长速度与对照组相同，这表明这两种疗法之间存在潜在的干扰。这与Ang2中和抗体的结果相反，Ang2抗体在异种移植模型中具有强大的抗肿瘤作用，特别是与vegf靶向治疗联合使用时[21.］．与我们的研究不同，可能是因为TekdeltaFc不同于抗Ang2抗体，它影响Ang1和Ang2信号通路。差异可能还与癌症类型有关，因为抗ang2抗体研究没有评估黑素瘤。因此，尽管联合抗血管生成疗法正在成为一种常见的做法[2那22.那50.那51[我们的研究提供了依赖相互作用的证据，依赖于复杂性和肿瘤类型。

令人惊讶的是，我们研究中的治疗肿瘤含有比对照肿瘤的显着更高的人类VEGF水平，而组合的治疗肿瘤含有最多的肿瘤，符合在该试验结束时观察到的常规环境。通常在瞬态响应阶段发生抗血管生成治疗的抵抗力之一是肿瘤中替代常规致途径的上调，例如成纤维细胞生长因子1和2，ephrin A1或Ang1。这些可能会补偿抑制途径并允许肿瘤再生[52］．在一个这样的研究中，在成功但瞬态反应后，用VEGFR抑制剂Cediranib治疗的患者在其复发阶段中的FGF2表达增加[53］．它还已在临床试验中显示酪氨酸激酶抑制剂可以瞬时增加常规因子的水平，例如VEGF [54]，我们在我们现在的研究中观察到。实际上，在抗血管生成的Tie2抑制剂存在下的致癌因子VEGF的增加可能是我们治疗肿瘤中缺乏观察到的血管密度的降低。总的来说，这些数据支持两种不同的抗血管生成治疗可以相互作用以稳定微血管，从而防止血管回归和肿瘤抑制，这表明应在设计这种抗脑组合时注意谨慎。

致谢

这些研究得到了加拿大癌症学会研究所和加拿大卫生研究院的补助金。作者感谢AMGEN为这些研究提供Tekdeltafc。同样谢谢实验室的过去和现在的成员，特别是Karolina Skowronski和Mackenzie Smith为他们的助理，尤其是Guelph中央动物设施，特别是Jackie Rombeek的动物卫生技术人员的援助。

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