乔 肿瘤学杂志 1687 - 8469 1687 - 8450 Hindawi出版公司 794172年 10.1155 / 2012/794172 794172年 研究文章 缺乏综合抗血管新生疗法在异种移植人类黑色素瘤的效果 Adamcic Una Castagna Clorinda Minhas 坎瓦尔 Shahrzad Siranoush 峡谷 布伦达·L。 古普塔 Kalpna 生物医学科学系的 安大略省兽医学院 圭尔夫大学 圭尔夫 在 N1G 2 w1 加拿大 uoguelph.ca 2012年 5 10 2011年 2012年 30. 04 2011年 05年 08年 2011年 05年 08年 2011年 2012年 版权©2012 Una Adamcic et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

抗血管新生疗法在理论上是一个有前途的抗癌方法但并不总是产生显著的肿瘤控制。抗血管新生疗法的组合也因此被调查策略来提高临床受益。常见的血管生成封锁的目标包括内皮特定受体,血管Tie2 / Tek等信号通过招聘和稳定成熟的周。在这里,我们报告的影响目标Tie2抗血管新生疗法(TekdeltaFc)结合不属预定目标的有节奏的环磷酰胺(LDM CTX)(据报道,也在抗血管新生时尚)在异种移植人类黑色素瘤。单独,这些疗法显示瞬态抗肿瘤活性,但结合在一起,没有显著减少肿瘤的生长。此外,尽管TekdeltaFc引起预期的增加在治疗血管外膜细胞覆盖,LDM CTX单独或结合TekdeltaFc导致增加VEGF水平的生产。总的来说,我们的数据突出分子相互作用的复杂性,可能发生当抗血管新生疗法的总和。

 1。介绍

细胞毒性化疗药物可能反血管增生属性管理稳步时剂量远远低于最大耐受剂量(MTD),这样似乎不太严重,甚至没有细胞毒性副作用( 1]。环磷酰胺(CTX),氮芥烷化剂,在临床上研究最多的药物在低剂量化疗有节奏的环境( 2, 3]。MTD相比,节拍器的管理低剂量环磷酰胺诱发的选择性凋亡基因稳定内皮细胞肿瘤(因此绕过耐药性)( 4, 5]。此外,研究表明,这种效果是由于血小板反应蛋白- 1的生产过剩,众所周知,非常具体、有效的内源性血管生成抑制剂( 6, 7]。有趣的是,逆血小板反应蛋白- 1和VEGF生产之间的关系一直在报道养殖卵巢上皮细胞和LDM-CTX已被证明会降低VEGF水平在乳腺癌患者 8),建议一个可能的VEGF表达和LDM-CTX-induced血小板反应蛋白- 1的表达之间的关系。一般来说,癌症治疗的抗肿瘤效应LDM化疗结合抗血管新生抑制剂时更加明显,内皮细胞具体目标( 9, 10]。Tie2受体主要是发现在正常血管内皮细胞,持续表达( 11]。因此,它令人惊讶,当我们实验室发现缺乏血管在人类癌症Tie2表达式。特别是,恶性黑色素瘤(~ 15%)比例最高Tie2-negative血管的癌症类型评估( 12]。微分的血管生长因子受体的表达,如Tie2,可能是由于肿瘤微环境条件,如缺氧和低血糖发生由于氧气供应和消费之间的不平衡和能源需求改变 13- - - - - - 15]。

异构Tie2的表达在肿瘤脉管系统建议Tie2在肿瘤血管生成的作用,然而,阐明Tie2的功能性意义表达肿瘤需要特定TekdeltaFc Tie2抑制剂的使用,这是一个人工细胞外Tie2域( 16]。自组与高亲和力结合Tie2细胞外的领域,我们称这种抑制剂应该有效地干扰angiopoietin-mediated Tie2活动。此外,我们假设肿瘤微环境至少部分负责缺乏Tie2表达式在恶性黑色素瘤的血管和调查的可能性Tie2异质性是由于严重的缺氧或低血糖。

过度的肿瘤血管生成与不良预后有关在转移性黑色素瘤 17]。因此,抗血管新生疗法针对肿瘤微脉管系统已经被集中用于临床试验结合标准化疗方案。在这样的一个研究中,抗血管新生低剂量紫杉醇结合塞来昔布重大疾病引起的稳定的超过6个月15%的转移性黑色素瘤患者( 18]。临床益处也观察到在黑素瘤患者vegf治疗,贝伐单抗(Avastin),结合(卡铂和紫杉醇 19),或结合干扰素 α2 b ( 20.]。然而,到目前为止,Tie2抑制在黑色素瘤血管生成的影响,单独或与其他抗血管新生策略相结合,尚未探索。

最近的出版物显示明显的优势的同时使用多个抗血管新生疗法结合有节奏的,低剂量的化疗,因此针对多个内皮细胞信号通路( 5, 21, 22]。来确定响应等有针对性的抗血管新生治疗可以增强Tie2抑制不属预定目标的抗血管新生疗法如LDM CTX,我们检查了这种结合的方法对人类的影响癌症恶性黑色素瘤细胞异种移植。

 2。方法 2.1。细胞系和试剂

人类黑色素瘤细胞系WM239原本孤立的从病人的转移病灶 23]。细胞被维护在杜尔贝科修改鹰的介质(Sigma-Aldrich)补充10%的边后卫(表达载体),丙酮酸钠(表达载体),和庆大霉素(英杰公司)在湿润的气氛中37°C公司5%2。小鼠TekdeltaFc Tie2抑制剂,是由安进公司提供。从西格玛奥德里奇环磷酰胺(CTX)购买。

 2.2。生长的肿瘤异种移植

所有程序下面描述的准则和建议都是根据加拿大议会批准的动物保健和圭尔夫大学当地动物保护委员会。建立了肿瘤异种移植 RAG1− 拥有(老鼠 24]通过注入100 μL 0.1% BSA / PBS的解决方案包含 1 × 10 6 WM239黑色素瘤细胞皮下注射到右翼。肿瘤生长每周两次和肿瘤大小估计使用方程:体积=长×宽2×0.5。一旦肿瘤达到至少100毫米3,老鼠被随机分配到一个含有8的四个治疗组小鼠。14天小鼠治疗如下:组1收到250 μg TekdeltaFc 250 μL i.p。每3天;饮用水中的第二组接受低剂量环磷酰胺(相当于30毫克/公斤/天;水是每周更换2次);组3收到每3天TekdeltaFc和低剂量环磷酰胺的饮用水;组4控制老鼠收到250 μL i.p。每3天注射无菌PBS和未经处理的饮用水。肿瘤生长期间测量试验每3 - 4天。

一小时前安乐死,小白鼠注射ip有150毫克/公斤Hypoxyprobe-1 (Chemicon International Inc .)。老鼠被公司实施安乐死2窒息颈椎脱位紧随其后。肿瘤周围组织的解剖,切成碎片,嵌入在10月cryomatrix(费舍尔科学),提前在液态氮冷冻,固定在4%多聚甲醛(USB公司)24 h,石蜡包埋,或吸附在液态氮冷冻和储存在为未来的蛋白质隔离−80°C。

 2.3。量化的肿瘤缺氧和坏死区域

Paraformaldehyde-fixed石蜡包埋8 μ米厚的部分deparaffinized,柠檬酸钠抗原检索(10毫米,pH = 6.0,煮8分钟然后冷却15分钟在缓冲RT)。抗原检索后,部分被洗和阻塞首先Dako无蛋白块(Dako) 15分钟,然后用5%正常山羊血清(Sigma-Aldrich) 30分钟。接下来,3%过氧化氢(费舍尔科学)是用于阻断内源性过氧化物酶活动15分钟,然后部分清洗和孵化在鼠标Hypoxyprobe-1抗体(Chemicon国际)(1:50)一夜之间在4°C,紧随其后的是山羊antimouse生物素化的二次抗体(1:200)30分钟。部分被清洗和处理R.T.U. Vectastain精英ABC试剂(向量)30分钟后跟孵化基质试剂diaminobenzidine (DAB) 2分钟。部分然后用水冲洗,使用迈耶的苏木精复染色方案(与水稀释1:1)(Sigma-Aldrich) 1分钟,并安装使用Aquapolymount (Polyscience)。总的来说,从每个二十肿瘤评估两个街区从四种治疗组(5)。图片都被蒙蔽的方式使用20 x放大目标的徕卡DMLB复合光学显微镜装有问成像QICAM fast1394数码相机使用Q capture软件,根据肿瘤的大小,某些部分被分为四个领域的观点。缺氧地区被布朗强烈反应产物,确定和坏死区域被确定为毗邻缺氧区和缺乏完整,良好定义的原子核(如与苏木精染色)。最适条件6.0软件(最适条件,休斯顿)被用来量化缺氧、坏死比例在每个部分和缺氧/每部分坏死或缺氧坏死面积计算。

 2.4。量化Tie2表达和微血管密度(MVD)

评估Tie2表达模式以及确定MVD,两个从每个肿瘤组织块进行了评估。Cryosections 8 μ米厚,减少使用低温恒温器调整−20°C。一旦减少,部分储存在−80°C,直到进一步的使用。immunofluorescent染色,部分在RT风干,固定在冷甲醇/丙酮(50:50)10分钟−20°C,然后风干。然后,部分患者在PBS和阻止使用10%正常山羊血清(Sigma-Aldrich) 1 h在室温下鼠标anti-Tie2紧随其后(1:100;BD生物科学)1 h与山羊在室温和孵化antimouse Cy3共轭二次抗体20分钟(1:200;杰克逊ImmunoResearch)。部分被封锁使用Dako无蛋白块(Dako) 15分钟,孵化一夜之间在4°C使用老鼠anti-CD31抗体(1:50;Hycult生物技术),其次是驴antirat FITC二级抗体30分钟(1:100;杰克逊ImmunoResearch)和2分钟DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole) (Dako)核染色。幻灯片被洗短暂在水和安装使用荧光安装媒体(Dako)。 Entire sections were examined by epifluorescence microscopy using the 20x objective in a semiblinded fashion. MVD was determined by dividing the total number of blood vessels per field of view, to obtain a value expressed as number of blood vessels per mm2。

 2.5。量化的血管外膜细胞覆盖

评价肿瘤血管外膜细胞覆盖的程度,从每个肿瘤评估两个街区。Cryosections 8 μ米厚,是固定的如前所述,那么患者在PBS, permeabilized使用0.05% Tween-PBS 10分钟和阻止使用10%正常山羊血清(Sigma-Aldrich) 30分钟在rt,部分被孵化兔子anti-PDGFR——的混合物 β(1:100;细胞信号技术)和生物素化的老鼠anti-CD31 (1: 60;Hycult)主要抗体在一夜之间在4°C。部分被洗在PBS和孵化的混合物山羊antirabbit二级抗体共轭Cy3 (1: 200;杰克逊ImmunoResearch)和链霉亲和素共轭Alexa350 (1: 150;英杰公司)在室温下40分钟紧随其后的是兔子anti-desmin主要抗体30分钟(1:100;Abcam,剑桥,质量,美国)共轭Alexa488使用兔抗体标记工具根据制造商的协议(表达载体)。部分是安装在荧光安装媒体(Dako)和检查使用显微数字化如前所述。五个随机领域被抓获,血管就像CD31枚举积极的/肌间线蛋白积极的/ PDGFR - β积极的或CD31积极的/肌间线蛋白负/ PDGFR - β负每节和百分数表示。

 2.6。测量肿瘤异种移植的VEGF水平溶菌产物

商用人类和小鼠VEGF ELISA试剂盒(R & D系统)被用来量化VEGF水平细胞溶解肿瘤异种移植的每个治疗组(控制、TekdeltaFc LDM CTX和TekdeltaFc + LDM CTX)。短暂,冷冻肿瘤块(每组3 - 5)解冻在冰和细胞溶解磨床使用一次性纸巾和细胞裂解缓冲(细胞信号)。像前面所述蛋白质收集,VEGF ELISA根据制造商的协议执行。值是表示相对于总肿瘤蛋白质。

 2.7。统计分析

计算初步汇总统计等意思,标准差和标准误竣工使用Microsoft Excel(微软)。在所有样本,格拉布的测试,也称为ESD方法(极端studentized偏离),是用来确定重要的异常值。一旦离群值(如果有的话)是识别和省略的分析;进行方差分析,以确定内部和意义之间组( P < 0.05 )。此外,最显著的差异(图基)测试是使用如果组之间有显著差异。数据平均值和标准误差。

 3所示。结果 3.1。LDM CTX和TekdeltaFc黑色素瘤异种移植的影响

而CTX LDM和TekdeltaFc显示减少肿瘤的生长控制相比,这些差异没有统计学意义(图 1; P > 0.05 )。令人惊讶的是,也没有累加效应CTX LDM和TekdeltaFc结合时,这种双重目标抗血管新生政权也相比没有显著影响肿瘤的生长控制在任何时间点(图 1; P > 0.05 )。当肿瘤细胞反应(图的部分进行评估 2(一个)),我们没有发现显著差异在可行的比例或缺氧治疗组(图之间的区域 2 (b); P > 0.05 )。然而,显著降低大量的组织坏死,坏死+缺氧与CTX LMD观察到肿瘤治疗相比,控制和combination-treated肿瘤(图 2 (b); P < 0.05 )。

体内异种移植的人类黑色素瘤癌细胞TekdeltaFc和LDM CTX治疗。相对为每个治疗组肿瘤生长:控制、TekdeltaFc,低剂量的节拍器的环磷酰胺(LDM CTX)和组合了两个星期。没有统计上显著的差异在治疗组肿瘤生长在任何时间点( P > 0.05 )。

量化的缺氧和坏死区域肿瘤异种移植TekdeltaFc和LDM CTX治疗。(一)代表低(5 x(左)和高(20 x,右)放大图像的缺氧疣状Hypoxyprobe加合物在肿瘤的部分和组织坏死。深棕色区域是缺氧(箭头),浅棕色区域是可行的肿瘤(箭头),和地区缺乏棕色反应产物和包含退化核坏死组织(星号)。(b)量化的平均百分比可行的组织缺氧、坏死,在每个治疗组和缺氧坏死,坏死的比例表现出显著差异,LDM-CTX-treated肿瘤坏死+缺氧地区相比,控制和组合(* P < 0.05 )。

我们量化微血管密度(MVD)的比例以及Tie2-negative血管肿瘤异种移植部分CD31染色和Tie2(图 3(a))。Tie2 -血管的平均数是12.5%,证实了我们之前的发现Tie2血管异质性在黑色素瘤( 12];治疗组之间没有显著差异( P > 0.05 )。虽然减少MVD在LDM-CTX-treated肿瘤TekdeltaFc治疗组相比,这不是统计学意义( P > 0.05 )(图 3(b))。

双重免疫荧光染色和CD31 Tie2。(一)Tie2荧光标记红色使用Cy3 CD31在使用FITC绿色荧光标记。代表Tie2-positive血管标有星号代表Tie2-negative血管用箭头标记。(b)量化的平均血管密度(CD31-positive船只的数量/毫米2治疗组之间)。没有统计上显著的差异之间的血管密度不同的治疗组( P > 0.05 )。(c)量化的% Tie2-negative血管肿瘤异种移植TekdeltaFc和/或LDM CTX处理。图描绘了平均% Tie2-negative血管治疗组;组之间的差异没有统计学意义( P > 0.05 )。

 3.2。TekdeltaFc显著增加血管外膜细胞肿瘤的报道相比,低剂量CTX治疗

三重免疫荧光法是利用在冰冻的异种移植肌间线蛋白抗体和PDGFR - β检测血管壁细胞( 25]。船只被归类为肌间线蛋白/ PDGFR - β积极的或肌间线蛋白/ PDGFR - β负(图 4(一))。我们观察到一个统计上的显著差异( P < 0.05 治疗组之间)。TekdeltaFc-treated肿瘤有统计学意义( P < 0.05 )增加周皮细胞覆盖率相比其他组(图 4 (b))。

血管和周围的周组织化学染色,在治疗肿瘤。(一)图像显示血管immunofluorescently使用抗体CD31染色(Alexa 350;蓝色),肌间线蛋白(Alexa 488;绿色),PDGFR - β(Cy3;红色),覆盖CD31 /肌间线蛋白/ PDGFR - β。星号标志着壁画的血管-细胞(肌间线蛋白和PDGFR - β与积极的壁画),箭头表示血管细胞标记(肌间线蛋白和PDGFR - β染色)。(b)量化的血管外膜细胞覆盖肿瘤TekdeltaFc和/或LDM CTX处理。“稳定”的百分比之间的血管外膜细胞覆盖率显著不同TekdeltaFc和所有其他治疗组(* P < 0.05 )。

 3.3。TekdeltaFc和LDM CTX VEGF表达增加

肿瘤碎片从每个治疗组细胞溶解和VEGF表达分析和表达为pg / mL,归一化总蛋白的肿瘤溶解产物。人类VEGF水平明显增加( P < 0.05 )TekdeltaFc和LDM CTX治疗肿瘤相比,所有其他的治疗组。此外,人类VEGF浓度明显高于( P < 0.05 )与对照组相比,LDM CTX(图 5(一个))。虽然在LDM-CTX-treated肿瘤小鼠VEGF水平最高,方差分析表明,整体小鼠VEGF水平没有显著差异( P > 0.05 ;图 5 (b))。

VEGF的表达在肿瘤异种移植。肿瘤VEGF浓度水平溶菌产物用ELISA和表达为pg / mL规范化肿瘤溶解产物中蛋白质含量。(一)人类VEGF水平之间有显著差异治疗组(* P < 0.05 )。人类VEGF浓度最低的是发现在控制肿瘤联合治疗组最高的VEGF浓度检测,表明TekdeltaFc和LDM CTX治疗可以单独使用,也可以结合显著调节黑色素瘤细胞VEGF表达。(b)没有明显差异在小鼠VEGF治疗组( P > 0.05 )。

 4所示。讨论

肿瘤血管生成是一个有吸引力的治疗目标,因为它是共享的最常见,或许,人类癌症的类型 26]。考虑血管生长在肿瘤进展的重要性,方法针对肿瘤内皮使用抗血管新生疗法可能会提供一个长期的和更有效的控制疾病相比,细胞毒性化疗。使用抗血管新生药物的优点之一是,在生理条件下,正常内皮细胞静止比较积极肿瘤内皮细胞增殖和迁移,减少副作用的正常内皮细胞( 27]。此外,内皮细胞比癌细胞基因更稳定,抗血管新生代理交付不太复杂,没有穿透大型笨重的质量。最后,抗血管新生疗法可以有不同的方式action-interfering与血管生成配体、受体或下游信号,upregulation /交付内源性抑制剂,或通过直接影响肿瘤脉管系统( 28]。最近,它已成为明显的,癌细胞招募各种从骨髓细胞还能有助于血管在直接和间接的方式 29日]。

的作用机制TekdeltaFc(小鼠Tie2 / Tek受体的细胞外域融合小鼠免疫球蛋白的Fc部分)涉及高活动性Ang1和绑定Ang2 [ 16]。ExTek,类似的抑制分子显示函数作为一个强有力的抑制剂的Tie2隔离检验,并通过绑定Tie2受体,抑制磷酸化和下游信号分子与细胞存活率( 30.- - - - - - 32]。有趣的是,ExTek减少的数量在小鼠黑色素瘤肺转移模型( 33]。其他研究使用不同版本的Tie2细胞外域作为抑制剂取得类似的效果在不同的肿瘤模型 34- - - - - - 36]。

在我们的研究中,虽然LDM CTX对肿瘤血管密度的影响更深远的TekdeltaFc治疗相比,这些差异并不显著。LDM CTX可能有一个间接影响肿瘤的生长通过显著降低循环内皮细胞从骨髓动员,正如前面报道( 37]。有趣的是,与这些抗血管新生药物治疗肿瘤没有增加缺氧/肿瘤组织的坏死。这可以解释为我们的一些以前的工作表明,WM239细胞可以开发减少血管依赖性,因此增强生存即使他们的血管密度降低( 38)或血管密度减少的事实实际上代表了一个“正常化”的血管床,伴随着提高灌注( 39]。这样的机制是一致的这一事实LDM-CTX-treated肿瘤最低数量的坏死组织相比,控制或联合治疗组。

我们也观察到,TekdeltaFc仅在肌间线蛋白/ PDGFR -引起显著增加 β双阳性的血管外膜细胞覆盖控制相比,LDM CTX,或联合疗法。抗血管新生疗法已被证明改善化疗反应的诱导成熟通过增加血管外膜细胞覆盖率( 27, 40]。有相当大的变化,外膜细胞肿瘤类型之间的特点,与一些研究报道,成熟PDGFR——周围的周 β消极和肌间线蛋白阳性 40),而其他的研究报告,周皮细胞肿瘤人群可以有重叠的标记( 41]。有趣的是,PDGFR - β艾滋病/ desmin-negative细胞更容易被分离从邻近的血管 41]。在异常的肿瘤血管,VEGF诱导的内皮细胞表达Ang-2微脉管系统( 42, 43]。通过绑定Tie2, Ang-2成为自分泌内皮细胞功能的监管机构;无论是作为受体激动剂( 42, 44)或拮抗剂( 45)是依赖于上下文( 46]。现在知道体外Ang-2抑制Ang-1的稳定效果,但弱激活Tie2如果Ang-1不在 47]。在我们的肿瘤模型中,TekdeltaFc可能造成大量表达Ang-2隔绝,从而允许Ang-1绑定,使磷酸化Tie2,因此观察到的周皮细胞覆盖率的增加。船“正常化”与改进的细胞毒性化疗反应( 21, 48),因此采用CTX最大耐受剂量,而不是一个节拍器的剂量可能会更有效。

TekdeltaFc和LDM CTX单独引起显著减少肿瘤体积在更早的时间点,但他们未能这样做后两周的治疗。这可能是由于这样的事实:最先进的恶性肿瘤产生多个血管生成因素,因此只针对组(TekdeltaFc治疗肿瘤)或只有VEGF (LDM-CTX-treated肿瘤)可能不是足够完整的肿瘤控制( 8, 28, 49, 50]。肿瘤也可能产生抗药性TekdeltaFc或LDM CTX,允许他们再生后最初的抑制。有趣的是,肿瘤异种移植接受TekdeltaFc和LDM CTX联合治疗增长以同样的速度控制,表明这两个治疗之间潜在的干扰。这与结果对Ang2中和抗体,有很强的抗肿瘤效应在异种移植模型中,尤其是当结合VEGF-targeted疗法( 21]。从我们的研究差异可能是由于这一事实,不像anti-Ang2抗体,TekdeltaFc影响Ang1和Ang2信号。差异也可能是由于癌症类型,如黑色素瘤并没有评估anti-Ang2抗体的研究。因此,尽管抗血管新生疗法的组合较为普遍的做法是( 2, 22, 50, 51),我们的研究提供证据表明相互作用可能依赖于复杂和肿瘤类型。

令人惊讶的是,治疗肿瘤在我们的研究中包含人类VEGF水平明显高于控制肿瘤,并结合治疗肿瘤含有量最高,符合proangiogenic环境中观察到的审判。耐抗血管新生疗法的模式之一,通常发生在一个瞬态响应阶段,upregulation替代proangiogenic通路在肿瘤,如纤维母细胞生长因子1和2,ephrin A1,或和1。这些可能弥补抑制通路,使肿瘤再生( 52]。在这样的一个研究中,患者VEGFR抑制剂cediranib FGF2的增加表达他们的复发阶段成功但瞬态响应(后 53]。它也被证明在临床试验中,酪氨酸激酶抑制剂可以暂时性的增加proangiogenic因素的水平,比如VEGF ( 54),我们观察到在我们现在的学习。事实上,增加proangiogenic因子VEGF的抗血管新生Tie2抑制剂可能占缺少观察治疗肿瘤血管密度减少。总的来说,这些数据支持的想法,两种不同的抗血管新生疗法可能稳定微脉管系统交互,从而防止船舶回归和肿瘤抑制,这一结果表明,谨慎应采取反血管增生等设计组合。

 确认

这些研究是从加拿大癌症协会资助的研究所和加拿大卫生研究院的研究。作者感谢安进提供TekdeltaFc这些研究。也由于过去和现在实验室的成员,特别是卡罗丽娜Skowronski和麦肯齐·史密斯的援助组织收集、和动物卫生技术人员在圭尔夫大学动物中心设施,尤其是杰基Rombeek,对他们的帮助。

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