宫颈癌细胞对顺铂通过染料木素的致敏：NF的作用B和Akt/mTOR信号通路

摘要

宫颈癌是女性癌症死亡的主要原因之一。以顺铂为基础的化疗已被证明可提高生存率；然而，顺铂治疗与对健康细胞的毒性有关。染料木素已被用作化疗的辅助手段，以增强化疗剂的活性，而不会增加毒性y、 本研究旨在研究染料木素（25 μ.M) on antitumor activity of cisplatin (250 nM) on HeLa cervical cancer cells. We have examined the alterations in expression of NF-B，P-MTOR，P-P70S6K1，P-4E-BP1和P-AKT蛋白水平响应于治疗。25的组合 μ.M genistein with 250 nM cisplatin resulted in significantly greater growth inhibition (）.染料木素增强顺铂的抗肿瘤活性，降低NF-的表达B, p-mTOR, p-p70S6K1, p-4E-BP1, p-Akt。本研究结果表明染料木素可以通过抑制NF-来增强顺铂的活性κ..B和Akt/mTOR通路。染料木素是一种很有前途的无毒营养剂，当与顺铂同时给予时，可以提高宫颈癌患者的治疗效果。染料木素和顺铂联合应用的临床试验证实了这一假设。

1.介绍

截至2008年，子宫颈癌是第三大最常见的癌症病因，也是妇女因癌症而死亡的第四大病因。全球新增子宫颈癌病例超过50万例，死亡人数达275,000人[1]。虽然高发病率令人失望，但这些患者的生存率继续改善，随着最近的发展，在这种特定的癌症类型的治疗[1那2]随着研究化疗药物作为伴随治疗方法应用的研究数量的增加，包括顺铂在内的放化疗正在成为推荐的方法，而不仅仅是放疗[2]。

顺铂（cis-diamminedichloroplatinii，CDDP）是治疗宫颈癌的有效药物[3.]然而，其使用受到其毒性和整个治疗过程中获得性耐药的限制[4.-6.]为此，正在开发能够区分肿瘤细胞和健康细胞的靶向疗法。一种天然存在的大豆异黄酮染料木素可以抑制肿瘤生长并诱导肿瘤细胞凋亡，而不会损害正常细胞[7.-9.]。

Genistein（4'，5,7-Trihydroxyisoflavone）具有与雌激素类似的杂环苯酚结构，但它具有更有效的生物活性[10.那11.]金雀异黄素能抑制酪氨酸激酶，抑制癌细胞增殖体内和体外而不引起毒性对健康细胞[12.]。研究表明染料木素还可以调节癌细胞的几种信号通路，促进癌细胞死亡。核因子- κ B (NF-κ..B） 染料木素对Akt通路的抑制作用已在各种癌症类型中得到证实[13.-16.]。NF -κ..b不仅控制参与生存和增殖的基因的表达，还在细胞凋亡中发挥关键作用[17.].此外，NF-κ..肿瘤细胞中的B抑制可能导致拓扑异构酶II抑制剂活性增加，因此，这种抑制可用于抗癌治疗[18.]。

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/ Akt途径是在肿瘤发生中的重要生长因子诱导的途径和恶性转化[之一19.那20.]。Akt途径激活许多负责两个细胞存活和凋亡的下游信号传导途径21.]。雷帕霉素（mTOR的）的哺乳动物靶标是下游丝氨酸之一/苏氨酸PI3K的激酶/ Akt途径和调节细胞生长和存活，因此，它被认为是一个有效的目标为抗癌治疗[22.]mTOR可以直接被Akt磷酸化激活，也可以通过抑制结节性硬化综合征1和2（TSC1/2）和激活富含脑的Ras同源物（Rheb）间接被Akt激活[23.]。mTOR以TORC1和TORC2复合物存在。在TORC1复合物中，它通过真核翻译起始因子(eIF4E)结合蛋白(4EBP1)和核糖体p70S6激酶(p70S6K)启动翻译。当mTOR蛋白磷酸化4E-BP1时，它与eIF4E分离。一旦eIF4E从4e-BP1中释放出来，它就可以与其他几种蛋白质形成复杂的结构，包括eIF4G或eIF4F。当mTOR磷酸化p70S6K时，该激酶反过来磷酸化S6核糖体蛋白[24.那25.]。S6激酶可催化胰岛素受体底物(IRS)蛋白的磷酸化和抑制;那么IRS蛋白就不能再激活PI3K通路这就导致了对Akt的间接抑制作用[26.那27.]。MTOR还可以通过可能的阳性反馈机制磷酸化AKT [28.]。

在这项研究中，我们假设顺铂与金雀异黄素联合应用可以增强宫颈癌生长抑制体外通过mTOR信号通路的下调。为了测试我们的假设，我们评估染料木黄酮和顺铂对HeLa人宫颈癌细胞系细胞生长和凋亡相关基因表达的影响。

2.材料和方法

2.1。细胞培养和试剂

人宫颈癌细胞系HeLa细胞(American Type Culture Collection, Manassas, VA)保存在含有10%热灭活胎牛血清、1% l -谷氨酰胺、100 U/mL青霉素G和100μ.g/mL链霉素。细胞在5%的湿化CO中培养₂气氛中在37℃。没有生长因子加入到随时细胞培养基。Genistein (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) was dissolved in 0.1 M Na₂一氧化碳_3.做一个10毫米原液。Cisplatin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) was dissolved in phosphate buffered saline (PBS) to make a 0.5 mM stock solution.

2.2。细胞活力测定

通过MTS分析测定细胞活力。将3000个细胞接种在96孔板中，并培养过夜。细胞（2-5×10^4.）用染料木黄酮处理（25 μ.M), cisplatin (250 nM), and their combination treatment for 24 hours. After 24 hours of total treatment, the cells were incubated at 37°C with 1 mg/mL MTT reagent (Sigma, St. Louis, MO) for 2 hours. The formazan crystals were dissolved in isopropanol. Spectrophotometric absorbance of the samples was determined by the ULTRA Multifunctional Microplate Reader (ELx800-BIO-TEK) at 490 nm.

2.3.蛋白质印迹分析

Hela细胞用Genistein治疗（25 μ.M） ，顺铂（250 nM），联合治疗24小时。从这些样品中提取总蛋白。这些总蛋白通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶溶解，然后转移到硝化纤维素膜上。用5%脱脂奶粉封闭后，用抗NF蛋白孵育膜-κ..B p65，抗mtor，抗70s6k1，抗4e - bp1，抗akt (Abcam, Cambridge, UK)。一抗在含0.05% Tween-20的缓冲液中稀释(1:10 00)。硝化纤维素膜与蛋白抗体在4°C孵育过夜。将印迹用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG (Abcam, Cambridge, UK)洗涤并孵育。特异性结合用二氨基联苯胺和H₂O₂作为底物。使用抗肿瘤的单克隆小鼠抗体控制蛋白质负载β-Actin抗体（A5316; sigma）。斑点至少进行三次以确认数据再现性。使用图像分析系统（Image J; National Health，Behesda，USA）进行密度分析带状的频带。

２.４.统计分析

为了确定宫颈癌细胞系实验组之间的细胞活力差异，重复实验至少三次，SPSS用于统计分析。对待治疗结果的比较被配对测试统计差异T以及。假设在aP的<0.05的值。

3.结果

3.1.染料木素增强顺铂对HeLa细胞增殖的抑制作用

通过MTS试验评估染料木素、顺铂及其组合对HeLa细胞增殖的影响。在MTS试验中，用四唑化合物MTS（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化）处理细胞.由于代谢活性细胞可将MTS还原为不溶性紫色福尔马赞染料产品，因此测量了与对照组相比的各处理组的相对细胞活力[29.]。来自该测定的数据表明，结核剂和顺铂的组合治疗可增强HeLa细胞中细胞生长的抑制。

The rationale for choosing 250 nM cisplatin and 25 μ.中号金雀异黄素从我们之前的看法，即揭示了细胞生长的人类癌细胞的显着抑制[来到7.]。用顺铂和Genistein单独处理HeLa细胞，两者组合处理24小时。与对照相比，组合处理抑制HeLa细胞的增殖，而不是单独治疗明显更高的延伸。组合治疗后的活细胞百分比降至约30％，而单独单独的Genistein治疗和单独的顺铂治疗的活细胞的百分比分别为约50％和〜70％（图1)这些结果表明，与单独使用任何一种药物相比，染料木素与顺铂联合使用在HeLa细胞中引起更大的生长抑制。由于我们发现染料木素可以增强对癌细胞生长的抑制，因此我们接下来测试了可能参与肿瘤生长机制的可能靶蛋白的表达染料木素和顺铂。

3.2.染料木素防止顺铂诱导的NF上调-κ..HeLa细胞中的B

NF -κ..B是一种转录因子，通过对存活基因发挥调节作用，在细胞凋亡机制中发挥重要作用。NF-的表达水平κ..B在蛋白水平进行评估。通过Western Blot检测NF-表达水平κ..b p65b，nf-的亚基 -κ..乙转录复合物，在金雀独自一人，独自顺铂，和染料木黄酮加顺铂处理HeLa细胞。顺铂单独增加NF-的表达水平κ..与对照组相比，Bp65B高达150%，而金雀异黄素将该亚单位下调至约75%。当金雀异黄素加入顺铂治疗时，NF-κ..乙p65B蛋白减少到〜80％。这些结果表明，染料木素可下调NF-κB的表达水平提高κ..顺铂在HeLa细胞中诱导的B（图2（a））.

3．3.染料木素抑制顺铂诱导的HeLa细胞mTOR通路的激活

为了评估mTOR分子途径在顺铂和金雀异黄素抗增殖作用中的作用，我们评估了经金雀异黄素和/或顺铂处理的HeLa细胞中p-mTOR、p-p70S6K1、p-4E-BP1和p-Akt的表达水平。染料木素降低顺铂诱导的HeLa细胞中磷酸化mTOR、p70S6K1、4e-BP1和Akt的水平（图2（b）那2（c）那2（d）， 和2 (e)）.mTOR的已知通过两条途径调节翻译起始：S6K和4E-BP1。作为mTOR的表达下降将导致这两种分子的表达降低，这一假说是由我们的数据支持。

4。讨论

需要制定更有效的治疗策略，以提高现有疗法的疗效，同时不损害正常细胞。顺铂是治疗宫颈癌最有效的抗癌药物之一；但是，它与严重毒性和治疗后获得性耐药性有关。严重的肾损害，神经、胃肠道副作用和获得性耐药是顺铂治疗失败的主要原因。为了克服顺铂治疗的局限性，建议结合使用天然化合物的靶向治疗[30-32]。已经使用了许多具有已知抗癌活性的天然化合物，包括苏尔氟氯甲烷[33那34]和染料木素[35]。在这些前人研究的光中，我们选择了染料木素作为一种无毒的营养剂，以增加在HeLa细胞中顺铂治疗的疗效。

在这项研究中，我们观察了金雀异黄素联合顺铂在抑制HeLa宫颈癌细胞生长方面优于单用顺铂体外. 金雀异黄素对顺铂抗癌活性的影响此前已有关于卵巢癌的报道[36]及胰腺癌[35].我们研究了染料木素和顺铂对HeLa细胞的治疗效果，发现与单独使用这两种药物相比，染料木素和顺铂联合使用对HeLa细胞生长的抑制作用具有统计学意义。染料木素增强了顺铂对HeLa细胞的生长抑制作用，从而避免了使用o进一步增加顺铂的浓度。本研究首次证实了染料木素介导的顺铂对宫颈癌细胞的增效作用。

mTOR信号途径的激活是在宫颈癌细胞的细胞存活[相关37]我们发现顺铂治疗后mTOR表达增加，这可以通过添加金雀异黄素来预防，这是本研究首次显示的机制。顺铂和金雀异黄素联合治疗宫颈癌可能是一种有希望的策略。mTOR活性可以通过S6K，4E-PB1蛋白的磷酸化来监测ins[38];我们还观察到这些蛋白质与顺铂治疗的表达增加，这些蛋白质可以被核酸素消除。当在HeLa细胞用单独的顺铂治疗，磷酸化mTOR的，p70S6K1和4E-BP1的表达水平增加至分别140％，170％和150％。然而，Genistein的添加将这些顺铂诱导的蛋白质下调70％。这些结果表明，顺铂上调MTOR途径，Genistein通过下调磷酸化的P70S6K1和4E-BP1蛋白来阻止这种上调。我们还观察到该活性与磷酸化AKT的下调有关，这表明MTOR途径表达的降低可能通过AKT介导或降低该途径负调节和灭活AKT。

在本研究中，我们还研究了染料木素和顺铂对NF的影响-κ..B，这是已知在顺铂处理中被上调[36]。与之前的观察相似，染料木素降低了顺铂诱导的NF-的表达κ..这些结果提示了一种涉及两种NF的分子机制-κ..由顺铂诱导的B和MTOR途径，并受到基因因抑制的。

5.结论

总之，genistein通过调节NF在HeLa细胞中增强顺铂治疗-κ..B、 Akt和mTOR通路对细胞存活和凋亡至关重要。我们的研究结果表明，顺铂和金雀异黄素联合应用可改善宫颈癌的治疗效果。在宫颈癌的治疗中，尤其是在对顺铂耐药的情况下，这种联合疗法毒性较小。未来的临床试验有必要研究顺铂和金雀异黄素联合治疗宫颈癌的疗效。

利益冲突

作者声明无利益冲突。

致谢

O.Kucuk是佐治亚州癌症联盟杰出癌症学者。

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