人卵巢癌上皮细胞中发芽蛋白1和发芽蛋白2差异表达的初步报道

摘要

Sprouty（Spry）蛋白是受体酪氨酸激酶信号通路的调节剂，已被证明在包括癌症在内的多种病理条件下解除调控。在本研究中，我们研究了体外培养的一组人卵巢癌细胞系中Spry1和Spry2亚型的表达。我们的westernblot分析显示，癌细胞中Spry的表达模式不均匀，没有一个与作为对照的正常卵巢上皮细胞中观察到的模式一致。在所研究的七种癌细胞系中，与对照组相比，Spry1在四种细胞系中表达较低，在一种细胞系中表达较高。至于Spry2，四个细胞系表现出较低的表达，两个表现出较高的表达。RT-PCR检测结果表明，Spry蛋白水平不一定与其mRNA水平的表达一致。我们的免疫染色研究表明，Spry2主要分布在囊泡结构的整个细胞质中，而Spry1则同时存在于细胞质和细胞核中。这可能为进一步研究Spry的行为和/或功能模式提供线索。总之，我们的研究揭示了Spry1和Spry2蛋白在各种卵巢癌细胞系中的差异表达。

1.介绍

各种受体酪氨酸激酶(RTKs)的异常活性在恶性肿瘤的发病机制中起着重要作用。Spry蛋白是一类主要的rtk依赖信号通路的配体诱导抑制剂。dSpry (黑腹果蝇Spry）最初由Hacohen等人于1998年定义为成纤维细胞生长因子（FGF）介导的气管分支的抑制剂d .腹开发(1］.他们还在表达序列标签(EST)数据库中发现了3个dSpry的人类同源物，命名为Spry1-3。第四种哺乳动物同源物后来在老鼠中发现[2]和人类[3.］.Spry蛋白，特别是Spry1、Spry2和Spry4亚型，可能在控制生长信号中发挥重要作用，但在包括癌症在内的一些病理条件下明显不受调控。几项研究报告了Spry在包括乳腺在内的多种肿瘤中的上调或下调[4)、前列腺癌(5- - - - - -7]，肝细胞[8，9]，冒号[10]，以及肺癌[11，12，以及黑素瘤[13，14和胃肠道间质瘤[15，表明Spry可能是一种肿瘤抑制因子，可能被用作肿瘤标志物和药物干预的有趣靶点。在此基础上，我们打算研究Spry在卵巢癌中的作用，卵巢癌是女性的第七大癌症，也是全球第二大妇科恶性肿瘤死亡原因[16］.

作为初步尝试，我们在本研究中旨在评估Spry1和Spry2亚型在一组人类上皮性卵巢癌细胞系中的表达模式。由于预计在这种病理条件下Spry的表达会发生改变，原代人类卵巢上皮细胞也被用作对照组，其表达可以比较癌细胞中的sion模式。

2.材料和方法

2．1．细胞培养

人卵巢癌细胞系OVCAR-3、SKOV-3和1A9取自美国型培养收集(ATCC) (Manassas, VA, USA)。其他人类卵巢癌细胞CAOV-3, A2780, OV-90和IGROV-1是Yong Lee博士(澳大利亚新南威尔士大学圣乔治医院放射科)的礼物。人卵巢表面上皮细胞系HOSEpiC来源于SienCell (SienCell, CA, USA)。所有细胞系保持在5%的湿度中孵化器在37°C在各自媒介如下:OVCAR-3, SKOV-3, 1 a9, A2780,和IGROV-1 rpmi - 1640细胞(表达载体、钙、美国),CAOV-3在DMEM(表达载体、钙、美国),ov - 90细胞1:1的混合物MCDB 105 /媒介199 (Sigma-Aldrich,密苏里州,美国),和HOSEpiC OEpiCM (SienCell、钙、美国)。培养基中均添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合物(Invitrogen, CA, USA)。

2．2．免疫细胞化学

将OVCAR-3、SKOV-3和HOSEpiC细胞以2.5 × 10的初始密度接种于6孔组织培养板上的无菌玻璃覆盖层上⁵在含10%胎牛血清的RPMI培养基中，37°C，湿度为5%的气氛。在50%的汇合条件下，细胞在0.1%叠氮化钠加0.5%甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS) (Sigma-Aldrich, Missouri, USA)中室温固定1小时。然后用70%乙醇/PBS在4°C下孵育1小时，进行渗透和进一步固定。为了阻断抗体的非特异性结合，将盖玻片置于1%牛血清白蛋白(BSA)和PBS中室温浸泡1小时。然后用抗spry1和抗spry2的单克隆抗体(1:20 in 1% BSA/1x PBS)在4°C孵育细胞(台湾Abnova)，阴性对照样品不应用一抗。随后使用Alexa Flour 488鸡抗小鼠IgG (1:50 0 in 1% BSA/1x PBS) (Invitrogen公司，美国)在4°C黑暗中孵育1小时。然后用碘化丙啶(1:50 0)反染色3分钟，盖上明胶甘油，4℃黑暗保存。每一步之后用PBS冲洗。用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus, USA)和X60油浸透镜观察细胞。使用FluoView软件(4.3版，Center Valley, PA)覆盖图像。

2．3.西方墨点法

细胞在含有10%蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich，密苏里州，美国)的蛋白溶解缓冲液(RIPA缓冲液)中均质，并用BioRad蛋白测定法(Bio-Rad, CA，美国)测定蛋白浓度。然后，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白，转移到PVDF膜上(Millipore Corporation, MA, USA)，在4℃下用1:10 00稀释的抗spry1或抗spry2小鼠单克隆抗体(Abnova，台湾)孵育过夜。洗涤膜，用与辣根过氧化物酶结合的山羊抗小鼠二抗(1:5000稀释;Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)室温下1小时。用1:20 000稀释的抗GAPDH小鼠单克隆抗体(Sigma-Aldrich, Missouri, USA)对GAPDH蛋白进行了类似的处理。使用ImageQuant LAS 4000生物分子成像仪和ImageQuant软件(GE Healthcare, UK)，对抗原-抗体反应进行数字化，定量谱带密度测定，数据与GAPDH蛋白表达值进行归一化处理。定量分析蛋白表达是通过将来自癌症细胞株的数据与来自HOSEpiC细胞的数据进行归一化作为正常对照，其中值以任意单位表达，作为每个细胞株的蛋白表达与HOSEpiC的蛋白表达的百分比。

2.4.RT-PCR

根据制造商的说明书，使用RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN，德国)在无rnase环境中从7个卵巢癌细胞系以及初级人卵巢表面上皮细胞系HOSEpiC中分离总RNA。来自RNA制备的可能污染的DNA被无DNA DNA酶处理和去除试剂(Ambion, Life Technologies, USA)消化。提取的RNA产量和纯度被决定通过测量吸光度在230年,260年和280年使用NanoDrop nm 2000分光光度计(热费希尔科学、马、美国)其次是RNA完整性的评价通过凝胶电泳测定28 s / 18 s核糖体RNA (rRNA)比例。根据制造商的协议，使用SuperScript III单步RT-PCR系统与铂质Taq DNA聚合酶(Invitrogen, CA, USA)在Veriti 96-Well热循环器(Applied Biosystems, CA, USA)中进行逆转录，并添加RNAse抑制剂(QIAGEN，德国)。PCR扩增进行如下:30分钟孵化56°C的互补脱氧核糖核酸的合成,一个3分钟的热从94°C其次是35周期在94°C的变性30秒,在56°C退火30秒,在72°C和扩展了30秒,最终在72°C扩展了5分钟。Spry1和Spry2的转录本扩增采用以下基于已公布序列的寡核苷酸引物[17来交叉外显子/内含子区域:5(向前)和“-CTGCAGGGGAAGTGCAAGTGTGGAGAA-3”Spry1为5 ' - aagcttagttcaggaggtacaaccac -3 '(反向)5(向前)和“-GGATCCCATTCGCTCATCTGCCAGGAA-3”Spry2的5′-AAGCTTTGCTGGGTGAGGCGTCTG-3′（反向）。

基因的寡核苷酸引物β-肌动蛋白5′-ATATCGCGCTCGTCGTC-3′（正向）和5′-AGTGGTACGGCCAGAGGCGT-3′（反向）由NCBI引物BLAST设计(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)并在相同放大条件下用作参考。负RT控制(−RT）和无模板对照（NTC）也包括在实验中，以分别验证RNA制剂中基因组DNA的缺失和试剂盒组件可能受到的污染。10 μ在含有1.5%琼脂糖凝胶的1.5%琼脂糖凝胶上分离1份PCR产物 : 在80℃下电泳10000倍稀释10000×SYBR安全DNA凝胶染色剂（美国加利福尼亚州Invitrogen） 然后使用Bio-Rad Gel Doc紫外线透射器2000（美国加利福尼亚州Bio-Rad）进行观察。

2．5．人类样本和免疫组化

在适当的机构伦理委员会(澳大利亚新南威尔士州东南悉尼地方卫生区人类研究伦理委员会)批准后，并按照相关指南，获得临床诊断为原发性上皮性卵巢癌患者的石蜡包埋的肿瘤组织切片，并进行免疫组化染色。简而言之，脱蜡后切片进行预处理并进行抗原回收。根据制造商的方案，使用抗spry1或抗spry2单克隆抗体(Abnova，台湾)在4°C下进行一抗孵育过夜。然后用二抗(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)孵育，并用苏木精进行反染色。采用制造商推荐的阳性对照。每个样品还制备了阴性对照，不应用一抗。然后用徕卡DMLB显微镜(放大率×40)观察染色玻片，并使用徕卡DC200数字成像系统(徕卡Microsystems, Wetzlar, Germany)拍照。

2.6。统计分析

所提供的所有数据都代表了三个独立的实验。使用GraphPad InStat (GraphPad Prism 5, San Diego, California, USA)进行统计分析。学生的对未配对的样品进行检验被认为是重要的。

3.结果

3．1.卵巢癌上皮细胞表达不同水平的Spry1和Spry2蛋白

通过使用Spry1和Spry2特异性抗体进行免疫印迹分析，初步研究了七种常用的人类上皮性卵巢癌细胞系中Spry1和Spry2蛋白的表达。上皮性卵巢癌细胞表现出不同水平的Spry表达（图1(一)）.OVCAR-3细胞中Spry1亚型表达量高，1A9和A2780细胞中表达量高，IGROV-1细胞中Spry1表达量低，SKOV-3、CAOV-3和OV-90细胞几乎不表达。对于Spry2, OVCAR-3和1A9表达量高，A2780和IGROV-1表达量中，CAOV-3和OV-90细胞表达量低，SKOV-3表达量几乎为零。在这两种亚型中，OVCAR-3和SKOV-3细胞的表达水平分别最高和最低。综上所述，我们的观察发现Spry1和Spry2在7个癌细胞系中的表达模式不一致，表达水平从几乎为零到高。

3.2.与正常卵巢上皮细胞相比，癌细胞系中Spry1和Spry2蛋白的表达发生改变

为了研究卵巢癌中人类Spry1和Spry2蛋白表达的任何可能改变，还对从原代人类卵巢细胞获得的蛋白裂解物进行了蛋白质印迹（图1）1(一))，并使用ImageQuant软件进行蛋白表达定量比较(图1 (b)- - - - - -1 (c)）.我们的结果表明，Spry1和Spry2在正常细胞中中度表达。当将Spry1和Spry2在癌细胞系中的不一致表达模式单独与此模式进行比较时，发现不一致。而Spry1和Spry2在OVCAR-3中的表达显著升高(值分别为0.0012和0.0004)，SKOV-3、CAOV-3和OV-90表达的Spry1 (-分别为0.0002、0.0015和0.0002和Spry2的值(-值分别小于0.0001、0.0146和0.0003，其中SKOV-3表示最小值。尽管Spry1的A2780表达模式与对照组相似，但该细胞系表达的Spry2水平显著高于对照组(值:0.0032)。IGROV-1细胞表达Spry1显著降低(-值:0.0002)比对照组多。Spry2的IGROV-1表达下降，但没有显著性差异(值:0.1074)。1A9显示Spry1水平相近，Spry2水平略高(-value: 0.1657)与控件相比。在癌症细胞系中，OVCAR-3和SKOV-3分别表达最高和最低水平的两种亚型。

综上所述，虽然Spry1和Spry2在作为对照的正常卵巢细胞中均适度表达，但在所有研究的癌细胞中发现Spry1和/或Spry2的表达改变。Spry1在四个细胞系中表达较低，在一个细胞系中表达较高。至于Spry2，四个细胞系的表达较低，两个细胞系的表达较高表达，尽管Spry2的1A9表达增加不显著。

3.3.Spry1和Spry2 mRNA在上皮性卵巢癌细胞中存在差异

为了评估Spry在mRNA水平上的表达及其在蛋白水平上可能的对应关系，我们对来自正常和癌症细胞系的总RNA样本进行了逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析。预期的产品尺寸Spry1和Spry2分别是438个碱基和471个碱基。如图所示2，癌细胞表现出不同程度的Spry1．在CAOV-3细胞中几乎检测不到，Spry1由其他细胞表达，更明显的是由1A9表达，表明Spry1在体外人卵巢癌上皮细胞中有差异表达。Spry2在所有细胞系中都很容易识别，癌细胞以更显著的方式表达它。

3．4．Spry1和Spry2在OVCAR-3、SKOV-3和HOSEpiC细胞中的免疫细胞化学定位

为了确定Spry1和Spry2蛋白在人类上皮性卵巢癌中的亚细胞分布，我们使用Spry1和Spry2特异性抗体对卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3以及人类卵巢表面上皮细胞系HOSEpiC进行了共聚焦免疫荧光显微镜检查根据以下事实进行选择，即它们代表了研究细胞系中Spry1和Spry2表达最高和最低的细胞，并且这两种细胞最初都来源于卵巢浆液性腺癌，这是上皮性卵巢癌最常见的亚型[18，19］.与HOSEpiC和SKOV-3细胞相比，在OVCAR-3细胞中Spry1和Spry2蛋白的染色强度更强。此外，Spry1在泡状结构的细胞质和细胞核中均有发现，而Spry2主要表现为细胞质定位(图)3.）.

3．5．Spry1和Spry2在上皮性卵巢癌患者肿瘤样本中的免疫组化定位证实了体外免疫细胞化学观察到的蛋白亚细胞分布模式

使用Spry1和Spry2特异性抗体，对来自不同患者的随机石蜡包埋切片进行免疫组织化学染色。如图所示4，我们观察到的分布模式与之前我们的免疫细胞化学研究发现的相似，确认了Spry1的细胞质和细胞核定位以及Spry2的细胞质分布。

4.讨论

基于之前关于Spry蛋白家族在包括人类恶性肿瘤在内的生理和病理条件中的作用的报道，我们预计与正常卵巢上皮细胞相比，该蛋白家族的一个或多个成员在上皮性卵巢癌细胞系中的表达将发生改变。通过检测Spry 1和Spry2在正常细胞中的表达，我们的研究表明，正常人卵巢表面上皮细胞在体外表达这两种亚型。Haimov-Kochman等人早期报道了Spry2 mRNA和蛋白在正常人卵巢颗粒叶黄素细胞(GLC)中的表达[20.］.这些发现可能暗示了Spry在卵巢生理方面的作用。我们的结果也表明Spry1和/或Spry2在研究的卵巢癌细胞系中存在差异表达。至少在一定程度上，这些结果与之前对其他恶性肿瘤的研究结果是一致的。使用免疫组化分析和组织微阵列，Kwabi-Addo等人一致显示，与匹配的正常前列腺相比，约40%的前列腺癌患者中Spry1蛋白下调[21］.Fong等人还观察到，与正常或肝硬化肝细胞相比，人肝癌(HCC)恶性肝细胞中Spry2蛋白的表达持续下降[8］.在Song等人的另一项研究中也证实了Spry2在HCC中的表达下调[22］.Sutterluty等报道了与正常肺上皮相比，Spry2蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)组织和细胞系中的表达持续下降[11］.Spry2蛋白在人b细胞弥漫淋巴瘤衍生的HT细胞系中表达减少[23]Barbáchano等人在低级别但非高级别的结直肠肿瘤中显示出低水平的Spry2[24]在Feng等人的另一项研究中，与II期结肠癌患者相比，III期或IV期结肠癌患者中观察到的Spry2表达降低更多，这表明结肠癌中Spry2表达下调可能与肿瘤侵袭和转移有关[10］.Velasco等人报道了在19.85%的子宫内膜癌中spry2的表达减少，并观察到spry2与细胞增殖之间强烈的负相关。考虑到与低级别肿瘤相比，Spry2在高级别肿瘤中的表达降低，他们认为Spry2可能作为“肿瘤进展”抑制基因[25]。在本研究中，Spry表达的改变模式在所研究的所有卵巢癌细胞系中并不相似，这并不奇怪。这些细胞系是多种上皮性卵巢癌亚型的常用体外代表，这些亚型最初来源于个体患者不同的临床病理特征。此外，所有上皮性恶性肿瘤都有各种遗传和表观遗传改变，一般来说，只有一小部分特定肿瘤类型的病例有特异性改变[21］.应该注意在当下研究的表达Spry1和Spry2亚型OVCAR-3细胞显著高于在其他癌症细胞系和对照组,这意味着尽管Spry1表达降低和/或更频繁地观察Spry2在卵巢癌细胞系研究,并非所有上皮性卵巢癌都需要Spry表达下降。

一些研究表明，一些Spry基因在乳腺中的表达减少[4)、前列腺癌(5- - - - - -7]，肝癌[8，9),非小细胞肺癌(11，12，人类b细胞淋巴瘤[26]，以及结肠癌[10］.然而，有报道称，在携带B-Raf V599E突变的黑色素瘤细胞中，Spry上调[13，14，人类患者来源的纤维肉瘤细胞系[27和胃肠道间质瘤(GIST) [15］.Schaner等人通过聚类分析研究浆液性卵巢癌组织的基因表达模式[28］.Spry同源基因1和2是与其他一些特定基因共表达的基因。与western blot分析相比，我们在mRNA水平上评价Spry的存在，表明Spry mRNA水平不一定对应于蛋白表达水平。这可能与Spry蛋白家族在不同水平上的调控有关。这不仅包括转录和翻译调控，还包括由蛋白质差异定位和/或蛋白质水平通过与其他蛋白质和介质相互作用而产生的翻译后修饰[29，30.]同时，Spry在蛋白质或mRNA水平的表达似乎也依赖于癌细胞类型。换句话说，Spry表达的改变并不局限于其下调，因为在某些类型的癌症中也有Spry表达增加的报道。这一情景可由两组不同的研究得出结论。第一组表明该蛋白家族的一些成员，特别是Spry2，可能具有抑制肿瘤的潜力。这是基于在不同癌症中显示Spry下调的观察结果（如前所述），以及表明Spry家族对Spry过度表达癌细胞中ERK信号通路的抑制作用的研究[8，12，21，31］.另一方面，第二组表明Spry可能是显示Spry下调的癌症良好临床预后的指标[32，33]，令人惊讶的是，它是Spry上调的其他癌症临床预后不良的标志[34］.这个小组正在阐明Spry蛋白作为肿瘤标志物的未来应用的可能性。Spry功能的这两个方面似乎都需要进一步的深入研究。

蛋白质的定位可以为其作用模式和/或功能提供线索[35］.在本研究中，我们观察了Spry1的细胞质和核定位，而Spry2仅在体外进行了细胞质定位。我们对卵巢癌患者肿瘤样本的免疫组化分析进一步证实了这一点。我们关于Spry2定位的研究结果与Hausott等人的研究结果一致[36]和Velasco等人[25在NIH3T3成纤维细胞和人子宫内膜癌样本中分别显示Spry2的细胞质染色，而不是细胞核染色。然而，Hausott等发现Spry2在DRG神经元和C6胶质母细胞瘤细胞中的胞质和核定位[36］.到目前为止，已经报道了该蛋白家族驻留的各种细胞位点[35，37而Spry本地化模式中出现这些差异的原因还有待研究。

5.结论

在本研究中，我们首次探讨了Spry蛋白在人上皮性卵巢癌中表达的一些方面。我们的研究揭示了Spry1和Spry2蛋白在一系列人类上皮性卵巢癌细胞系中的差异表达。我们的研究结果显示Spry mRNA和Spry蛋白的表达缺乏一致性，这有利于Spry调控发生在不同的点。此外，我们的结果显示Spry1和Spry2亚型之间的亚细胞定位差异可能在卵巢癌中具有重要的功能意义。目前的报告，连同其他癌症的类似研究，表明Spry蛋白家族的表达模式是细胞类型依赖的。Spry表达的改变对肿瘤细胞生物学的影响值得进一步研究。这可能导致新的治疗策略和可靠的卵巢癌肿瘤标志物的发展。

缩写

斯普里：	Sprouty
RT-PCR：	逆转录聚合酶链反应
RTK：	受体酪氨酸激酶
dSpry:	黑腹果蝇Sprouty
美国东部时间：	表达序列标签数据库
GLC：	Granulosa-lutein细胞
肝癌：	肝细胞癌
非小细胞肺癌:	非小细胞肺癌
要点:	胃肠道间质瘤
写明ATCC:	美式文化收藏
PBS：	磷酸盐缓冲盐水
BSA:	牛血清白蛋白。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

Leon Vonthethoff博士（解剖病理学系，新南威尔士大学圣乔治医院，悉尼，澳大利亚）感谢有帮助的讨论和技术援助与免疫组化程序。

工具书类

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