CCND2的高甲基化可能反映吸烟引起的肺癌前病变

摘要

烟草烟雾诱导DNA高甲基化是癌症发生中的早期事件，还是针对显性癌症组织的晚期事件，目前尚不清楚。使用methyllight分析，我们分析了来自151名癌症患者(121名吸烟者和30名不吸烟者)的316个肺组织样本，以检测之前在非小细胞肺癌中观察到的19个高甲基化基因。在2%的无癌受试者中，只有APC(39%)、CCND2(21%)、CDH1(7%)和RARB(4%)发生了高甲基化。吸烟者(26%)的CCND2高甲基化频率高于不吸烟者(3%)。CCND2高甲基化也与年龄和上叶样本位置的增加相关。在吸烟者(41%)和不吸烟者(30%)中，APC经常高甲基化。所有受试者中BVES、CDH13、CDKN2A (p16)、CDKN2B、DAPK1、IGFBP3、IGSF4、KCNH5、KCNH8、MGMT、OPCML、PCSK6、RASSF1、RUNX和TMS1很少发生高甲基化(<2%)。CCND2的高甲基化可能反映了吸烟引起的肺癌前病变。

1.介绍

在美国，每年死于肺癌的人数比死于乳腺癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌的人数加起来还要多，2010年估计大约有157,300人死于肺癌[1］．吸烟是导致肺癌的最重要的危险因素，其中80-90%的死亡与吸烟有关[2那3.］．

在过去的四到五十年中，已经取得了重大进展来阐明烟草吸烟的致癌机制。使用动物模型，已经表明，在香烟烟雾中超过60种成熟的致癌物质，20可能导致肺肿瘤[4.］．已经提出了这些致癌物质，当代谢形成DNA加合物，如果没有修复，可以直接导致遗传改变。当这些遗传改变影响肿瘤抑制基因或肿瘤的肿瘤内，它们可以促进细胞增殖和恶性转化[5.］．肺癌患者的研究清楚地表明，吸烟会导致P53和Ras癌基因的遗传突变[6.那7.］．此外，吸烟被认为会引起免疫抑制，这为肿瘤进展提供了一个环境[8.那9.］．

最近，除了基因突变之外，DNA高甲基化已被认为是肺癌中基因沉默的替代，表观遗传机制。认为几种环境暴露导致异常的DNA甲基化，包括膳食因素，化学治疗剂和重金属[10］．烟草烟雾暴露已与DNA甲基转移酶的表达增加有关[11-14］．与这种观察结果一致，重病中产生的肺癌显示出各种基因的高甲基化，特别是CDKN2A（P16）和RASSF1，与较轻的吸烟者或非吸烟者相比[15-27］．

然而，这些结果并不能揭示DNA高甲基化在癌变发生的早期还是晚期。癌变的早期变化(特别是与吸烟有关的变化)被假设是在肺中弥漫性地发生的，因此可以在非癌性肺组织以及发生的任何癌症中检测到[28-30.］．例如，CDKN2A、RASSF1、CDH13和其他基因的频繁高甲基化已经在非癌症吸烟者的痰样本中观察到，这表明他们可能在早期就发生了高甲基化[31-34］．相比之下，致癌发生的后期变化主要是在明显恶性组织中产生的。

我们最近分析了来自非小细胞肺癌(NSCLC)患者的癌性和非癌性肺组织。我们观察到，在测试的27个基因中，大多数DNA甲基化变化是肿瘤特异性的，因此可能被认为是癌变的晚期变化[35］．然而，在这些NSCLC患者中，少量基因，包括CCND2，APC，CDH1和RARB（表1），在一部分非癌性肺组织中也是高甲基化的，这表明这些基因中的一种或多种可能会被急性癌症化为急性癌症。我们假设DNA甲基化的早期变化（如果存在）可能与香烟烟雾暴露有关。此外，因为已知吸烟相关的肺肿瘤和肺气肿不成比例地影响肺的上叶[36那37，我们假设与吸烟相关的甲基化变化同样会在大脑的上叶比下叶更频繁。

2.材料和方法

２.１.主题注册

所有程序都按照机构审查委员会和人体实验委员会的批准进行。回顾性入组受试者为非恶性疾病(包括肺气肿、慢性支气管炎、支气管扩张、肉芽肿病、各种感染性疾病、囊性或肺纤维化)的肺手术(肺减容、肺移植、楔状活检或肺叶切除术)。于1995年7月1日至2005年7月1日在华盛顿大学医学中心(UWMC)进行了研究。所有标本经专家病理学家(CDJ)审查，以确定它们代表非癌性肺组织。所有临床资料均来自受试者的UWMC医疗记录，包括吸烟史和原发性肺部诊断。受试者被排除的原因如下:既往诊断为肺癌，肺组织甲基化分析不足，或吸烟年龄未知。共有159名受试者的372例非恶性肺组织样本进行了DNA甲基化分析。

２.２.石蜡块DNA的分离

每个街区有6个20-μ.M段经二甲苯萃取脱烃。蛋白酶K用于在48°C下过夜消化产生的组织小球。通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀分离基因组DNA。最后，根据厂家说明书使用QIAamp DNA小柱(Qiagen)进行DNA纯化。

２.３.亚硫酸氢钠转换

如前所述[42]，体外用临床样本对完全甲基化DNA(甲基化DNA对照)和人类精子DNA(未甲基化DNA对照)进行转换。简单地说,～1μ.用5 mol/L亚硫酸氢钠对DNA进行修饰，用氢氧化钠脱硫，纯化后重悬于80μ.l洗脱缓冲液（EB; 10 mmol / L Tris-HCl，pH 8.0）。

2.4。DNA甲基化（甲基曲线）测定

甲基光分析的所有引物和探针都是专为亚硫酸氢盐转化的完全甲基化DNA设计的。它们的序列以前曾有报道[35］．将亚硫酸氢盐转化-肌动蛋白(ACTB) DNA进行扩增，使输入DNA的数量归一化。甲基化分析排除ACTB阴性的样品。在372份鉴定样本中，56份(15%)因ACTB阴性而被排除。在吸烟者(15%)和非吸烟者(16%)中，亚硫酸氢盐转换后被排除的样本百分比相似。将已知浓度的亚硫酸氢盐转化ACTB基因质粒稀释后作为标准曲线进行定量。对给定的一组样本的分析只有在转化的未甲基化的人类精子DNA未被放大时才被认为有效，而转化的完全甲基化的DNA被放大。对于每个位点，甲基化参考基因百分比(PMR)的计算方法是将样本的基因/参考比率除以完全甲基化DNA对照的基因/参考比率[43］．在PMR> 0％时，基因被认为是对任何高甲基化的阳性。

2．5．统计方法

为了进行组间比较，提供独立的观察，我们随机为每个受试者选择一个组织块来代表每个受试者的高甲基化特征。为了评估基因甲基化在不同肺部位的潜在差异，使用McNemar氏试验比较来自受试者内部配对的上叶和下叶组织样本。为了评估基因甲基化与自变量(吸烟、年龄、性别、肺叶、pack年和戒烟年)之间的单变量和多变量关系，我们纳入了每个受试者的所有可用组织样本，并采用广义估计方程(GEE)。这种方法能够通过重复测量(每个受试者来自不同叶的多个组织样本)分析数据，并解释受试者内部的相关性。在选择模型时，使用了logit链接，我们假设了一个可交换的工作关联结构来解释主题内关联。将参数估计指数化以提供比值比(OR)和95%置信区间(CI)。两侧0.05检验水平确定所有分析的统计学意义。所有分析均使用SAS版本9.1 (SAS Institute Inc.， Cary, NC)进行。

3.结果

3.1。研究人群和组织样本

我们回顾性纳入151名受试者，他们共提供316个可用的病理块(表)2)．在手术时，121名科目是当前的或前吸烟者（有没有吸烟者），而30次报告禁止吸烟历史（从未吸烟）。在从不吸烟者中，没有任何癌症史，无论是在手术之前或之后都会产生本研究中使用的组织。在止吐者中，10次患有肺部以外的癌症（1乳房，2个宫颈，2个结肠，2个前列腺，1睾和2个子宫）的历史，并在手术中均无癌症。有四名可爱的吸烟者在手术后开发了癌症，其在手术后产生了无癌症肺组织（1膀胱，1个结肠和2个NSCLC，在2年后，在5年后的一个）。临床数据表明，从未吸烟过吸烟者和肺部手术的患者都包括两个不同的群体。有没有吸烟者明显大于来自烟草（61岁，与44岁）。此外，源自肺手术标本的患者，71％的诊断，仅为肺气肿的诊断，而仅有10％的从​​未吸烟者。

我们分析了151例患者中316个可用的病理块，包括177个上叶样本，105个下叶样本，30个中叶或舌叶样本，4个叶起源不明的样本。98名(81%)的吸烟者和13名(43%)的不吸烟者可以使用多个街区;在121名吸烟者中，有269人接受了测试，而在30名不吸烟者中，有47人接受了测试。吸烟者和不吸烟者的样本位置差异很大，50%的吸烟者只对上叶样本做出了贡献，而不吸烟者的比例为17%。之所以会出现这种差异，是因为在我们的样本中，许多曾经吸烟的人因为肺气肿而接受了肺减容手术，当吸烟引起肺气肿时，主要影响上肺区。

３．２．基因高甲基化与吸烟状况

考虑每个受试者一个随机组织块，超过2%的受试者中只有APC(39%)、CCND2(21%)、CDH1(7%)和RARB(4%)发生高甲基化(图)1)．所有15个剩余基因(BVES、CDH13、CDKN2A (p16)、CDKN2B、DAPK1、IGFBP3、IGSF4、KCNH5、KCNH8、MGMT、OPCML、PCSK6、RASSF1、RUNX和TMS1)在不到2%的受试者中均发生了高甲基化。与从不吸烟的人相比，经常吸烟的人CCND2的高甲基化频率明显更高(26%对3%，)．在吸烟者中APC高甲基化的频率更高(41%对30%)，但这没有达到统计学意义()．

3.3。APC与CCND2基因超甲基化的相关性研究

APC和CCND2通常在相同的样品中高甲基化;对于两种基因的原样为阴性，16（5％）为CCND2的高甲基化，但不APC，68（22％）对于APC的高甲基化，而不是CCND2，以及53（17％）样品两种基因是阳性的。CCND2高甲基化与所有受试者的APC高甲基化显着相关（或= 7.3,95％CI = 3.9-13.8），仅在吸烟者（或= 7.4,95％CI = 3.9-14.0）中。在非莫克者中，31个（66％）样品对于两种基因为阴性，仅为APC的APC为阳性，2（4％）样品对于APC和CCND2是阳性的。

3．4．基因高甲基化与临床和人口学因素

在所有标本的单变量GEE分析中（表3.)， CCND2高甲基化与吸烟史阳性、年龄增加和样本来源肺上叶与肺下叶显著相关。与下叶相比，女性APC高甲基化的频率明显较低，上叶APC高甲基化的频率中等，但与阳性吸烟史无显著相关性。在多变量模型中同时评估吸烟史、年龄、性别、和位置的样本(上部和下部叶)在所有科目,CCND2仍显著增加年龄的甲基化(或= 1.7,95% CI -2.4 = 1.2每10岁)和上部叶位置(或= 2.0,95% CI -3.8 = 1.0)。CCND2高甲基化与吸烟史呈正相关(OR = 2.8, 95% CI = 0.6-12.1)，但无统计学意义。

3.5。基因高甲基化和烟雾暴露持续时间

在来自121名可吸烟者的269个样本的子集中（表4.），APC高甲基化与戒烟自烟吸烟或多年没有相关的。在单变量的GEE分析中，CCND2高甲基化与更大的包装多年显着相关，但与退出以来的几年没有相关。然而，在同时评估包装的多变量GEE分析中，由于戒烟，年龄，性别和位置（上部叶），CCND2高甲基化不再与包装多年（或= 1.0,95％CI =相关联每10包0.9-1.2岁）。

3.6。基因高瓣样品中的基因高甲基化

众所周知，吸烟有关的肺肿瘤和肺气肿不成比例地影响肺的上叶。因此，如果基因的高甲基化与吸烟有关，则我们可能期望与较低的叶片样本相比，在患者中，我们可能期望在上叶样品中找到更多的高甲基化。

检查来自吸烟者的所有269个样本（表4.)，在单变量GEE分析中，APC (OR = 2.0, 95% CI = 1.1-3.5)和CCND2 (OR = 1.9, 95% CI = 1.0-3.5)高甲基化在上叶比下叶更常见。在包括包年、戒烟年限、年龄、性别和上肺叶与下肺叶的多变量分析中，APC高甲基化仍然与上肺叶样本位置显著相关(OR = 2.1, 95% CI = 1.1-4.0)。CCND2与上叶的正相关降低至略低于统计学意义水平(OR = 1.7, 95% CI = 0.9-3.4)。

在我们队列中的121名曾经吸烟的人中，有30人同时拥有上叶和下叶样本，并被纳入受试者内部，两两比较。对于APC, 30对中有12对存在不一致的高甲基化状态(1对为阳性，1对为阴性)，其中12对中有8对APC高甲基化出现在上叶而非下叶()．对于CCND2，只有30对中的7个具有不可能的高甲基化状态，其中仅3个中的7个中的3个中含有高甲基化，而不是下叶（)．因此，很少有受试者在上叶和下叶样本中存在不一致的高甲基化，在受试者内部比较中无法产生有统计学意义的结果。

4。讨论

DNA高甲基化是肺癌发生中的重要事件。然而，目前尚不清楚DNA甲基化的变化是发生在以前正常的肺组织中的早期事件，还是只发生在显性肿瘤细胞中的晚期变化[30.］．为了回答这些问题，我们在没有癌症的受试者的受试者中测试了DNA高甲基化的DNA高甲基化 - 患者和非吸烟者 - 使用先前发现在一些非球细胞肺癌中的高甲基化的19个基因的面板[35那44］．这项独特的研究设计首次允许我们表征非莫克斯肺组织的DNA高甲基化谱，并将这种概况与烟雾暴露的肺部进行比较。

重要的是，我们观察到已知在肺癌组织中经常高甲基化的CCND2 [35那44-47]，在吸烟者(26%)中高甲基化的频率高于不吸烟者(3%)。此外，正如预测的那样，在长期吸烟者中，来自上叶的样本中CCND2的高甲基化更频繁，众所周知，上叶受吸烟的负面影响更大，如肺癌和肺气肿[36那37］．这些调查结果支持CCND2反映了由香烟烟雾引起的肺部早期癌症的早期癌症的初步变化。

CCND2编码细胞周期蛋白D2，这是一种参与细胞周期进程的蛋白，被认为是细胞周期蛋白依赖性激酶4和细胞周期蛋白依赖性激酶6在G1期到s期的过渡中起调节作用[39］．CCND2高甲基化在许多癌症中都很常见。在研究最为广泛的乳腺癌中，CCND2高甲基化经常被检测到，尽管在正常乳腺组织中似乎很少被检测到[48-54］．有趣的是，在上皮性卵巢细胞癌中，CCND2高甲基化(因此CCND2蛋白表达低)与预后不良相关[55[肝细胞癌的复发[56]，增加CCND2表达与弥漫性大B细胞淋巴瘤的预后差有关[57］．

在肺中，在40-56%的nsclc中发现了CCND2高甲基化[35那44那45那47］．在非癌性肺组织中，Virmani等人在18个样本中发现0个CCND2高甲基化[45]我们之前的调查发现来自NSCLC患者的24％的非癌症肺组织中的CCND2高甲基化[35］．这与本研究中观察到的巨大速率密切匹配，无癌症患者（26％）。可能是，我们的组在癌症和无癌症肺组织中观察到较高的CCND2高甲基化，因为我们使用了Virmani等人使用的甲基测定而不是甲基化特异性的PCR（MSP）。因此，我们可能已经检测到未被MSP检测到的无癌组织中的低水平的高甲基化基因。差异也可能是由于分析中使用的稍微不同的引物和探针，表示研究了不同的序列区域。此外，Kubo等人。没有观察到30种匹配的非癌症肺组织中的任何CCND2高甲基化，但应注意，在这项研究中，70％的受试者是不预期具有显着的CCND2高甲基化率的非吸烟者[46］．

综上所述，这些结果揭示了肺中CCND2高甲基化率的进展，与肺癌的发展风险相对应。虽然CCND2高甲基化在我们目前研究的30名不吸烟的低风险组中非常少见(3%)，但在吸烟的高风险组中更常见(在我们目前和以前的研究中为24-26%)，在明显的NSCLC组织中最常见(40-56%)。肺组织的这种风险分层进展表明，CCND2高甲基化可能真实地反映了肺的早期癌前病变，在向显性癌症的过程中，这可能是由于吸烟的影响。

尽管如此，我们的研究结果仍然应该被视为初步初步原因。在多变量分析中，考虑样品位置（上部与下叶）和主体年龄的影响后，减少了对CCND2高甲基化对CCND2高甲基化对CCND2高甲基化的影响。这可能发生了因为在我们的样本中，大多数吸烟者接受了肺部手术的肺部，并且代表了一个明显较大的群体，更有可能从上叶（肺气肿最突出的地方）贡献样品。相比之下，非莫克斯人对各种疾病的肺部切除了。随着这些因素的这种显着相关性，多变量分析可能无法可靠地将每个因素对基因高甲基化的相对贡献分开。因此，观察到的CCND2高甲基化率的差异可归因于以往任何不同的这些因素或其他因素，也可能归因于任何不同的因素和其他差异。例如，肺气肿使CCND2高甲基化更有可能在吸烟者中发现CCND2高甲基化的显着速率，但在吸烟者中也有其他诊断。虽然CCND2高甲基化可能是肺气肿独特病理生理学的一部分，但它更有可能出现，因为肺气肿反映了严重的吸烟诱导的肺部损伤。在非癌症中，尚未研究年龄对CCND2高甲基化的效果，尽管据报道了几种基因在肺中的各种身体组织中，在各种身体组织中进行了较高的高甲基化率，包括CDH1和DAPK1，但在肺部58］．在非癌症乳腺上皮[59]，以及从癌症患者身上提取的外周血样本[60]未观察到高龄，与CCND2高甲基化相关。因此，此时年龄和CCND2高甲基化的关系仍然未知。在称重年龄的相对贡献，样本地点和肺气肿地位上的CCND2高甲基化时，值得注意的是，吸烟史在单变量分析中的CCND2高甲基化的最强单一预测因子​​（或= 6.9,95％CI = 1.6-29.8)．对本研究的一个限制是，尽管我们总体上有了大量的151个科目，但只有30名从不吸烟。这发生了因为从未吸烟的人远低于产生组织的肺切除术。这可能是多变量分析中的原因的一部分，我们只观察到吸烟对CCND2高甲基化作用的趋势水平重要性。我们能够通过使用广义估计方程（GEE）来提高我们的统计学力，以便为我们的单变量和多变量分析进行多变量分析，允许我们在可用（多次观察）时输入多个组织块，而无需偏见结果。然而，未来的研究应该寻求验证我们在从不吸烟者中观察到的CCND2高甲基化的低速率。我们的研究设计的额外限制是所有受试者都有一个潜在的非癌症肺诊断，需要肺手术。因此，虽然观察到的基因高甲基化与癌症无关，但绝对不能据说代表健康的肺。 Finally, due to our study design, we only provide indirect evidence of interaction between smoking and CCND2 hypermethylation. Future studies utilizing animal models may be useful to elucidate the potential causal relationship between smoking and CCND2 hypermethylation.

在我们目前和以前的研究中，CDKN2A (p16)在26%的癌症组织中高甲基化[44]，但在非癌性肺组织中很少发生高甲基化，无论是否吸烟[35］．然而，CDKN2A高甲基化先前已被特征在于肺癌发生的早期事件[28-30.]，而CDKN2A的高甲基化在非肺癌的重度吸烟者的痰标本中已普遍检测到[32那61］．总的来说，文献中报道了一种非常广泛的CDKN2A的高甲基化率，用于非癌性肺组织。除了在非癌症组织中观察到CDKN2A高甲基化的低速率的其他研究人员，我们的结果表明CDKN2A高甲基化可能实际上代表致癌物的后来变化[62-66］．然而，研究之间的令人惊讶的巨大差异可能与测定方法（包括PCR引物和特定CPG岛）或患者群体的差异有关。

5.结论

CCND2高甲基化可能是肺中吸烟诱发的早期癌前病变;它在不吸烟者的肺组织中非常少见，在吸烟者中更常见，在明显的非小细胞肺癌组织中最常见。这一结论应在今后的研究中加以验证。此外,本研究支持我们之前调查的结论,尽管它们hypermethylated在许多NSCLC肿瘤组织,RASSF1, DAPK1,男朋友,CDH13,管理,KCNH5,在某种程度上是携带者和RARB,很少hypermethylated癌症肺癌,即使重要的烟草暴露(35］．因此，这些基因可能为理解晚期癌变提供线索。此外，如果CCND2或其他基因的高甲基化代表早期癌前病变，那么旨在逆转DNA甲基化的药物可能被用于预防吸烟相关的癌变。

利益冲突

没有宣布。

承认

本研究得到了NIH / National Cancer Institute授予NoS的支持。R01 CA115559，R01 CA107264和R01 CA80907。

参考文献

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