Antimyeloma效应的热休克蛋白70分子伴侣蛋白抑制剂mal3 - 101

文摘

多发性骨髓瘤(MM)是第二个最常见的血液系统恶性肿瘤,仍是无法治愈的,主要是由于难以/抗疾病的本质。理性的方法这一引人注目的挑战是开发新药物协同作用与现有有效的代理。这种方法会减少药物浓度,避免治疗抵抗,并改善治疗效果,针对新和nonredundant通路毫米。为了实现这个目标,我们检查了antimyeloma mal3 - 101的影响,一个新类的成员non-ATP-site抑制剂的热休克蛋白(Hsp) 70分子伴侣。我们发现mal3 - 101展出antimyeloma对MM细胞株的影响在体外和在活的有机体内在异种移植浆细胞瘤模型,以及对原发肿瘤细胞和骨髓内皮细胞骨髓瘤患者。结合蛋白酶体抑制剂,mal3 - 101显著疗效在体外和在活的有机体内antimyeloma效果。这些数据支持临床理由小分子抑制Hsp70功能,单独或与其他代理相结合,是一种有效的治疗策略,毫米。

1。介绍

本研究探讨了mal3 - 101细胞毒性的影响,一个新近发展起来的抑制剂,Hsp70 (1在多发性骨髓瘤(MM)],肿瘤的生长。MM是等离子体的骨髓(BM)肿瘤细胞,仍是无法治愈的2]。尽管显著改善患者的结果由于高剂量化疗和干细胞解救,并与bortezomib新的治疗方法,萨力多胺,lenalidomide [3,4在毫米),疾病进展导致死亡率造成积累基因突变,延长肿瘤生存,和治疗抵抗(5,6]。同样重要的是在MM发病机理和发展肿瘤增强大英博物馆微环境的影响(7,8),特别是MM利基(新血管形成的增加9由内皮祖细胞(epc) []10]。然而,两毫米的肿瘤微环境影响蛋白酶体抑制通过干扰细胞的生存途径(8,11- - - - - -13]。血液病中的作用很强的antimyeloma效应(ps - 341;Velcade) first-in-class 26 s蛋白酶体的选择性抑制剂,主要是由于细胞应激反应的特点是蛋白酶体的转录子单元和分子热休克蛋白家族的陪伴以及Hsp70、及其下游监管者肿瘤生长的8,12,14- - - - - -20.]。因此,分子伴侣’的封锁是目前正在探索在临床前研究和临床试验的antimyeloma效应,协同与bortezomib或结合其他代理(4,21,22]。

mal3 - 101抑制的能力Hsp40 cochaperones刺激Hsp70 atp酶活性,从而妥协必不可少的Hsp70细胞功能(1,23]。我们的基本原理研究antimyeloma mal3 - 101四倍的影响。首先,在浆细胞Hsp70同系物的内质网(ER),毕普,提高正常和misassembled的折叠和分泌免疫球蛋白(IGs),防止他们的积累24]。第二,在MM细胞Hsp70表达调节(25,26),在难治性MM细胞系(26,特别是在接触临床有效antimyeloma药物抑制其他组件的蛋白质质量控制机械(27]。第三,Hsp70基因表达和超表达与人类癌症相关联28- - - - - -32]。第四,抑制癌症细胞Hsp70的触发肿瘤特异性细胞凋亡和细胞死亡通过抑制溶酶体膜透化作用,压力诱导细胞死亡的一个标志33,34]后者机制是由稳定溶酶体通过Hsp 70绑定endolysosomal磷酸阴离子磷脂bis (monoacylglycero) (BMP)、溶酶体膜鞘磷脂代谢的基本代数余子式(34]。

Hsp70基因和蛋白表达后调节在MM细胞暴露于bortezomib以及应用后17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG),这抑制了一半监护人(11,15,16,18,25,35]。值得注意的是,Hsp70徒凋亡通路中的多个节点(16,29日,36),因此它的抑制可能克服微分响应bortezomib以及副作用中遇到它的使用对MM (20.,22,37]。反过来,由小分子抑制剂抑制Hsp72效力在体外肿瘤细胞系凋亡17-AAG对MM的影响(16,21]。因此,我们推断mal3 - 101可能协同作用和加强在体外和在活的有机体内antimyeloma一半寿命和蛋白酶体抑制剂的影响。

依照我们的前提,我们发现mal3 - 101有力的抑制对MM细胞增殖和生存的影响,包括原发肿瘤细胞和内皮祖细胞从MM患者。mal3 - 101诱导MM细胞生长抑制细胞周期进程被逮捕的特点和内在的凋亡通路的激活这些细胞。此外,强大的协同作用被发现的在体外细胞毒性的影响mal3 - 101与蛋白酶体抑制剂和一半。之间的协同mal3 - 101 MM细胞生长和蛋白酶体抑制研究在活的有机体内使用异种移植的浆细胞瘤小鼠模型(38]。的在活的有机体内复制的抑制肿瘤细胞生长的研究发现在体外。这些数据表明,通过瞄准Hsp70肿瘤及其血管微环境的活动,并通过允许剂量减少协同代理,但不影响其效能,Hsp70抑制可以改善现有策略通过添加代理作战的阿森纳MM绕过治疗阻力和延长生存。

2。材料和方法

2.1。试剂和细胞培养

mal3 - 101和MAL3-51(参见图S1在网上补充材料doi: 10.1155 / 2011/232037),蛋白酶体抑制剂mg - 132 (A.G.科学,圣地亚哥,加利福尼亚州)和bortezomib (ps - 341, LC实验室,沃本,质量),一半寿命和抑制剂17-AAG (Calbiochem / EMD生物科学,圣地亚哥,加利福尼亚州)溶解在二甲亚砜(DMSO溶液;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)和存储−20°C。控制细胞仅接受车辆(0.03% DMSO)。MM细胞系检查NCI H929, rpmi - 8226, U266(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)。正常外周血单核细胞(PBMCs)和骨髓(BM)细胞获得干细胞技术(加拿大温哥华)。主要MM细胞和内皮祖细胞来自BM吸入新诊断患者的知情同意。MM细胞丰富CD138 > 95%⁺细胞通过积极的选择使用anti-CD138 mac微根据制造商的指示(Miltenyi,加州圣地亚哥)。内皮祖细胞是来源于BM吸入物的新诊断的患者中维护EndoCult介质(干细胞技术),和用于首次通过如前所述39,40]。PBMCs细胞系,细胞维持rpmi - 1640年补充heat-inactivated 10%胎牛血清(如前所述)(39,40]。

2.2。细胞毒性检测

细胞(镀)在96 -微量滴定板(合演,剑桥,质量)在100年μL表示生长介质和暴露的时间表示浓度的化合物。控制细胞培养在DMSO同样体积的0.03%。所有的研究进行了一式三份和重复至少三个独立的场合。生存是一个衡量MTS试验(威斯康星州麦迪逊Promega)按照制造商的指示。细胞生存能力也是衡量台盼蓝染料排斥镀在相同的文化。

细胞凋亡诱导控制(DMSO-treated)或药物治疗是决定使用一个Annexin-V-FLUOS染色设备根据制造商的指示(罗氏,印第安纳波利斯,印第安纳州)。简单地说,细胞()在表示时间点治疗后,收获和膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯(FITC)和propidium碘(PI)被添加到个人样本和孵化在黑暗中30分钟。荧光分析由FACSort流式细胞分析仪(BD生物科学,加州圣何塞)通过收购每样10000事件。

2.3。细胞周期分析

细胞周期分析控制(DMSO-treated)和mal3 - 101治疗NCI-H929细胞()是评估通过PI染色和流式细胞仪分析样品。结果DNA分布进行了分析细胞的比例和减去后阶段的细胞周期控制的细胞紧身衣和碎片,如前所述[41]。

2.4。西方墨点法

全细胞溶解产物是准备使用哺乳动物细胞溶菌作用工具包(Sigma-Aldrich)和免疫印迹分析分析。等量的蛋白质分离通过sds - page和electrotransferred到尼龙膜。主要检测抗体caspase-3(细胞信号技术,丹弗斯,质量),poly-ADP-ribose聚合酶(PARP;Abcam,剑桥,质量)β肌动蛋白(Sigma-Aldrich)以及使用辣根peroxidase-conjugated goat-antimouse多克隆二级抗体(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西)。增强化学发光底物(皮尔斯生物技术,罗克福德,生病)是用于抗体检测。

2.5。逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)分析XBP1信使rna剪接

Unspliced (XBP-1u 285 bp)和拼接(XBP-1s 259 bp) XBP-1 mRNA水平的治疗NCI-H929细胞测定的总RNA,反转录PCR扩增上标逆转录酶(表达载体,加州卡尔斯巴德)。PCR引物(5′-TTACGAGAGAAAACTCATGGC-3′, 5′GGGTCCAACTTGTCCAGAATGC-3′),这侧面26-nt XBP1信使rna基因内区,用于PCR扩增Taq交货聚合酶(豆类生物、志贺、日本)。

2.6。人类免疫球蛋白轻链酶联免疫吸附试验(ELISA)

水平的分泌和细胞内κ和λ轻链(LCs)测定使用人类卡帕和λ(约束和自由)ELISA定量工具(Bethyl实验室、蒙哥马利、特克斯)根据制造商的指示。丸和上层清液从10⁶采用无血清细胞培养过夜。总蛋白从细胞全细胞溶解产物颗粒和上层的决心使用Bio-Rad蛋白质化验(Bio-Rad实验室、大力神、加州),和500 ng总蛋白用于每个ELISA。占相对于合成分泌的差异之间的LCs MM细胞系,LC生产评估分泌和细胞内的比例LC的水平。

2.7。异种移植浆细胞瘤小鼠模型

NOD / SCID / IL-2R伽马null (NSG)小鼠(42-52天大)获得杰克逊实验室(巴尔港,我)和维护SUNY Downstate医学中心在无菌条件下动物资源设施。这项研究是根据协议进行机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)州南部医学中心的。小鼠接种南卡罗来纳州的右翼100年NCI-H929细胞μL RPMI 1640和100μL(基底膜基质基底膜矩阵(BD生物科学、贝德福德)所描述的勒布朗et al。38]。老鼠被分为四个治疗组包含4老鼠每个接收车辆(DMSO和PBS),或1毫克/公斤ps - 341 (Bortezomib),或40毫克/公斤mal3 - 101,或1毫克/公斤40毫克/公斤mal3 ps - 341和- 101。所有组治疗通过ip每周注射两次,在同一时间表。最长的卡尺测量肿瘤直径进行治疗的日子估计肿瘤体积,使用下面的公式:,代表着一个椭圆的三维体积。动物牺牲当他们达到5.5厘米或成为肿瘤坏死;最早牺牲的vehicle-treated动物治疗20天。动物研究是独立复制,所有实验都显示的数据。

2.8。统计分析

DMSO-treated文化被学生的文化相比,服药治疗t -测试或Dunnett的事后测试后明显的重复测量单向方差分析。所有的测试都是正反,被设定为与统计意义。Isobologram分析推导出组合指数(CI)值基于Chou-Talalay方法使用CalcuSyn软件(密苏里州Biosoft,弗格森和剑桥,英国)描述(14]。

的在活的有机体内组件的研究用两种方法进行了分析。首先,浆细胞瘤生长的程度进行了分析使用一般线性模型(GLM)与天的肿瘤测量重复测量和治疗条件(车辆,mal3 - 101 ps - 341或ps - 341 + mal3 - 101)相结合的分类变量。漠视,我们调整的两个实验数据已经收集(实验1和2)。我们对重复测量的条件影响的统计分析来评估整个天的治疗条件的区别。方差分析的条件影响进行每天跟着事后图基的诚实的显著差异(HSD)测试。第二,使用卡方分析,我们使用车辆部门作为一个参考点来计算平均百分比差异为每个单独治疗和组合与车辆在肿瘤的生长。实验结果调整数。条件比较使用事后测试图基的HSD测试。

3所示。结果

3.1。mal3 - 101抑制增长和提升者在人类MM细胞凋亡

确定的影响mal3 - 101 MM细胞系,NCI-H929 U266, rpmi - 8226细胞培养mal3 - 101浓度增加和收获后不同时间点治疗。控制细胞处理车辆(DMSO)。最高水平的细胞毒性,MTS试验评估,在NCI-H929细胞(图1(一));40小时暴露剂量反应研究表明IC50 8.3μM(图1 (b))。接触mal3 - 101超过48小时没有导致细胞死亡或凋亡额外增加(数据没有显示)。相比之下,对10或20没有反应μM MAL3-51(图1 (b)),少得多的Hsp70调制器(42]。这些数据有力地表明,mal3 - 101的细胞毒性效应是直接关系到其抑制NCI-H929细胞Hsp70活动的能力。mal3 - 101的细胞毒性效应也观察到在rpmi - 8226细胞系虽然程度低于观察NCI-H929细胞(图1(一))。

(一)

(b)

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图1

μ mal3 - 101诱导分级在多发性骨髓瘤(MM)细胞系细胞毒性效应。(一)毫米细胞系()暴露在10M mal3 - 101表示文化时期,和褶皱的变化百分比可行的细胞治疗与控制细胞由MTS试验确定。(b) NCI-H929细胞暴露在表示mal3浓度为40 - 101或MAL3-51 h,百分比和生存能力,控制相比,DMSO-treated细胞,是由MTS试验评估。数据提出了从三个独立的实验手段和SDs;*,**和* * *。

因为mal3 - 101启动细胞凋亡通过逮捕细胞周期的能力以及通过激活caspase-3的乳沟和PARP在乳腺癌细胞23),我们下了这些特性NCI-H929细胞。流式细胞仪分析表明,暴露在10μM mal3 - 101细胞凋亡时间增加(图生产2(一个))。这种治疗也抑制细胞周期进展,显示近三倍增加子任务阶段和细胞下降了2.5倍阶段(图48小时内的文化2 (b))。这个结果是由免疫印迹分析,显示时间增加的乳沟caspase-3接触后,PARP mal3 - 101(图2 (c))。总的来说,这些结果表明,mal3 - 101 MM肿瘤细胞生长抑制和启动凋亡程序明显比其他人更大的功效在一些细胞系。

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(b)

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图2

μ μ β mal3 - 101诱导细胞周期阻滞和caspase-mediated细胞凋亡在多发性骨髓瘤(MM)细胞株NCI-H929。(一)毫米细胞系暴露在10M mal3 - 101 40小时,细胞凋亡的褶皱变化mal3 - 101治疗与控制,DMSO-treated细胞是由流式细胞术。数据提出了从三个独立的实验手段和SDs;*。(b) NCI-H929细胞的百分比和阶段的细胞周期在每个面板显示。这个结果代表三个独立的实验,取得了类似的结果。(c) NCI-H929细胞暴露在10M mal3 - 101表示文化时期和主要抗体免疫印迹检测caspase-3和聚(ADP-ribose)聚合酶(PARP)。为了确保平等的加载,肌动蛋白水平进行控制。带相应的完整和裂解caspase-3和PARP表示。四个实验的数据代表。

3.2。接触mal3 - 101提高Antimyeloma mg - 132的影响

在MM细胞中,蛋白酶体抑制导致错误折叠和aggregation-prone蛋白质的积累,其中未装配的IG重型和轻型链,可以诱导细胞凋亡12,17,19,43]。因此,我们要求mal3 - 101是否会加强antimyeloma蛋白酶体抑制的效果。NCI-H929细胞暴露在一系列mal3 - 101或mg - 132浓度或浓度范围的两个代理的组合。我们发现这些代理的IC50联合下降了三个数量级(0.008μ米)单药治疗相比,要么mal3 8.3 - 101 (IC50μ米)或1.7 mg - 132 (IC50μ米)(图3(一个)和补充表)。值得注意的是,当独自一人时,检查每一个化合物是无效的IC50时得到化合物的总和。事实上,协同和细胞毒性的行为mal3 NCI-H929 - 101和mg - 132细胞发生一系列浓度(0.01 - -0.1μ米),证实了CI值< 1,这表明强烈的协同作用(图3 (b))。正如所料,协同增加细胞凋亡也观察到NCI-H929细胞暴露于两种化合物的组合(图S2)。

(一)

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(d)

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图3

14 mal3 - 101和mg - 132表现出协同,对多发性骨髓瘤细胞毒性影响肿瘤细胞和内皮祖细胞。(一)NCI-H929细胞()暴露在浓度表示mal3 - 101 mg - 132,或组合这些代理40 h,和生存评估了MTS试验;代表数据从一个七个独立的实验显示;从复制数据点误差代表SDs。明显缺乏误差表明最小方差。(b)的比例不能存活的细胞控制相比,DMSO-treated细胞在这个实验中用于isobologram分析。在短暂的,细胞碎片(Fa)是计算的基础上,指出影响MTS化验使用以下公式:-可行的细胞的百分比。Fa值在指定所使用的药物浓度CalcuSyn指数(CI)值,获得组合表明添加剂的影响,表示协同作用,表明对抗(]。(c)从肿瘤细胞(黑条)和支流内皮祖细胞(epc)(白色酒吧)多发性骨髓瘤患者暴露在浓度表示mal3 - 101 mg - 132,或它们的组合,生存是由MTS试验评估。Dunnett的测试,在显著的单向重复测量方差分析(0.002,肿瘤细胞和内皮祖细胞,分别地),而控制细胞生存能力的文化价值观对待mal3 - 101 mg - 132,或mal3 - 101 + mg - 132 (*,**)。(d)正常外周血单核细胞(PBMCs,黑人酒吧),骨髓单核细胞(BMMCs,灰色酒吧)和支流从骨髓内皮祖细胞(白色的酒吧)暴露在浓度表示mal3 - 101 mg - 132,或这些代理的组合,生存是由MTS试验评估。

协同antimyeloma mal3 - 101和mg - 132的影响也证实在初级MM细胞。如图3 (c),从大英博物馆中提取的MM细胞的生存能力降低了(),(),分别由mal3 - 101和mg - 132,并进一步下降了()当这些代理的总和。除了对肿瘤细胞的影响,结合治疗mal3 - 101和mg - 132还在毫米微环境产生协同效应。如图3 (c)(白色的酒吧),减少内皮祖细胞的可行性(),()mal3 - 101和mg - 132,分别,而他们结合EPC生存能力下降()。的特异性mal3 - 101对毫米肿瘤微环境的影响表示缺乏细胞毒性在正常控制BM, PBMC, EPC数量(图3 (d))。这些结果与之前是一致的观察抗蛋白酶体抑制在正常淋巴细胞(44)的作用,进一步表明特异性mal3 - 101对肿瘤细胞在毫米。因为一半分子伴侣蛋白稳定癌基因蛋白,帮助维持MM细胞内稳态,与bortezomib有协同作用在体外(15,18),我们下一个评估的影响mal3 - 101治疗时结合antimyeloma一半抑制剂17-AAG。当NCI-H929细胞同时暴露于一个mal3 - 101的浓度大于它的IC50 (10μM)和17-AAG浓度的增加,我们发现mal3 - 101和17-AAG 17-AAG的IC50从0.4下降μ米至0.03μ(数据4(一)和4 (b)和补充表)。这些结果与预测一致antimyeloma一半抑制的影响,导致upregulation Hsp70基因表达的15,18),可以通过同时抑制强Hsp70的功能。

(一)

(b)

(一)
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图4

μ 14 mal3 - 101和17-AAG展览协同,对NCI-H929 MM细胞系细胞毒性的影响。(一)NCI-H929细胞()被暴露于17-AAG单独或结合10M mal3 40 - 101 h,和生存MTS试验评估。代表三个实验显示的数据从一个;从复制数据点误差代表SDs。明显缺乏误差表明最小方差。(b)的比例不能存活的细胞控制相比,DMSO-treated细胞在这个实验中用于isobologram分析CalcuSyn指数(CI)值,获得组合表明协同作用[]。

开始检查单独和组合这些化合物如何影响NCI-H929细胞的生存能力,我们问化学品的管理是否会引起的蛋白质反应(UPR)。ER应激条件下,UPR感应,信使rna编码x - box结合蛋白1 (XBP-1)转录因子是拼接。这个剪接事件结果的翻译54-kDa XBP-1拼接(XBP-1s)同种型而不是33-kDa XBP-1 unspliced (XBP-1u)同种型。等离子体的拼接异构体是至关重要的细胞分化甚至毫米进展(6,12],XBP-1拼接代表一个敏感的,可量化的UPR的读出。在相对较早的时间点,UPR感应最大时,没有观察到XBP-1信使rna剪接NCI-H929 mal3 - 101细胞接触后,mg - 132,或者在浓度,导致17亚美大陆煤层气有限公司协同细胞毒性(图5(一个))。符合这些结果,我们发现的ER水平腔的毕普伴侣蛋白,其合成增强了UPR激活,并没有改变在NCI-H929细胞暴露于mal3 - 101 mg - 132,和/或17-AAG(数据没有显示)。然而,在更高浓度的mal3 - 101 (30μM ~ 4倍高于IC50),增加时间XBP-1信使rna剪接是表示(图5 (b))。UPR感应可能导致翻译,从一般Hsp70-dependent块新生蛋白质折叠,蛋白质运输通过分泌通路,和/或转录(12,42,45]。

(一)

(b)

(一)
(b)

图5

μ μ 展开的蛋白质反应不是NCI-H929细胞诱导针对伴侣和/或蛋白酶体抑制。rt - pcr分析评估XBP-1 NCI-H929细胞信使rna剪接,右边的箭头表示285个基点unspliced (XPB-1u)和259个基点拼接(XPB-1s) mRNA。(a) NCI-H929细胞暴露4 h mal3 - 101 mg - 132, 17亚美大陆煤层气有限公司,或指定的化合物的组合,总RNA提取rt - pcr扩增。NCI-H929细胞治疗4 h和5g / mL衣霉素(TM)是一个积极的控制诱导XBP-1信使rna剪接。为0,(b) NCI-H929细胞暴露24、48和72 h为30M mal3 - 101,总信使rna提取rt - pcr扩增。

有力的实验证据表明,肿瘤的敏感性MM细胞蛋白酶体抑制与影响单克隆IG生产(17,19,46,47]。因此,我们测量了IG生产和贩卖mal3 - 101治疗MM细胞系。细胞内和分泌IGs量化时,我们观察到的相对数量IG NCI-H929细胞分泌最高,也展示了最高灵敏度mal3 - 101诱导生长抑制(表1)。这些数据表明,MM细胞Hsp70的敏感性,抑制来自添加细胞产生和分泌单克隆IGs的压力。

确定量化的可行性mal3 - 101 MM细胞生长抑制介导的回应mal3 - 101在活的有机体内,我们使用了皮下NCI-H929肿瘤(浆细胞瘤)异种移植在NSG受体小鼠(38]。与车辆(DMSO和PBS)治疗,或40毫克/公斤mal3 - 101和1毫克/公斤ps - 341 (bortezomib),或40毫克/公斤mal3 - 101和1毫克/公斤ps - 341 i.p。开始,南卡罗莱纳州肿瘤细胞注射后24小时。支持的药物剂量和进度的初步观察肿瘤的生长与mal3 - 101对治疗的反应在一个替代剂量和进度(图S3)。

整体重复措施治疗观察条件(;)如图6(A)。vehicle-treated控制相比,mal3 - 101和ps - 341推迟肿瘤生长在从最初的治疗20天;然而,在组合,MAL3-101和ps - 341有一个效果比单一治疗推迟肿瘤恶化,减少肿瘤大小。显著影响方差分析指出了6天,9日,13日,16日和20(图6(A))。几天6 20,肿瘤体积明显比为联合治疗更大的车辆mal3 ps - 341, - 101和13天,16日和20日,肿瘤体积明显比ps - 341更大的车辆。没有差异,指出车辆与mal3 - 101。为了比较条件对肿瘤恶化的影响,我们计算的平均百分比差异为每个治疗与车辆如图6(B)。一个总体条件影响指出(;)。分析还显示,联合治疗与ps - 341和mal3 - 101明显更有效的肿瘤抑制百分比相比,治疗与ps - 341单独或mal3 - 101(图基HSD测试,;职责。)(图6(B))。总的说来,在活的有机体内依照我们的数据在体外结果和显示,同时抑制蛋白酶体和Hsp70 mal3 - 101有一个稳定的肿瘤生长抑制的影响发现早一天6 MM模型。

图6

体内。 mal3 - 101和ps - 341对骨髓瘤细胞生长(一个)显示重复措施条件影响NSG小鼠皮下接种在右翼NCI-H929细胞。老鼠收到40毫克/公斤mal3 - 101, 1毫克/公斤ps - 341,这些代理的组合,或车辆每周i.p两倍。()。肿瘤体积评估进行表示。整体重复措施治疗条件观察(;),mal3 - 101和ps - 341推迟肿瘤生长在从最初的治疗20天;然而,在组合,MAL3101和ps - 341有一个效果比单一治疗推迟肿瘤恶化,减少肿瘤大小。竖线表示0.95置信区间。a e指方差分析的结果为白天治疗对肿瘤抑制作用的影响。(一)总体条件影响6天:;;图基HSD:工具> mal3 - 101和ps - 341组合。(b)总体条件影响日9:;;图基HSD:工具> mal3 - 101和ps - 341组合。(c)总体条件影响日13:;;图基HSD:工具> mal3 - 101和ps - 341组合;车辆> ps - 341。(d)总体条件影响日16:;;图基HSD:工具> MAL3-101和ps - 341组合;车辆> ps - 341。(e)总体条件影响20天:;;图基HSD:工具> MAL3-101和ps - 341组合;车辆> ps - 341。(B)条形图显示了计算均值差异百分比为每个治疗和车辆。整体条件影响指出(;)。治疗相结合的ps - 341和mal3 - 101明显更有效的肿瘤抑制百分比相比,ps - 341或独自mal3 - 101(图基HSD测试,;、职责),虽然每个治疗没有明显不同。*显示统计学意义。竖线表示0.95置信区间。

4所示。讨论

本研究的重点是衡量mal3 - 101上的影响在体外和在活的有机体内MM细胞的增长和预测这种化合物的临床有效性毫米。我们的研究结果提供的证据表明,mal3 - 101 MM细胞,是细胞毒性和协同效应观察到当使用这种化合物结合一半或蛋白酶体抑制剂。

在MM,蛋白质折叠机械超载是因为增加了搞笑合成和分泌,和IGs的人口可能折叠;事实上,一些MM细胞产生未装配的搞笑单一链。这些蛋白质的浓度在ER可能减少retrotranslocated细胞质中,蛋白酶的降解,这一过程称为ER-associated退化(ERAD) [48,49]。IGs褶皱以来ER和交通通过分泌通路,蛋白酶体抑制导致错误折叠蛋白质的增加负荷,从而引起细胞凋亡。因为Hsp70同系物在ER和细胞质ERAD[中扮演关键的角色28,48,49),它可能不是令人惊讶的,我们观察到协同细胞毒性影响MM细胞生存时,同时抑制蛋白酶体和Hsp70。我们还观察到协同MM细胞细胞毒性的联合抑制Hsp70和一半寿命,进一步支持了这种观点,即MM细胞容易治疗妥协蛋白质质量控制。

最mal3 - 101响应细胞系NCI-H929,高分泌腺的单克隆搞笑(50并与其他公布的数据是一致的,搞笑负载与抑制剂的敏感性质量控制机械(17,43]。尽管缺乏UPR感应在MM细胞之前已经报道过了12),我们设想,这种反应可能引发Hsp70和蛋白酶体抑制时因为ERAD基质应该积累。缺乏UPR感应mal3 - 101,一半,在低浓度和蛋白酶体抑制剂,协同诱导细胞凋亡可能是多因子的:虽然NCI-H929细胞合成和分泌大量的IGs,他们可能无法引起持续UPR。或者,可能发生细胞凋亡通路独立的UPR激活,包括自噬(45)或aggresome处理(14];因此,这将是重要的在分子水平上更好地定义机制,调节细胞应激反应(51]。进一步的工作需要建立mal3 - 101是否影响途径中调节MM细胞(14,45]。然而,达文波特和他的同事们(15)表明,蛋白酶体抑制在毫米细胞系bortezomib并不必然导致生产XBP1s,但是ER压力和内在的凋亡通路的激活明显。此外,接触17-AAG 2 h后,有一个快速启动的UPR导致ER压力和内在的凋亡通路的激活。最近,同一组发现17 aag-induced UPR在毫米增加Hsp72协同抑制细胞系(21]。用类推的方法,我们发现后,XBP1s水平就会升高MAL3101后48 h。然而,在有效antimyeloma浓度,我们没有观察到XBP1s mal3 - 101和17-AAG coadministered时,除非更高浓度和延长孵化。我们建议不同的观察到的影响可能造成化合物的性质被用来抑制Hsp70,和/或独特的Hsp70家族成员的活动可能受到这些化学物质的影响不同。

我们的研究的关键结果的演示Hsp70的协同效应和蛋白酶体抑制毫米微环境。我们和其他人观察到搞笑基因重排在毫米内皮祖细胞(40,52];因此,蛋白质错误折叠和随后的ER应激反应可能确定肿瘤内皮细胞的敏感性,至少在人口的患者中,Hsp70和蛋白酶体抑制。这种可能性是由缺乏敏感性mal3 - 101在正常骨髓淋巴细胞,内皮细胞,其中大部分不产生搞笑。结果,临床应用mal3 - 101 MM不仅可以帮助克服耐药性,其余其它蛋白质质量控制抑制剂的影响,但它也可能限制MM增长通过抑制肿瘤血管生成。

mal3 - 101的antimyeloma效应是明显的浓度与15-deoxyspergualin类似,Hsp70调制器与Hsp70的KD ~ 5μm . 15-Deoxyspergualin已被证明成功的临床试验(53];然而,这种化合物是一种特异性的伴侣蛋白抑制剂,可能出现其他off-pathway效应(54]。我们的结果也符合最近的数据显示强烈的表达Hsp70表达毫米后在基线和重大upregulation细胞系细胞外基质(ECM)粘附[26]。在同一篇报道中,也证明了Hsp70基因表达抑制诱导肿瘤细胞粘附的减少ECM紧随其后在MM细胞凋亡增加。

总之,我们建议mal3 - 101, Hsp70调制器,特别结合Hsp70和影响它的交互与cochaperones [1,28,55),可能提供一个可行的方法来提高antimyeloma一半寿命和蛋白酶体抑制剂的影响。共同策略可以减少耐药性在MM的治疗,让患者目前不能容忍bortezomib [13受益于药物因为低浓度可用于结合mal3 - 101像分子。除了直接的抗肿瘤特性,mal3 - 101可能影响针对微脉管系统的微环境。我们的实验使用异种移植浆细胞瘤模型表明,肿瘤细胞生长在活的有机体内也推迟和减少mal3 - 101,这对蛋白酶体抑制这种抑制作用协同,观察联合治疗后第一周内开始。在这个模型中,因为我们开始治疗肿瘤起始化合物24 h内,这些发现可能被翻译临床限制效应在疾病的早期阶段之前广泛的骨骼参与。也有可能含有更高的剂量组合mal3 - 101与蛋白酶体抑制可能需要控制较大的肿瘤和毫米的后期。需要阐明的药代动力学性质mal3 - 101是由这些结果强调优化剂量和频率mal3明细表- 101曝光。特别重要的测量等离子体水平以及间隙的速率和程度的化合物在确定影响和毒性。在后者方面,我们知道浓度高达160毫克/公斤ip一直容忍没有毒性(数据未显示)。这里给出的结果强烈表明,更详细的研究mal3 - 101的药物动力学是必要的。

资金来源

o . Batuman承认批准号从美国国家癌症研究所R21CA115832-01;j·l·布罗斯基承认收到的资助伙伴关系治疗和高盛慈善合作伙伴,阿尔法一个基金会,国家卫生研究院批准号GM75061;p . Wipf承认批准号P50-GM067082 NIH-NIGMS的支持中心的化学方法,在匹兹堡大学的图书馆发展。

确认

作者感谢艾伦博士j·诺SUNY Downstate移植免疫学和免疫遗传学实验室主任,对他的支持,和玛丽Mondragon-Escorizo,女士在SUNY Downstate移植免疫学,为她专门帮助流式细胞术。他们感谢Chongmin欢博士和莎拉Nataraj博士,纽约州立大学州南部,在细胞周期分析的输入。他们也要感谢Christopher Nicchitta博士(杜克大学)提供抗血清。有用的讨论和统计支持从埃里克史密斯博士。

补充材料

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