. T-oligos inhibited EC tubulogenesis and total tumor microvascular density matrix invasion by MM-AN cells and ECs in vitro. In melanoma SCID xenografts, two systemic T-oligo injections decreased by 60% ( ) total tumor microvascular density and the functional vessels density by 80% ( ). These findings suggest that restriction of tumor angiogenesis is among the host's innate telomere-based anticancer responses and provide further evidence that T-oligos may offer a powerful new approach for melanoma treatment."> 黑色素瘤血管生成的抑制端粒同族体寡核苷酸 - raybet雷竞app,雷竞技官网下载,雷电竞下载苹果

肿瘤学杂志
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肿瘤学杂志/2010年/文章
特殊的问题

肿瘤血管生成

把这个特殊的问题

研究文章|开放获取

体积 2010年 |文章的ID 928628年 | 14 页面 | https://doi.org/10.1155/2010/928628

黑色素瘤血管生成的抑制端粒同族体寡核苷酸

克里斯蒂娜·科尔曼,1 丹尼尔·莱文,1 拉吉特•,2 Gangjian秦,2 蒂娜索恩,2 艾琳·朗伯,2 Sharath p Sasi,3 米娜Yaar节,1 芭芭拉·a·Gilchrest,1 和 David a . Goukassian1,3

1波士顿大学医学院皮肤病学系,波士顿,MA 02118,美国

2伯格心血管研究所,Feinberg医学院,芝加哥,60611年,美国

3心血管研究分工,医学系的癌症中心系统生物学,明爱圣伊丽莎白的波士顿医疗中心,马02135,美国

学术编辑器:Arkadiusz杜德克
收到了 2009年11月13日
修改后的 2010年5月06
接受 2010年5月07
发表 2010年6月28日

文摘

端粒同族体寡核苷酸(T-oligos)激活一个先天telomere-based程序,导致多个抗癌效果。T-oligos法案在端粒启动信号通过Werner蛋白质和ATM激酶。我们想要确定如果T-oligos有抗血管新生的影响。我们发现T-oligo-treated人类黑色素瘤(MM-AN)细胞降低了血管内皮生长因子(VEGF)的表达,VEGF受体2,angiopoeitin-1 2和VEGF分泌减少。T-oligos激活转录因子E2F1和抑制血管生成活性的转录因子,HIF-1 。T-oligos抑制EC tubulogenesis和总肿瘤微血管密度矩阵MM-AN细胞和ECs体外入侵。在黑色素瘤SCID异种移植,两个系统性T-oligo注射下降了60% ( )总肿瘤微血管密度和功能性血管密度80% ( )。这些发现表明,限制肿瘤的血管生成是主人的先天telomere-based抗癌反应和提供进一步的证据表明T-oligos可能为黑色素瘤的治疗提供一个强大的新方法。

1。介绍

新血管的形成,血管生成是必不可少的肿瘤的生长和转移1)和抑制血管生成是一个重要的新方法治疗许多癌症的1,2]。血管生成的主要监管机构是血管内皮生长因子(VEGF) [3]。VEGF家族由至少5基因(VEGF通过E),其中最强有力的催化剂的血管生成是VEGF-A和VEGF-B4]。分析VEGF-A(称为VEGF在这里和其他地方的文本)基因启动子区域显示许多潜在的转录激活网站(4]。最好的学习刺激VEGF合成和分泌是缺氧,行为的移植缺氧诱导因子- 1 (HIF-1 )[5]。抑制HIF-1 可能会因此减少血管生成减少VEGF水平和潜在的其他proangiogenic因素,如angiopoeitin-1和2 (Ang-1和Ang-2) [6- - - - - -8),基本成纤维细胞生长因子(bFGF)和血小板衍生生长因子(PDGF),所有众所周知的监管者的血管生成(1]。

E2F1在细胞凋亡的作用有目共睹。它能一致行动与p53或独立于p53诱导的细胞凋亡9]。T-oligos,端粒同族体寡核苷酸,激活p53和E2F1,导致细胞凋亡(10]。然而,在p53空细胞像恶性黑色素瘤细胞(MM-AN),细胞凋亡是由p53诱导p73同系物(11),大概与E2F1协调行动。此外,E2F1也被报道抑制血管生成(9,12]。虽然E2F1 VEGF降低生产成纤维细胞通过p53激活(12),其在细胞对血管生成的影响,缺乏功能p53,如MM-AN细胞尚未研究[11,13]。

一些证据显示,正常细胞有一个集成项目的genome-protective反应,功能上类似于细菌SOS反应(14),这似乎是建立在端粒和废除在恶性肿瘤(15]。端粒(染色体的末端,是保持在一个循环中配置单链的插入 过剩的近端端粒双(16]。这个循环结构的破坏主要结合蛋白的去除TRF2(端粒重复绑定因子2)导致曝光和消化过剩和激活的ATM(共济失调毛细血管扩张突变)及其效应蛋白p53,紧随其后的是细胞凋亡或衰老,根据细胞类型(16]。击倒的telomere-associated蛋白质,保护telomeres-1(第一档次),也将公开TTAGGG端粒重复序列,激活ATR(共济失调毛细血管扩张和Rad3-related),导致类似的下游效应(16,17]。此外,治疗恶性肿瘤细胞RNAi击倒后的表达,端粒酶RNA亚基,迅速改变了许多基因的表达模式预测来减少癌症细胞增殖和侵袭性(18],然后导致细胞凋亡在时间进程过于迅速由端粒酶活动的预期损失和由此产生的端粒缩短,表明其他telomere-based效果负责18]。

我们实验室有描述几个抗癌特性端粒重复序列的寡核苷酸同源TTAGGG (T-oligos) [10,11,13,15,19- - - - - -28]。T-oligos提供快速培养细胞积聚在细胞核和调节端粒的DNA损伤反应没有消化过剩或其他可检测基因组DNA的影响(10,13,15,19,23,25,26,29日]。T-oligos激活ATM激酶(21,27],移植并激活p53 [30.,31日),以及移植和/或激活其p73同系物,E2F1, p p33、p27和p95 / Nbs1,使磷酸化蛋白质组蛋白变体H2AX [11,13,21,22,24,25]。此外,T-oligos促进黑色素瘤细胞的分化,并下调细胞凋亡蛋白的抑制剂IAP /推荐在这些细胞(13]。T-oligo效果需要WRN [22),蛋白质的突变progeroid癌变沃纳综合症(32),与经典的形成在端粒DNA损伤病灶(22]。相结合,这些信号级联导致诱导细胞凋亡、自噬和/或衰老有选择性地在肿瘤细胞(13,19,27,28];而在正常细胞导致瞬态细胞周期阻滞,DNA修复能力的提高和适应性分化19,21,23,25- - - - - -27,30.]。互补的,无关的,或者炒寡核苷酸相对积累在细胞核中,但不会引起DNA损坏信号或影响增长,分化或恶性肿瘤细胞的生存11,13,15,19,21,24,27,28]。

因为T-oligo-induced转录因子p53、p73 E2F1已知影响内皮细胞(EC)生存、分化和增殖在肿瘤血管生成(12,33,34),因为阻塞血管生成将是一个额外的T-oligos抗癌作用机理,我们问是否T-oligo治疗抑制肿瘤血管生成。我们现在报告T-oligo抑制血管生成在人类黑色素瘤细胞系MM-AN咄咄逼人,来自一个转移性黑色素瘤35),通过减少生产和分泌proangiogenic因素在肿瘤细胞和ECs。,T-oligo治疗减少的总数量和功能(灌注)肿瘤血管旁边MM-AN SCID小鼠细胞经过两个注射系统。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

人类微血管内皮细胞(HMVECs)和人类脐静脉内皮细胞获得(通过传代形成细胞通道2,通过使用4 - 6。细胞被维护在EGM-2介质的边后卫+ 2%生长因子(子弹工具包)(Cambrex生物科学、Walkersville、MD)。人类黑色素瘤MM-AN和EP细胞(35)是在修改鹰的培养基培养(MEM) (Mediatech, Inc .,位于弗吉尼亚州赫恩登)补充了胎牛血清(的边后卫2%),小牛血清(CS) 8%, antibiotic-antimicotic。人类乳房腺癌(MCF-7)和卵巢腺癌(OVCAR3)细胞培养和维护根据写明ATCC建议。所有的细胞都孵化 有5%的公司2。

2.2。寡核苷酸

我们使用16-base 100%端粒序列相同器官 -GTTAGGGTTAGGGTTA - 和磷酸二酯骨干。寡核苷酸合成的米德兰认证试剂(米德兰,TX),然后从2毫米稀释股票在决赛中获得40的浓度 M。

2.3。定量实时聚合酶链反应(存在)

MM-AN, EP, MCF-7 OVCAR3细胞生长在相应的媒体与稀释剂或40和治疗一次 M T-oligo。存在,我们执行一个逆转录反应然后放大所述特定基因(36]。E2F1 mRNA表达水平进行评估,ANG-1, ANG-2。使用的序列如下:E2F1前进:CGGTGTCGTCGACCTGAACT, E2F1相反:AGGACGTTGGTGATGTCATAGATG, E2F1探针:TGCCGAGGTGCTGAAGGTGCAG;ANG-1转发:CAGAAAACAGTGGGAGAAGATATAACC ANG-1逆转:TGCCATCGTGTTCTGGAAGA ANG-1探针:CAACATGGGCAATGTGCCTACACTTTC;ANG-2转发:GGCTGGGCAATGAGTTTGTC ANG-2逆转:CCCAGTCCTTCAGCTGGATCT;ANG-2探针:ACCGGTCAGCACCGCTACGTGC。

2.4。情况变化分析(EMSA)

细胞治疗与稀释剂或40 M T-oligo收获0 1 16和32小时后治疗。emsa进行描述(10使用共有5] 克每车道核蛋白质。分析是使用E2F1的共识序列和HIF-1执行 转录因子(圣克鲁斯生物技术,CA)。证实了乐队使用的特异性 25岁或 50的冷调查竞争对手和寡核苷酸突变控制。作为额外的负控制,核提取物孵化与特定竞争E2F1抗体之前添加放射性(32寡核苷酸P-labelled)共识。

2.5。免疫印迹分析

细胞治疗T-oligos,收获在不同时期,snap-frozen,储存在 。细胞总蛋白质分离和50 克总蛋白免疫印迹分析处理所述[10]。抗体反应进行以下抗体:anti-E2F1 (Neomarkers, Inc ., Fremont, CA), anti-VEGF-A (sc - 507,圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA)承认所有VEGF-A亚型,和anti-VEGF-R2(一种礼物从纳德博士拉希米,眼科学、生物化学、波士顿大学医学院)。

2.6。VEGF酶联免疫吸附试验(ELISA)

人类VEGF免疫(Quantikine、研发系统、明尼阿波利斯、MN)被用来比较VEGF的释放到介质ECs和MM-AN细胞。每个细胞都在其合适的培养基培养和治疗与稀释剂或T-oligo (40 米)。条件培养基收集在24日,48和72小时后治疗和冻结 直到处理ELISA。执行的分析是根据制造商的协议(研发系统)。盘子是阅读使用Tecan光谱模型96标(MTX实验室系统,弗吉尼亚州维也纳)。

2.7。Tubulogenesis化验

200年 L(基底膜基质基底膜矩阵(酚红免费)(BD生物科学,贝德福德,MA)每4室添加幻灯片并允许为1小时固化 。HUVECs(50000细胞)在500年被添加到每个室 L中所描述的37]。细胞治疗与稀释剂在电镀的时候,40岁 米、80 ,或120 T-oligo M。一些细胞治疗40 M的T-oligo postplating退一次2小时,当时tube-formation首先可以检测到相位显微镜。一些细胞治疗与40个的两倍 M T-oligo收到第三个治疗镀后6小时。Tube-formation在大量观察和拍摄时间点从后2小时和24小时的治疗。值得注意的是,在控制油井管状结构形成之后,他们保持完整的72小时(数据未显示)。Image-Tool(圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心,圣安东尼奥,TX)软件是用来量化管状结构的长度。

2.8。入侵检测

入侵的BioCoat人工基底膜室(BD生物科学,贝德福德,MA)是用于此试验。MM-AN细胞治疗与稀释剂或40 M T-oligo和媒体收集72小时后,基于ELISA (MM-AN条件媒体)的数据。条件MM-AN介质被用作化学引诱物的测定。ECs MM-AN细胞种植在插入(心房)和允许通过基底膜基质入侵和附着在膜中描述制造商的协议。入侵后评估22小时通过染色Diff-Quick(费舍尔,亚特兰大,佐治亚州)平分膜室的底部(包含入侵细胞)中描述的制造商的协议。值得注意的是,我们相信任何影响ECs或MM-AN入侵不能归咎于残留活性T-oligos条件培养基,扩散到参议院和杀死MM-AN细胞,因为在血清中T-oligos迅速退化。的半衰期为12 bp测量端粒同族体4 - 6小时(38],16-base T-oligo也因此呈现在中估计有72小时的训练后(1/2)12或107倍不到最初的治疗浓度。

2.9。SCID黑色素瘤侧面异种移植模型

所有的研究由波士顿大学IACUC委员会批准。 MM-AN细胞皮下注入6周大的侧面SCID小鼠(宾夕法尼亚州费城福克斯蔡斯癌症中心)。每治疗组小鼠(5 - 6)通过尾静脉注射与T-oligo或稀释剂仅当肿瘤第一次明显的(2 - 3毫米直径)。肿瘤大小记录每2 - 3天在整个实验过程中使用电子卡尺和所有动物牺牲肿瘤接种后4周。诊断黑色素瘤组织学检查证实的部分每个结节穿过中心的临床肿瘤。

2.10。量化的肿瘤微血管密度

所有的研究由波士顿大学IACUC委员会批准。 MM-AN细胞皮下注入6周大的侧面SCID小鼠(宾夕法尼亚州费城福克斯蔡斯癌症中心)。每治疗组小鼠(5 - 6)是通过尾静脉注射T-oligo独自或稀释剂(60 nmol /注入,15毫克/公斤)当肿瘤第一次明显的(2 - 3毫米直径)。肿瘤微血管密度(MVD)在一分为二的评估两个全身注射后24小时T-oligos通过使用两个EC-specific标记CD31 (PECAM-1) [12),Bandeurea simplicifolia(BS) 1凝集素共轭罗丹明(向量实验室,伯林盖姆,CA) (39]。测量功能在肿瘤组织中MVD,牺牲前30分钟一组老鼠每治疗组(5)灌注是麻醉和0.5毫克(100年 l的等渗溶液)Rhodamine-conjugated BS-1凝集素(描述40,41]。测量总MVD, 6 m截面一分为二的肿瘤组织(相同的灌注小鼠BS-1凝集素)和CD31染色主要抗体紧随其后FITC-labelled二级抗体(描述12]。样品拍照时使用多色荧光显微镜(尼康,尼康仪器公司,梅尔维尔,纽约),使用数字图像分析系统和分析(尼康)。黑色素瘤的诊断是在肿瘤的组织学检查确诊结节。

2.11。统计分析

方差分析与事后分析,矫正和Bonferroni-Dunn和未配对t以及进行使用StatView (SAS研究所,Inc .) 5.0版)。建立了统计学意义 。

3所示。结果

3.1。T-oligo治疗减少血管生成因子的表达和水平,降低VEGF释放到MM-AN细胞培养基

MM-AN细胞治疗后仅与T-oligo或稀释剂,提供新鲜培养基,为免疫印迹分析和处理。稀释剂相比,T-oligo降低VEGF蛋白水平在24小时( ) 41%在48小时内( ) 32%(数据1(一)和1 (b))。此外,48小时后T-oligo治疗减少ANG-1 mRNA ( ) 60%(图1 (c))和ANG-2 mRNA ( ) 45%(图1 (d))。类似的降低VEGF(补充数据 (一)- (c)和ANG-1(补充数据 (一)- (c)) mRNA在第二个人类黑色素瘤行EP,以及其他恶性肿瘤细胞类型。

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图1
μ μ μ T-oligo治疗下调VEGF的表达、Ang-1 Ang-2和降低VEGF生产MM-AN细胞。MM-AN细胞治疗一次0时刻与40米T-oligo独自或稀释剂。(一)免疫印迹分析VEGF蛋白水平。(b)的光密度分析VEGF蛋白水平(后加载调整对肌动蛋白表达)表示为时间0水平的百分之一。图形表示汇集数据(平均±SEM)从三个独立的实验。(c)和(d)定量真正time-PCR(存在)的MM-AN细胞治疗40米T-oligo独自或稀释剂。结果给出了百分比的时间0(设定在100%)和检查控制和T-oligo-treated细胞超过48小时。ANG-1基因表达。(c) ANG-2基因表达。(d)这些实验重复两次有类似的结果。(e) MM-AN细胞治疗40米T-oligo独自或稀释剂。培养基是收集后24、48和72小时。累积VEGF蛋白释放到介质通过ELISA测定。结果表示数据集中从一式三份菜肴为每个时间点和治疗条件。随时间变化的百分比计算24小时值(为100%)。

搭配菜肴MM-AN和ECs治疗40 M T-oligo或稀释剂仅一次。媒介收集后24、48和72小时和VEGF水平在中被ELISA测定。ECs (HMVEC HUVEC),有一个 50% - -75%的变量和统计减少无意义的VEGF释放到介质在稀释剂——随着时间的推移和T-oligo-treated细胞(数据没有显示)。相比之下,VEGF总释放MM-AN细胞diluent-treated菜逐步上升超过72小时 VEGF水平的600%(24小时),而VEGF在T-oligo-treated菜肴是减少( ) 30%后72小时实验单一剂量在时刻0(图1 (e))。因此,T-oligo不仅降低VEGF蛋白表达在肿瘤细胞也释放到周围培养基强有力的血管生成因素。

3.2。T-oligo上调E2F1基因表达、蛋白质含量和DNA结合活性和降低血管生成的DNA结合活性转录因子HIF-1

在24小时E2F1 mRNA表达增加( ) 41%在48小时内( ) 100% T-oligo-treated MM-AN细胞相比,控制(图2(a))。类似的增加E2F1 mRNA出现在第二个人类黑色素瘤行EP,以及其他恶性肿瘤细胞类型(补充数据 (一)- (c))。T-oligo治疗也增加了E2F1蛋白水平在24小时 218%,在48小时内 286% ( )控制的值(数字2(b)和2(c))。此外,有一倍E2F1 DNA结合活性治疗后32小时相比diluent-treated细胞(数字2(d)和2(e),比较巷3和4)。




图2
α μ ± ± × ( ) α × 32 α 32 α α T-oligo治疗HIF-1增加表达E2F1 /活动和减少在MM-AN细胞DNA结合活性。细胞治疗40米T-oligo独自或稀释剂,在不同时期收获。(一)考察了颗粒中存在E2F1 mRNA水平,显示为0百分之一的时间(平均水平SEM) 2单独的实验一式三份。(b)丸也研究了通过免疫印迹分析E2F1蛋白水平。肌动蛋白表达作为一个内部加载控制。(c)的光密度分析E2F1蛋白表达后加载调节肌动蛋白,表示为时间0水平的百分之一。结果集中的数据(的意思SEM)从三个独立的实验。(d)的DNA结合活性E2F1被EMSA分析。没有区别E2F1 DNA结合活性检测治疗组之间在16小时(巷1和2),但E2F1 DNA结合活性翻了一番T-oligo细胞治疗在32小时(巷3和4)。证实了特异性的乐队preincubating T-oligo-treated细胞的核内蛋白收获在32小时25冷探测器(巷4和5)和supershift E2F1蛋白/ DNA和E2F1抗体竞争复杂(4和6巷)。(e)量化乐队的DNA结合活性强度表示为相对密度部件(RDU)为治疗组在治疗后16和32小时。E2F1 EMSA重复了2次得到了类似的结果。f核蛋白质从细胞分离和加工情况转变HIF-1化验(EMSA)评价DNA结合活性。证实了特异性的乐队preincubating核蛋白质提取的细胞治疗32小时的稀释剂25冷探测器(没有标签P)和突变HIF-1共识序列核提取物在孵化前20分钟寡核苷酸P-labeled共识。HIF-1EMSA重复了2次得到了类似的结果。(g)的光密度分析蛋白质/ DNA HIF-1复杂的乐队画是相对密度测量单位(RDU)。

MM-AN细胞治疗一次独自T-oligo或稀释剂和核蛋白质收获了32小时治疗后评估血管生成的转录因子HIF-1 DNA结合的活动 。有 HIF-1下降80% - -95% DNA结合活性在治疗后1和16个小时(数字2(f)和2(g),车道3和4、5和6)。这些数据表明,T-oligo-mediated HIF-1 DNA结合活性的抑制 转录因子有助于减少血管生成因子的表达,VEGF和ANG-1的推动者包含HIF-1结合位点 (42]。

3.3。T-oligo抑制基底膜基质由黑色素瘤细胞入侵和ECs

我们使用MM-AN中收集了72小时后添加T-oligo独自或稀释剂(MM-AN条件媒体:T-oligo厘米或稀释剂厘米)作为一个体外的化学引诱物入侵检测(43]。MM-AN和HMVECs都评估入侵通过基底膜基质来确定T-oligo MM-AN细胞治疗减少了化学引诱物的性质。作为基底膜基质入侵的制造商推荐的装备,经过22个小时的孵化入侵细胞被固定的,染色和计算膜。上面镀MM-AN细胞T-oligo厘米了 96%减少入侵( )通过人工基底膜(数字3(一个)和3 (b))。HMVECs镀上插入涂层与基底膜基质和暴露于T-oligo厘米了 在基底膜基质入侵控制相比减少40%,但这并没有达到统计学意义( )(数据3 (c)和3 (d))。这些发现表明T-oligos减少迁移/入侵MM-AN细胞对化学引诱物的刺激,可能从一个较小的程度上影响HMVECs。这是符合观察MM-AN细胞复杂的因素,促进肿瘤细胞的迁移和入侵,VEGF和ANG-1等,这些因素(s)是减少由于T-oligo治疗。

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图3
μ ± ± T-oligo治疗抑制基底膜基质MM-AN细胞和HMVECs入侵。MM-AN细胞治疗40米T-oligo独自或稀释剂。72小时后的培养基收集。条件培养基收割72小时后用作MM-AN入侵检测的化学引诱物和HMVECs。镀MM-AN细胞插入和允许22小时穿过膜上的孔的底部插入介质在众议院,解释为凝胶的入侵。实验中插入了一层基底膜基质,而控制插入(图中未显示)没有。22小时后细胞穿过膜的微孔是固定的,染色和拍照。(一)代表MM-AN细胞显示图像。小圈是膜的微孔开放,没有细胞。(b)细胞的总数统计3膜为每个治疗条件和细胞的数量(用图表表示的意思治疗组的SEM)。实验重复两次相同的结果。(c)代表图片为MM-AN HMVECs当作描述上图所示。小圈是膜的微孔开放,没有细胞。(d)的总数HMVECs被数3膜为每个治疗条件和画的平均数量为每个治疗组细胞(的意思SD)。实验重复两次相同的结果。减少接触,但没有达到统计学意义。
3.4。T-oligo治疗降低VEGF的表达和VEGFR-2内皮细胞

因为VEGF信号通过VEGFR-2主要负责电子商务的生存、增殖、迁移和血管生成44- - - - - -47),我们检查T-oligo治疗这些蛋白质的影响。40 HMVECs和HUVECs种植和处理 M T-oligo独自或稀释剂。相比diluent-treated控制细胞减少( ) 86%在24小时内VEGF表达,一个微不足道的减少 50%在48小时T-oligo-treated样本(数据4(一)- - - - - -4 (c))。此外,在T-oligo-treated HMVECs和HUVECs 29% ( ), 59% ( )减少蛋白质水平VEGFR-2 24和48小时,分别为(数字4 (d)- - - - - -4 (f))。因此,对ECs T-oligo-mediated反血管增生的影响,在某种程度上,由于抑制VEGF-VEGR2轴。

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图4
μ T-oligo降低VEGF和VEGFR-2蛋白质含量在正常内皮细胞。HMVEC和HUVEC治疗40米T-oligo独自或稀释剂和免疫印迹分析收获超过48小时。(一)在HMVEC VEGF蛋白表达。在这里和其他地方的肌动蛋白表达是用来调整加载。(b)在HUVEC VEGF蛋白表达。(c)相结合的光密度分析VEGF表达HMVEC和HUVEC的百分之一时间0水平,加载后调整。(d) VEGFR-2 HMVEC蛋白表达。(e) VEGFR-2蛋白表达和HUVEC, (f)结合光密度分析,如(c)。
3.5。T-oligo抑制EC函数体外Tubulogenesis化验

HMVECs镀在基底膜基质在血清中4室的幻灯片,用稀释剂单独或T-oligo浓度增加。管状结构形成最大控制在22小时,正式的比较是2-22小时后,照例为这个试验(39]。22小时,在细胞治疗40 或80 M T-oligo有 平均管长度减少19%相比,细胞单独处理稀释剂( )(数据5(一个)和5 (b))。细胞治疗两种不同剂量的40岁 M T-oligo镀和电镀2小时后显示 管长度(平均减少35% )。细胞治疗在镀120 M T-oligo显示 相比减少58%平均管长度diluent-treated细胞( )。减少 83% ( 管长度)是细胞中观察到3单独处理剂量的40岁 M T-oligo (40 米 3)添加到介质在电镀的时候然后在2和6小时(数字5(一个)和5 (b))。这些结果表明,T-oligo抑制电子商务功能的方式依赖于剂量和频率管理,但需要说明的是,管理大量的寡核苷酸,而不是特定telomere-based T-oligo启动信号可能是导致观察到的影响。在未来的实验中,我们计划检查的影响大的和/或分数T-oligo剂量对ECs的生存。

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图5
体外抑制EC tubulogenesis T-oligo治疗。镀HMVEC细胞基底膜基质在四级室幻灯片和治疗仅在一式三份T-oligo或稀释剂,所述的文本。(一)所有代表图像被镀22小时后细胞室,最大差异治疗的时间条件。(b)管状结构的长度被量化为总平均每视野管长度从3分离室为每个治疗条件。管状结构的长度的差异量化(像素)至少3 - 5个具有代表性的照片/室/治疗条件使用计算机辅助图像分析。
3.6。系统性管理T-oligo减少肿瘤血管生成和血管开放在SCID小鼠体内异种移植模型

在黑色素瘤肿瘤接种到SCID小鼠,我们确定的系统性T-oligo注入对黑色素瘤血管生成的影响评价功能和肿瘤组织中总血管密度(每组5老鼠)。当肿瘤成为显而易见的(2 - 3毫米直径,接种后第五天到14)我们注入T-oligo (60 nmol /注入,15毫克/公斤)通过尾静脉(IV)和注射后6小时,然后收获第二T-oligo肿瘤后24小时内注射。代表肿瘤截面的图像应用辨认所有船只以及功能(专利)船只T-oligo注射后24小时(图6(一))。相比control-injected老鼠不止 减少80% ( (图)在功能性血管T-oligo-injected老鼠6 (b))。还有多 减少60% ( (图)总血管T-oligo-injected老鼠6 (c))。这些数据证实了我们的体外研究结果(数据4和5),证明两种T-oligo系统性政府减少体内肿瘤血管生成和血管开放(数字6(一)- - - - - -6 (c))。

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图6
μ × T-oligo减少黑色素瘤肿瘤血管生成和肿瘤体积在鼠标SCID异种移植。6 (a)代表图像m肿瘤截面和CD31应用(绿色)和TopRo-3 (blue-nuclei)和体内灌注BS-1凝集素(红色),来确定肿瘤微血管密度(MVD)大功率领域(高通滤波器)40放大。功能性和总在5 /组小鼠血管检查。箭头表示CD31(+)血管被认为非功能性(不包括)而箭头表明双(+)BS-1凝集素/ CD31血管被认为是功能(包括体内)。(b)百分比功能血管(red-BS-1凝集素染色)T-oligo注入老鼠,MVD在车辆注入小鼠100%。(c)百分比总血管(green-CD31染色)T-oligo注入老鼠,MVD在车辆注入小鼠100%。(d) SCID小鼠注射MMAN细胞到侧面。T-oligo或车辆每日注射5天当肿瘤第一次明显的(2 - 3毫米直径)。平均肿瘤体积/动物被记录在4周5 - 6老鼠/组。

确定系统性T-oligo治疗黑色素瘤生长的影响,在SCID异种移植模型中MM-AN细胞被注入皮下注射在侧面。当肿瘤成为显而易见的(2 - 3毫米直径,第五天14),接收到的老鼠每天系统性注射T-oligo (60 nmol /注入,15毫克/公斤报价)或车辆仅5天。控制动物,肿瘤体积的增加从6.96 2.9毫米3在6到88.04天 19.72毫米327天(图6 (d)蓝线)。相反,在T-oligo对待动物的肿瘤是相同的大小控制在6(6.48天 2.57)很少有肿瘤的生长通过15(6.48天 2.57与9.92 3.8毫米3),此后较慢和统计无关紧要的体积增加到29.65 10.47毫米3白天27(图6 (d),粉色线)。因此,在T-oligo-treated小鼠肿瘤生长抑制( ) 53%, 4周,实验时终止。这些数据表明,系统性T-oligo管理只有5天持续对黑色素瘤的生长抑制作用。我们也评估T-oligos毒性在几个内部器官SCID小鼠持续静脉注射后24小时(15毫克/公斤收购5天)。没有系统性毒性观察到骨髓、肝、肠、脑、肺和肾脏T-oligo-injected小鼠(数字7(一)- - - - - -7 (f))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图7
T-oligos毒性评估内部器官SCID小鼠持续静脉注射后24小时(15毫克/公斤收购5天)。(一)骨髓,显示骨髓和红细胞前体细胞以及浆细胞。分散megakeryocytes也存在。目前没有证据表明骨髓抑制或中毒。(b)肝小叶中央静脉周围的肝细胞。细胞显示一个固定工件否则出现正常。目前没有证据表明细胞坏死或凋亡。(c)空肠粘膜显示绒毛道路两旁高大的柱状细胞的正常安排。黏膜和黏膜下层出现正常。正常胰腺腺泡的组织碎片是在图像的左下角。 (d) Section of the brain showing normal brain architecture with typical neuronal ganglia and scattered small dark glial cells in a pink neuropil background. (e) Normal lung tissue displaying multiple alveoli as well as bronchioles lined with cuboidal epithelial lining. (f) The kidney displays two normal glomeruli that are surrounded by tubules with cuboidal epithelium.

4所示。讨论

肿瘤血管生成对肿瘤的生长和转移至关重要(1]。没有活跃的肿瘤血管生成直径很少超过2 - 3毫米(1,48]。血管生成是通过释放血管生成因子介导肿瘤细胞和肿瘤间质细胞和微环境包括,但不限于,内皮细胞(48]。我们现在报告,端粒同族体寡核苷酸(T-oligos)减少血管生成因子的合成和释放ECs和黑色素瘤细胞,抑制EC tubulogenesis和阻碍黑色素瘤细胞和ECs入侵矩阵(人工基底膜)。此外,系统性管理T-oligos减少体内肿瘤血管分布。

EC迁移、增殖和分化都是肿瘤血管生成的基本过程(1]。EC扩散、体外tubulogenesis和生存都是已知的在很大程度上刺激VEGF (49]。降低VEGF水平或抑制受体激活ECs经常与肿瘤大小和转移潜力下降(50]。VEGF结合的细胞外域VEGFR-1 (Flt-1)和VEGFR-2 (Flk-1),诱导受体二聚作用和激活自身磷酸化的酪氨酸激酶,导致血管生成,血管通透性增加,和EC细胞增殖和生存49]。人们普遍认为VEGFR-2是这些影响的主要中介51]。我们发现T-oligo减少的表达VEGFR-2 HMVEC和HUVEC(数字4 (c)和4 (f))。其他研究者报道,受体酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)舒尼替和达沙替尼等减少通过RAF MEK / ERK信号通路激活的血管受体配体结合像VEGFR-2 PDGFR - 、FH-3和c - kit (52),间接抑制肿瘤的生长,影响肿瘤血管生成(52]。通过减少VEGF-R2水平,T-oligos似乎也有类似的效果。

VEGF也诱导肿瘤血管内泄漏,使肿瘤细胞渗透到血管和迁移到血液中53]。因此,在肿瘤形成早期血管生成因子的变化甚至可以影响转移和扩散53)和抑制VEGF生产T-oligos预计将减少肿瘤细胞的转移潜力(53]。此外,肿瘤内部血管通透性的增加可能会干扰适当的交付和保留的化疗药物54,55]。事实上,某些抗血管新生药物,防止肿瘤血管渗漏(这种现象被称为“血管正常化”)被证明提高化疗药物进入肿瘤的交付(56]。因此,与传统化学治疗药物联合治疗和抗血管新生因子在一起可能优于单独使用后者。此外,由于VEGF可能ECs的迁移和招聘所需,T-oligo-me diat VEGF降低也可能减少血管肿瘤(1,6]。我们目前的研究结果表明,T-oligos可能诱发有效的抗血管新生作用,增强其吸引力作为癌症的治疗选择。

除了VEGF及其受体,检验1和2 (ANG-1和ANG-2)及其酪氨酸激酶受体Tie-2被确认为增长和改造过程的主要参与者的肿瘤脉管系统(57,58]。ANG-1激活Tie-2信号通路(58]。虽然在某些情况下ANG-2可能抑制ANG-1效应,在体内的黑色素瘤小鼠模型(59和神经胶质瘤细胞60)增加ANG-2认为刺激血管生成的表达式。另一个血管生成因子,HIF-1 由缺氧激活的转录因子,对其效果通过上调VEGF水平。我们发现抑制HIF-1 T-oligo治疗 活动和ANG-1 ANG-2黑色素瘤细胞系中表达,减少在这些细胞分泌VEGF合成,强烈建议T-oligo-mediated对肿瘤血管生成的影响转录并最终影响一些血管生成分子。

我们实验室曾表明T-oligo增加p73水平零MM-AN细胞,阻断p73 p53表达的RNAi T-oligo-induced减少细胞凋亡在这些细胞(11]。p53、p73抑制血管生成,主要通过VEGF下调(34]。因此,我们假设在MM-AN细胞T-oligo降低VEGF生产,除了影响HIF-1 ,通过激活p73 E2F1的感应。然而,与功能性细胞p53,我们假设T-oligo-induced p53和p73配合抑制血管生成。此外,已知E2F1对p73部分诱导细胞凋亡的影响。因此,感应T-oligos E2F1的(11也会导致肿瘤细胞凋亡。E2F1据报道,由主动调节(磷酸化)自动取款机61年]。我们曾表明T-oligo治疗激活(磷酸化)自动取款机21,27]。此外,E2F1子包含E2F1的结合位点(62年]。因此我们建议T-oligo调节E2F1首先通过ATM-mediated E2F1的磷酸化61年)和E2F1然后进一步转录上调E2F1通过绑定自己的启动子。事实上,我们表明,T-oligo增加E2F1信使rna和蛋白质含量以及其在人类MM-AN黑色素瘤细胞DNA结合活性,进一步证实了我们之前发现E2F1contributes T-oligo效应(11]。

本实验中使用的T-oligos生理容易hydrolysable磷酸二酯键,例如与反义DNA phosphorothioate或其他nonhydrolyzable链接是用来增加分子的半衰期(t1 / 2)。要求可水解的连接发起T-oligo信号(22),尽管已知的半衰期短,大约4 - 6小时血清中12 bp 100%端粒同族体(38),不过这允许细胞反应现在和之前的实验中观察到的进化在3 - 5天(11,13,19,21,22,24- - - - - -28]。这可能反映了一个事实,至少在体外T-oligos迅速进入核(11,22,24,27),一旦进入细胞核,这些寡核苷酸更长半衰期(63年]。这些自动的疗效短暂T-oligos也可能反映的可能性,在互动的寡核苷酸Werner蛋白质和DNA损坏的形成焦点在端粒22),通过DNA损伤反应信号通路可能继续即使T-oligos水解,至少在48小时的时间仍然可以通过免疫组织化学方法观察DNA损伤病灶(22]。

在早期的研究中,我们已经表明,T-oligos抑制肿瘤生长在SCID小鼠模型通过诱导细胞周期阻滞、分化、凋亡、衰老(13,15,27]。我们现在也表明T-oligos抑制血管生成。血管生成抑制包括ECs和黑色素瘤细胞,结合其他T-oligo-mediated抗肿瘤的作用11,13,22,25,27),可能将显著减少黑色素瘤负担SCID小鼠模型建立,在我们之前的出版物报道(13,27]。这些多种多样的反应都是通过激活介导和/或upregulation DNA损伤反应的蛋白质。从而让人想起不复杂但很好细菌SOS反应特征,genome-protective机制增强了原核生物的生存面对DNA损伤(14]。telomere-based DNA损坏信号由T-oligos可能被视为一个进化完善并联机构地址在哺乳动物细胞恶性转化带来的威胁基因组完整性(64年]。

总之,本文表明T-oligos施加多个抗血管新生的影响。这些数据之前加强证据表明T-oligo疗法可能提供了一个强大的新方法来治疗人类原发性黑色素瘤和其他可能的人类恶性肿瘤,与几个概念优势目前久负盛名的靶向治疗方法(64年]。

的利益冲突

方面本文的专利保护和授权SemaCo Inc .)一家营利性公司。Gilchrest博士和博士Yaar节在SemaCo股东。

确认

c·科尔曼和d·莱文了同样的纸。c·科尔曼目前隶属于新英格兰和丹尼尔·莱文,大学的医学博士哈佛大学医学院皮肤学居民。这项工作是支持由美国国立卫生研究院CA10515(袋)和美国皮肤学会(DL)。

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