缺乏Y型染色体补体在妊娠滋养细胞肿瘤的多数

摘要

摘要妊娠滋养层肿瘤(GTNs)是一组由绒毛膜癌、胎盘部位滋养层肿瘤(PSTTs)和上皮样滋养层肿瘤(ETTs)组成的罕见肿瘤。由于这些肿瘤是胎儿滋养细胞组织的衍生物，大约50%的GTN病例可能来自男性，并根据性别比例平衡携带y染色体补体。为了研究这一假设，我们利用三种独立的性染色体遗传标记对51例GTN大样本进行了全面的基因分型分析;酪蛋白原、蛋白激酶和锌指蛋白有X和Y同系物，它们的PCR产物大小可以区分。我们发现所有病例都含有x染色体，而51例肿瘤中只有5例(10%)含有y染色体。具体来说，在19例绒毛膜癌中检测到1例(5%)、15例PSTTs中检测到1例(7%)和17例ETTs中检测到3例(18%)y染色体信号。有y染色体者的组织病理学特征与无y染色体者相似。我们的结果表明GTNs中存在y染色体补体，尽管只有10%的病例存在。GTNs中y染色体补体的缺失可能会强化这一观点，即绝大多数GTNs来源于之前的磨牙妊娠。

1.简介

妊娠滋养细胞肿瘤（GTNs）代表发展为从胎儿来源的组织一semiallograft人类肿瘤的一组独特的[1]。GTNs最初被认为是一组由滋养细胞肿瘤转化引起的同质性疾病。然而，最近的临床病理研究表明，至少有三种不同类型的GTNs，包括最常见的类型，绒毛膜癌，以及不常见的胎盘部位滋养层肿瘤(PSTTs)和上皮样滋养层肿瘤(ETTs)。已经有人提出GTNs由滋养干细胞(推测为细胞滋养细胞)发育而来，GTNs的分化模式概括了胎盘发育的早期阶段[1]。根据这种观点，绒毛膜癌是由可变数量的肿瘤细胞滋养层，合体，和绒毛外（中间）滋养层，类似其由滋养细胞亚群的相似混合物的previllous胚泡的。相反，在PSTTs赘生性细胞滋养细胞分化成主要绒毛外（中间）滋养层细胞;而在气管内导管区分肿瘤细胞滋养细胞成绒毛膜型绒毛外（中间）滋养层细胞。根据这个模型，绒毛膜癌是最原始的滋养细胞肿瘤，而PSTTs和气管导管相对较多区别。

在临床上，绒毛膜癌是一种高度恶性的上皮性肿瘤，由任何妊娠事件的滋养层细胞引起，通常为完整的葡萄胎[2]。患者处于生殖年龄，有异常的阴道出血和偶尔的远处转移的迹象。镜下，主要由单核滋养细胞和合胞滋养细胞的双相增殖组成，并伴有明显的出血和坏死[3.]。随着现代化疗的出现，绒毛膜癌患者目前的总生存率接近100% [4尽管有些病人发展为不可手术和化疗耐受的复发性疾病。与绒毛膜癌相比，PSTTs和ETTs少见[5- - - - - -7]。与绒毛膜癌一样，PSTTs和ETTs也发生于育龄妇女，表现为闭经或异常出血[5,7,8]。PSTTs和ETTs虽有深部肌层侵犯，但多数病例均得到成功治疗[2]，但约10％-15％是临床上恶性，并有一个致命的结果。组织学上，PSTTs的特征在于质量或中间滋养细胞类似于植入部位中间滋养细胞的片材，而气管导管的特征在于正常的植入部位和胎盘的绒毛膜型中间滋养层。除了独特形态学特征，既PSTTs和气管内导管的特征在于独特的基因表达模式，这表明PSTTs和气管内导管的分子发病机理是不同的[9]。

包虫囊状的物质的量(10,11是许多GTNs病例的先兆病变。以往的临床病理和分子研究为葡萄胎的发病机制提供了基本的见解，但GTNs的分子和细胞基础仍不清楚。如果性染色体在GTNs的形成中没有作用，那么有和没有y染色体的GTN病例的数量应该是相似的。相反，超过85%的PSTTs患者经病史记录或基因分析发现有女性妊娠史。此外，最近的一项利用造釉素分析的研究表明，在一小组pstt中存在x染色体和Y染色体的缺失[12]，提高的Y型染色体互补物可用于PSTTs被优先删除的可能性。在本文中，我们描述了我们在PSTTs较大数量的调查结果，以及其他类型的GTNs，包括绒毛膜癌和气管导管。此外，与使用单个标记以前的研究中，我们一共有三个遗传标记包括常用的釉原蛋白检查。这些基因具有可以通过聚合酶链式反应，使用特异性引物对，以检测ÿ等位基因的存在（PCR）产物大小加以区分X和Y同系物。

2.方法

2.1。组织标本

从美国约翰霍普金斯医院病理部门的档案文件中检索了51个GTNs的石蜡组织。大多数标本是寄给两位作者的会诊病例(R. J. Kurman和I. M. Shih)。我们回顾了苏木精和伊红染色的组织标本，并由一位专家妇科病理学家(I. M. Shih)确认了特定类型的GTNs的诊断。标本包括15例PSTTs, 17例ETTs和19例绒毛膜癌。所有的标本都是匿名的，因此没有获得临床信息。组织收集是按照机构审查委员会的规定进行的。石蜡切片上的肿瘤区域与周围苏木精染色组织切片上的正常(母体)组织仔细分离。基因组DNA使用Formapure试剂盒(Agencourt, Cambridge, MA)制备。除了从两个单独的组织块中纯化DNA的五种情况外，选择了一个有代表性的组织块进行DNA提取。

2.2。基因分型使用性染色体特异性遗传标记

GTNs中是否存在X染色体或y染色体是通过分析三个基因来确定的，这些基因具有X和y染色体同源物，这些同源物可以通过特定引物组的PCR产物大小来区分;AmelogeninX和Y（AMELX和AMELY）蛋白激酶X和Y（PRKX和PRKY),锌指X和Y（ZFX和ZFY)。该釉原蛋白基因有位于Xp22.1-22.3 X和Y同系物（AMELX)及Yp11.2 (amee），其使用引物对分化的放大的内含子1的区域跨越了6个碱基对的缺失AMELX相比于amee。使用可商购AmpFlSTR探查盒（Applied Biosystems，福斯特城，CA）进行分析釉原蛋白。热循环条件和毛细管电泳是根据制造商的说明进行。简言之，PCR条件为95℃11分钟，接着94℃28个循环，1分钟，59℃1分钟，和72℃进行1分钟，然后是最终的延伸在60℃45分钟。扩增后，毛细管电泳进行了使用1 l多重PCR产物，与9去离子化甲酰胺/基因扫描500 (ROX)大小标准(应用生物系统)。样品在95℃变性2分钟后，使用ABI3100基因分析仪(Applied Biosystems)进行分析。

虽然基于性别基因，性染色体检测已经在基础研究和法医学被频繁使用，高基因组不稳定的肿瘤进行分析时，用于检测Y染色体的假阴性结果已经证明[13]。因此，我们分析有X和Y同源两个额外的基因。的PRK基因的X和Y同源位点位于Xp22.3 (PRKX)及Yp11.2 (PRKY分别)。的PRKYgene is located approximately 0.35 Mb centromeric toamee。为了区分PRKX和PRKY中，我们设计成的AMPLIFY外显子8的PCR反应PRKX和PRKY使用跨越三碱基对缺失的引物集(表)1)[14]。的PRKY扩增产物比短三个碱基PRKX产品。的ZF基因的X和Y同源位点位于Xp22.1 (ZFX)及Yp11.2 (ZFY),分别。ZFY端粒大约有3.9 Mbamee。为了区分ZFX和ZFY中，我们设计成的AMPLIFY外显子3的PCR反应ZFX和ZFY的基因，与该引物组还跨越3个碱基对的缺失。在这种情况下，ZFX产品短3个碱基ZFY产品。进行PCR扩增，引物序列见表1。2分钟后，每94 3个循环，1个循环的95℃℃30秒，64°C，61°C，或58℃进行30秒，和70℃：使用触协议反应热循环30秒。这之后35个循环的94℃30秒，57℃30秒和70℃30秒，并进行5分钟，1个循环的70℃。如上所述产物通过毛细管电泳进行分析。

3。结果与讨论

共有51个GTNs进行组织学综述，包括19个绒毛膜癌，17个气管内导管和15个PSTTs（表2)。这些样品的，ETT17包含绒毛膜癌的一个小区域和PSTT15包含焦点ETT组件。所述GTNs的代表性组织学特征在图中示出1。所有病例在用于性染色体基因分型的至少一种基因标记中都产生了有用的结果。我们发现所有提供信息的病例都包含x染色体的补体，而在51例肿瘤中只有5例(10%，95% CI: 18.2%-1.8%)具有Y染色体的补体(见表)2)。具体来说，在19个绒毛膜癌中检测到1个(5%)，15个PSTTs中检测到1个(7%)，17个ETTs中检测到3个(18%)(表)2)。数字2说明代表性标本的基因型。值得注意的是，从同一病例的不同组织块中获得的基因组DNA的基因型是相同的。对于那些带有Y染色体的标本，尽管Y基因相对于X基因的相对丰度有所不同，但所有三个基因标记都显示出一致的结果。例如，PSTT5在两者中都显示了一个小的Y峰釉原蛋白和ZF个位点，可以使Y分配模棱两可（图2)。然而,通过分析PRKY我们清楚地检测稳健PRKY来自同一样品达到峰值。同样，ETT12包含一个相对较小的釉原蛋白Ÿ峰值却不得不在两个显著大峰PRKY和ZFY。这些结果表明的那放大对福尔马林固定的石蜡组织和下划线的重要性三种基因的不同基因座Ÿ以包括另外的标记物来评估的Y染色体元件的存在引物的可变效率。与Y染色体的肿瘤组织病理学特点是从那些没有Y染色体没有什么区别。显示ÿ峰的病例百分比列在表3.。

大多数GTNs缺乏y染色体的补充是有趣的，有几种理论可以解释这一现象。最可能的原因是y染色体缺失对肿瘤进展没有功能影响[15]。在这种情况下,没有Y染色体gtn可能只是反映了一个事实,许多gtn开发从完整包虫囊状的摩尔数的大约90%包含46个染色体组型,XX由于一个“空”的卵子受精(没有核)由一个单倍体精子(23 x)其次是单倍体基因组复制(10,11]。因此，从完全性葡萄胎发展GTNs保持相同的性染色体分配作为他们的前体和不怀有Y染色体。而完成了90％葡萄胎从monospermy出现时，约10％是由于有两个精子空卵子受精。的，从dispermy出现这些情况的一半，预计将携带Y染色体。因此，可以预见，完全性葡萄胎，以及它们产生的绒毛膜癌，大约5％的人携带Y染色体，而这正是我们在本研究中获得的百分比。

虽然以上是我们最喜欢的观点，但也应该指出其他的解释。y染色体缺失可能在GTNs的发育过程中具有功能暗示。除了雌性概念人的滋养细胞产生的GTNs外，我们可以推测，雄性概念人的滋养细胞产生的GTNs还会进行y染色体缺失的滋养细胞的克隆选择，原因是其潜在的基因组不稳定性。在这两种情况下，我们都假设y染色体的存在与肿瘤的发生不相容，可能是由于位于y染色体上的基因产物具有潜在的生长抑制作用。支持这一概念的是观察到的一个小而明确的Y峰amee,PRKY和ZFY在ETT17中(图)2)。在几种类型的人类癌症包括前列腺癌，肾细胞癌，急性早幼粒细胞白血病，头颈部鳞状细胞癌[此外，以前的报告已经表明Y染色体丢失15- - - - - -18]。

最后，其他研究中y染色体检测的缺失可能是由于分析的y染色体区域微缺失，造成假阴性结果。这种技术缺陷在实体肿瘤中已经被很好地记录下来，当基于氨源的分析被应用[13]。为了克服这个问题，在这项研究中，我们已包括两个额外的基因标记，PRK和ZF，以及标准的阿米原试验。类似于Amelogenin(阿梅尔)轨迹,PRK，和ZF基因具有位于Xp上的X和Y同系物(PRKX和ZFX)及Yp (ZFX和ZFY)。的PRKY和ZFY是位于3.9 Mb端粒到amee和0.35 Mb的着丝粒amee,分别。以检测任何Y染色体的三种基因的失败导出更明确的结论，并表明不存在Y染色体的是不太可能因体细胞微缺失或在GTNs的Y染色体相关基因座的微卫星不稳定性。

间51个GTNs分析，我们根据Y峰中的至少一个的存在检测ÿ等位基因在五个肿瘤amee,PRKY和ZFY位点。这5个肿瘤中有一个PSTT。这一发现与之前的一份报告形成了对比，该报告显示13个pstt中没有一个存在amee(12]。这种差异可能是由于样本量较大和本研究中使用了额外的Y标记。目前研究的结论也与我们之前的报告不同，我们之前的报告显示，大约一半的PSTTs和ETTs包含Y染色体上的性别决定区Y (SRY) [19]。在该研究中，为了检测来自石蜡组织的有限的基因组DNA来源，使用了高循环数的PCR扩增，提高了污染物非特异性扩增的可能性。因此，我们认为，目前的研究结果在确定GTNs的性染色体分配方面更为明确。

综上所述，本研究在使用特定引物对的情况下，使用了在X和y染色体上具有不同PCR产物长度的三个独立基因标记，对所有类型GTNs的性染色体分布进行了全面分析。基于相对大量的病例，我们的结果清楚地表明，在绒毛膜癌、PSTTs和ETTs中存在明显但低的y染色体补体，占总病例的约10%。GTNs中Y染色体补体的缺失很可能仅仅是由于其前体病变的遗传基础，完整的葡萄胎，其中大多数病例的基因型为XX [20.]。总之，我们的研究结果表明，大多数GTNs都是由前期完全葡萄胎，其中许多可根据公认的早期完全性葡萄胎通常缺乏特征性病理特点之前。

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