以鲜明的体外属性有平等的体内效力胰腺癌抗EPHA2抗体

摘要

EphA2受体酪氨酸激酶在多种人类上皮癌中过表达，是胰腺腺癌细胞恶性细胞行为的决定因素。此外，它在肿瘤内皮细胞中表达，其激活可促进血管生成。为了更好地阐明针对EphA2受体的单克隆抗体(单克隆抗体)的治疗潜力，我们利用寡核苷酸芯片技术通过噬菌体抗体库的差异筛选产生了大量单克隆抗体，并实施了一种快速识别具有期望特性的抗体的策略。我们在人胰腺肿瘤细胞系MiaPaCa2上选择了两种体外性质不同的高亲和力、高特异性的EphA2单克隆抗体。一种是有效的EphA2激动性抗体IgG25，可促进受体内吞和随后的降解;另一种是配体拮抗剂IgG28，可阻断与ephrin A1的结合，并与小鼠EphA2受体交叉反应。我们测量了抗体处理对原位移植的MiaPaCa2细胞生长的影响。IgG25和IgG28均具有较强的抗肿瘤和抗转移作用。体内使用IgG25检测肿瘤中EphA2蛋白水平的降低和Tyr576上FAK的磷酸化，而使用IgG28检测肿瘤切片中CD31的免疫组化分析结果显示，使用IgG28检测肿瘤血管化程度的降低。这些数据表明，在胰腺癌模型中，通过促进受体降解或阻断受体激活可获得相似的治疗效果。

1.介绍

Eph受体是一个独特的受体酪氨酸激酶(RTK)家族，在胚胎发育和人类疾病中发挥关键作用[1]。Eph受体的配体，称为肝配蛋白，结合至细胞膜，并参与细胞用于配体 - 受体相互作用的细胞接触。

弗 - 肝配蛋白复合物可产生同时影响受体表达和配体表达细胞[双向信号2，3]。Eph受体“向前”信令依赖于酪氨酸激酶结构域，其介导自磷酸化和其他蛋白质的磷酸化，并与各效应蛋白的关联。肝配蛋白配体触发“反向”通过与其他蛋白质的关联的信令。Eph受体信号传导已经牵涉于细胞 - 细胞的排斥和粘附，组织图案形成，和血管生成[4]。

EphA2在不同类型的癌症中过表达，包括胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌[五，6]。然而，尽管与恶性表型EphA2受体表达的较强的相关性，通过该EphA2的促进肿瘤细胞恶性肿瘤的机制是远不清楚[4-6]。一些证据表明，EphA2受体磷酸化是没有必要赋予激酶活性和致瘤性[7，8]或者甚至是肿瘤抑制[9]。其他数据表明，EphA2受体磷酸化在赋予致癌潜力[重要10-12]。不仅肿瘤细胞，而且肿瘤内皮表达的EphA2的较高水平，这表明肿瘤细胞内和在周围的肿瘤微环境对受体具有作用[10，13]。

的EphA2的反义寡核苷酸或单克隆抗体（mAb）膜结合的受体反转乳腺和胰腺腺癌细胞的生长[诱导蛋白体靶向降解14，15]。类似地，最近的研究显示，在人胰腺癌的异种移植物模型中抑制肿瘤的血管生成可溶性的EphA2-Fc受体的效力[11]。因此胰腺肿瘤细胞似乎对EphA2的由不同的机制靶向敏感。

本工作的目的是产生来评估在胰腺肿瘤靶向的EphA2的治疗潜力的单克隆抗体。我们已经开发出模拟天然配体和激活受体信号传导的抗体而另一个与配体从而阻断两者“向前”和“反向”信令竞争。获得的数据表明，在胰腺癌的抗肿瘤活性，可以实现用不同的机制靶向的EphA2。

2。材料和方法

2.1。细胞系和克隆

人胰腺的MiaPaCa2，神经2A（的N2a），和HEK293是根据规格从美国典型培养物保藏中心获得，并且培养。鼠标表达EphA2的结肠癌细胞系MC38-CEA先前已经描述[16]。为了生成以可诱导方式表达EphA2的稳定HEK293细胞系，293 / EphA2的，所述人EphA2的cDNA（NM_004431）中的溶液自Origene全长克隆克隆进可诱导的表达载体pCEPTetO-MCS。将所得的载体携带的CMV启动子的cDNA的hEphA2下游。CMV启动子是由TETO盒之前，允许在多西环素诱导的EphA2表达。稳定转染通过潮霉素选择293个EBNATet细胞克隆[17]和EphA2表达通过FACS分析16小时多西环素诱导的后确认。人全长cDNA的重组反应克隆EPHA1，EphA2的，和EPHA5（Origene公司），EphA3的，和EphA7的（Invitrogen公司和多种载体，RESP。）转移至pcDNA-DEST40载体（Invitrogen）。人全长的cDNA的EphA4（开放Biosystems公司）亚克隆到pENTR1A和通过重组反应转移至pcDNA-DEST40矢量。N2A细胞系使用Lipofectamine 2000转染，按照制造商的说明。

2.2。抗EPHA2单克隆抗体的选择

Panning of the tagged 4 k Mbr phage-Ab library was performed on induced and not-induced 293/EphA2 as described [18]。细胞与孵育噬菌体。经过广泛的洗涤，细胞结合的噬菌体洗脱，并用于感染TG1细胞。收集氨苄青霉素抗性的细菌菌落和噬菌粒DNA纯化。标签序列通过PCR扩增，用Cy5或Cy3的染料标记，并且在杂交混合物组装。图像通过Agilent扫描仪采集，并使用特征提取软件（V 9.1，安捷伦科技）处理。如所述进行相关联的所选择的标签和scFv转化成IgG的1类scFv的救援[18]。

2.3。抗EPHA2单克隆抗体的表观KD测定

MiaPaCa2细胞（3) were incubated with antibodies or ephrinA1/Fc ligand (R&D Systems) in PBS 1% BSA, 10 mM HEPES (FACS buffer) then binding was revealed by APC-conjugated anti-human Fc antibody (Jackson ImmunoResearch). FACS acquisition and analysis were performed using FACSCanto (Becton Dickinson) and BD FACSDiva software. Mean Fluorescence Intensity (MFI) values were analyzed by Sigma-Plot software. For competition experiments, MiaPaCa2 cells were incubated in FACS buffer with increasing concentrations of the antibodies; then the ligand ephrinA1/Fc labeled with Zenon Alexa Fluor 647 IgG labeling kit (Invitrogen) was added at saturating concentration (30 nM).

2.4。细胞和肿瘤裂解物的Western印迹分析

Approximately 50–100 mgs of frozen tumor were lysed in Mixer Mill MM300 homogenizer (QIAGEN) for 2 minutes in TPER buffer (Pierce) supplemented by 0.5 uM okadaic acid (Calbiochem), protease inhibitor cocktail (Roche), and Halt phosphatase inhibitor cocktail (Pierce). After overnight (ON) starvation, MiaPaCa2 cells were incubated 2 hours in complete medium and 15 minutes with Ctrl IgG, IgG25, or IgG28 (10 克/毫升）和肝配蛋白A1-Fc的（5 g / mL)。细胞在TPER缓冲液中裂解，10min。三十 克和50 每个细胞和肿瘤裂解物的车道克，分别装载，转移至硝酸纤维素，并且用下面的初级抗体进行探测：抗EphA2，（Santa Cruz Biotechnology公司），抗FAK（Upstate公司），抗FAKpY⁵⁷⁶（矿泉），抗Akt（Cell Signaling Technology公司的猫。9272），抗phosphoAkt（Cell Signaling Technology公司），以及抗phosphoERK（Santa Cruz公司）。二级抗体是抗兔的IgG HRP稀释（皮尔斯公司）或抗小鼠HRP（Promega）中。图像通过发光图像分析仪LAS 3000获取的，然后通过MultiGauge 2.2版本软件（FUJIFILM科学）进行定量。为了验证等效采样加载，将印迹剥离并再次探测的肌动蛋白(NeoMarkers)。

2.5。EphA2的免疫沉淀

将细胞按Ctrl IgG、IgG25或IgG28孵育(10)克/毫升）和肝配蛋白A1-Fc的（5 g/mL) 20分钟和用于在5分钟时。细胞裂解物孵育于at用涂有抗EphA2抗体的蛋白G琼脂糖珠（GE Healthcate）（Santa Cruz公司; 0.8 克/样品）。将细胞重悬于SDS上样染料洗涤的珠。回收的蛋白通过Western印迹用抗的pTyr 4G10抗体（Upstate公司）进行分析。剥离过滤器后，用抗-EphA2抗体检测。

2.6。EphA2的内化测定

细胞首先在预冷在HBSS缓冲液中10分钟，在孵育然后30分钟with IgG25, IgG28, and ephrinA1-Fc (at 1, 0.2 and 0.5 ug/mL, resp.). Cells were then shifted at分别为0、30、60和90分钟，在2%多聚甲醛中RT固定15分钟，用抗人IgG Alexa A647标记(Invitrogen公司)。二抗用渗透缓冲液(0.1% Triton; 1mg /mL PBS)稀释。赫斯特被用作核标记。在细胞分析仪1000上采集图像。每口井获得4个油田，产量为20口倍率和内化通过使用多目标分析算法计算每个细胞的阳性囊泡的数量来衡量。

2.7。在体内效力研究

雌性无胸腺裸鼠（哈伦）5周龄维持按照指南的护理和使用实验动物（自2008年1月IRBM与全AAALAC认证授予）。70％-80％汇合的收获MiaPaCa2细胞，洗涤，并再悬浮在PBS中细胞/ mL。Mice were anesthetized under isofluorane inhalation, pancreas was exposed by an abdominal flank incision, and 50 uL of cell suspension were injected subcapsularly in a region of the pancreas just beneath the spleen. Biweekly i.p. treatment with 2 mg/kg of IgG25, IgG28, or Ctrl IgG started 24 hours postcell inoculation. Mice were euthanized at day 35 and tumors were excised, weighed, and either frozen in liquid nitrogen or fixed for immunohistochemistry.

2.8。IgG抗体定量小鼠血清

小鼠血清收集IgG单次给药后1小时、8小时、24小时、48小时、96小时、192小时、12天、16天、22天，时间为50克，分别放于涂有抗人IgG（Bethyl公司）ELISA板。纯化的人IgG用作标准。山羊抗人IgG HRP偶联物（Bethyl公司）加入以显示人抗体。Absorbance at 450 nm was measured with Safire (TECAN).

2.9。免疫组化

肿瘤固定在10％缓冲福尔马林中并包埋在石蜡中。五 米切片机切片在二甲苯被清除和再水合，所述揭露程序是在抗原进行检索溶液（DAKO S1699），为40分钟，然后洗涤，并用1.5％山羊血清和1％Triton的PBS 20分钟RT。抗CD31抗体（Pharmingen公司）的溶液中加入在ON和结合物揭示了与温育30分钟RT的抗鼠抗体（VECTOR实验室）。信号用ABC试剂盒（Vector实验室）扩增。切片用Herris'苏木精复染，然后脱水并安装有Entellan（默克公司）。在三个不同的层次在肿瘤三段/样品通过的AxioVision软件（Zeiss）对分析。CD31阳性面积在每个整体部分测量。

2.10。统计分析

应用学生的数据进行统计分析-测试。与学生同方差相关概率- 试验，用双尾分布，被认为是显著时0.05。在体内分析抗肿瘤作用时，我们首先使用方差分析(ANOVA)评估是否存在组效应，并拒绝组与总体均值之间无差异的原假设(= 0.001）。然后，我们用一个先验的对比分析进行，评估处理是否从控制不同，彼此不同。

3.结果

3.1。选择与表征抗EPHA2单克隆抗体

我们最近开发出一种tagArray技术，使抗体的快速识别出库（Membranome噬菌体显示的抗体与肿瘤细胞系膜上表达的受体结合[18]。HEK293细胞在多西环素诱导型启动子（293 / EphA2的）和未诱导的相匹配的细胞系中表达的EphA2被用作选择平移库。通过这种方法选择30个特异性克隆并转化成完全人IgG类1.本策略生成主要其绑定到的EphA2构象表位，因为他们没有认识到蛋白的变性形式的mAb（未示出数据）。

单克隆抗体的特异性通过结合本地的EphA2证实只有在受体表达强力霉素诱导显示在293 / EphA2的。的表观Kd通过FACS在对人胰腺细胞系的MiaPaCa2只有高亲和力的抗体的全细胞结合测定筛选测定（KD单个数字纳米）。接着，对抗体的选择性，用市售的cDNA编码EPHA1，EphA2的，EphA3的，EphA4的，EPHA5，和EphA7的N2a细胞的转染后决定的，其次是全细胞结合测定法和FACS分析。少数抗体显示一定程度的交叉反应性对EphA4的和被丢弃（数据未示出）。

为了鉴定激动剂单克隆抗体，治疗MiaPaCa2细胞的随后用抗EphA2抗体和Western印迹用抗pTyrosine免疫沉淀后测定的EphA2的磷酸化水平。然后的mAb与肝配蛋白A1-Fc配体在全细胞结合测定竞争测定。这种筛选漏斗导致了两种抗体，IgG25和IgG28，其特征总结在图的识别1:两种抗体均与受体高亲和力结合，igg25kd = 1.3 nM, igg28kd = 1.5 nM(图)图1（a）)。When tested on the mouse EphA2-expressing colon cancer cell line MC38-CEA, only IgG28 showed high affinity cross-reactivity to the murine EphA2 receptor Kd = 1 nM (Figure图1（b）与IC50 = 0.89 nM的ephrinA1-Fc配体具有竞争性(图)图1（c）)。IgG25触发受体磷酸化以可比较的方式相对于该配位体，而IgG28不诱导受体磷酸化（图1（d）)。最后，如前面提到的，这两种抗体选择性地结合到EphA2和不承认家族的其他受体（图1（e）中)。

IgG25和IgG28的属性以诱导受体内在化和降解通过使用盒内1000荧光显微镜和成像，并通过与在不同时间MiaPaCa2细胞温育后总细胞裂解物的Western印迹分析研究。类似于肝配蛋白A1配体，IgG25迅速诱导的受体内化导致圈点通过内体途径染色典型内化（图图2（a））和EphA2的70％以上，4小时后被降解，如由Western印迹分析（图图2（b）和图2（c）)。IgG28呈典型的膜染色（图图2（a））和未触发受体降解（图图2（b）和图2（c）)。

3.2。体外mab依赖通路在胰腺肿瘤细胞中的激活

与肝配蛋白A1-Fc的，IgG25，和IgG28并用15分钟的同种型IgG对照温育后调查MiaPaCa2细胞的EphA2下游信号，总的萃取液通过的pERK和的pAkt的Western印迹进行分析。正如预期的那样，由于由该细胞系窝藏突变体K-RAS，ERK1和Erk2的两者都组成型磷酸化，并且信号强度与配位体或任何mAb的处理后没有改变（图3)。有趣的是，我们发现在IgG25和配体ephrinA1处理后Akt磷酸化水平出现了温和且可重复的下降，而IgG28处理并没有改变Akt的磷酸化水平(图)3)。这些数据表明，在MiaPaCa2细胞线索，EphA2受体激活的PI3激酶通路的下调。IgG25和IgG28对对MiaPaCa2细胞的增殖没有影响，因为通过生存力测定（ViaLight）或BrdU掺入（数据未示出）测量，尽管我们已经表明，在体外和IgG25诱导其已知是促细胞凋亡生物化学变化的配位体。

据报道，EphA2受体能与FAK，生长因子信号传导，细胞存活，和细胞迁移的重要介质直接交互。因此FAK信号是与IgG25，IgG28，肝配蛋白A1配体，和15分钟，在同种型IgG对照孵育MiaPaCa2细胞研究。在免疫沉淀两种分子的抗体后，没有检测到FAK与EphA2的关联(数据未显示)，也没有观察到FAK磷酸化水平的下降。相反，如图所示3中，当将细胞用IgG25和肝配蛋白A1 FAK被磷酸化上Tyr576孵育，IgG28 MiaPaCa2细胞上的结合不诱导FAK磷酸化。这些数据表明，EphA2的激酶活化需要实现FAK的磷酸化酪氨酸上576。

单克隆抗体依赖的通路活化的确认这两个EphA2的抗体具有体外功能相反的行为的结果，IgG25是激动剂，模仿天然肝配蛋白A1配体，而IgG28是EphA2的正向信令的拮抗剂。

3.3。单克隆抗体在MiaPaCa2原位肿瘤异种移植模型中的抗肿瘤和抗转移作用

每种抗体和它们的组合的效果的体内抗肿瘤特性进行了研究，人胰腺癌的小鼠异种移植模型。Ten mice orthotopically implanted with 1 million MiaPaCa2 cells into the pancreas were treated biweekly with 2 mg/kg of IgG25 and IgG28 alone or in combination. A control group was treated with the same dose of an isotypic human IgG1. Dosing schedule was established on the basis of preliminary mAb pharmacokinetic analyses in mice. Terminal half life of 144 and 72 hours was measured for IgG25 and IgG28, respectively (Figure图4（a）)。这种差异可能是由“代谢库”由于IgG28结合至小鼠受体进行说明。重复剂量每72小时，两种抗体的波谷水平仍然需要受体饱和的浓度如上所述，通过用mAb施用后血清中取出孵育72小时MiaPaCa2细胞的FACS分析证实（数据未显示）。植入小鼠后三十五天进行安乐死，肿瘤加权，和转移后尸检计数。在图中所示的数据图4（b）和图4（c）证明IgG25和IgG28两者诱导的原发肿瘤的重量和在转移灶数目强烈降低（平均50％）。这些数据在统计上显著要么应用时- 试验分析（IgG25= 0.002;IgG28= 0.018），或应用使用ANOVA（一个更复杂的分析，当看到材料和方法），从该我们的结论是，治疗组与对照组不同确实（= 0.0004），但在两个IgG的处理之间没有观察到差异（= 0.28）。

值得注意的是，在研究期间，给予对小鼠EphA2受体交叉反应的IgG28并没有导致任何接受治疗的动物体重减轻或临床症状。联合使用IgG25和IgG28并不能抑制肿瘤生长或转移的数量(数据未显示)。

在的EphA2在血管发生中的作用的光[11，19，20，也监测了IgG25和IgG28对肿瘤血管化的影响。通过CD31免疫染色，对石蜡包埋的肿瘤切片进行定量免疫组化(IHC)分析，以评估对照组和治疗小鼠肿瘤的血管系统水平(图)图5（a）)。结果显示，与未治疗的对照组相比，在接受IgG28治疗的肿瘤中，CD31阳性染色百分率有中度但统计上显著的下降(= 0.04）（图图5（b）)。

这些数据首次表明EphA2信号转导选择性拮抗剂对胰腺癌有治疗作用。

3.4。在肿瘤中的EphA2表达

当外植的，连续的mAb施用后35天，肿瘤块仍然抑制由治疗的肿瘤相对于对照的较低的重量所揭示的增长。为了获得关于两种抗体的抗肿瘤特性的基础的机制的信息，来自控制和处理的小鼠的肿瘤样品进行上EphA2的下调和对EphA2的相关信号传导分子的激活研究。在肿瘤裂解物的EphA2表达的总水平是由Western blot分析评估。

如图6，IgG25给药相比未治疗的肿瘤引起的EphA2受体水平的剧烈下降（平均70％）（= 0.0005），与以前有什么对EphA2激动抗体的报道一致。相反，与IgG28处理的肿瘤显示，EphA2受体水平有一定程度的变异，但与未处理对照无统计学差异显著（= 0.22）。

为了排除这种可能性，所述由于改变转录水平或从mAb处理的选择压力而产生的EphA2阴性细胞群体减少在IgG25治疗的肿瘤表达水平可能是，EphA2的mRNA表达通过qPCR肿瘤裂解物进行定量，但不同组之间检测到转录物的量没有变化（数据未显示）。

3.5。单抗的治疗对EphA2的信号在体内影响

为了确定抗体治疗对体内EphA2受体下游通路的影响，我们测定了对照和治疗小鼠肿瘤裂解液中Akt、Erk和FAK的表达和磷酸化水平。在total和pErk水平上没有观察到变化(数据未显示)，它们在体内被组成性激活，正如之前在体外观察到的那样。与在培养细胞中观察到的不同，Akt只在未治疗的肿瘤中被较差地激活，但在IgG25治疗的小鼠的肿瘤中，磷酸化水平平均增加了2倍(= 0.005），虽然统计学显著更温和1.6倍（= 0.04），其与IgG28处理的肿瘤（图7)。最后，这两个IgG25和IgG28能够平均上Tyr576（分别在FAK磷酸增加3倍，以诱导。= 0.005和= 0.013）（图7)。还从在培养的MiaPaCa2细胞，其中IgG28治疗没有诱导FAK磷酸所观察到的该后一观察的不同（图3)。

4。讨论

为了研究在胰腺癌模型具有不同的功能特性的两种单克隆抗体已被选择和表征的EphA2受体的作用。

本研究的一项新发现是鉴定了一种高亲和力单克隆抗体IgG28，该抗体对EphA2具有选择性，并与小鼠受体交叉反应，该受体可阻断人上皮细胞和小鼠内皮细胞上表达的ephrinA1配体与EphA2的结合。当小鼠原位移植胰腺MiaPaCa2肿瘤细胞时，IgG28抑制肿瘤进展和转移形成，并导致肿瘤血管生成减少(图)4和五)。此外，持续使用IgG28阻断小鼠EphA2受体与研究期间的明显毒性无关。观察到的对肿瘤血管的抑制作用与之前的研究一致，即使用可溶性EphA2/Fc受体作为受体拮抗剂阻断内源性EphA2信号传导[11，19，20]。与高选择性IgG28抗体不同，可溶性EphA2受体可随意与不同ephrin配体相互作用，阻断肿瘤内皮中EphA受体的多种信号通路。因此，这种治疗方法的确切靶点尚不明确。相比之下，使用选择性拮抗剂可以集中研究EphA2受体在体内肿瘤进展中的作用。

将拮抗抗体IgG28的效力与激动性抗体IgG25进行比较，IgG25在EphA2激活和降解的效价和动力学方面与ephrinA1-Fc配体相似(图)2)。的任一在对MiaPaCa2肿瘤的异种移植模型中的两种抗体的施用的抗肿瘤功效是可比（图4)。矛盾的结果已经报道了抗体，在一些上皮性肿瘤减少的EphA2表达的影响。具有很强的抗肿瘤活性已被使用诱导受体磷酸化，随后的内化和降解[激动性抗体报道14，20]。与此相反，激动性抗体已经显示不抑制乳腺癌和结肠癌肿瘤异种移植物的生长，尽管在肿瘤的EphA2的强烈下调[21]。在这里，我们确认IgG25其触发受体激活和下调能够抑制胰腺移植模型的增长。

EphA2激动抗体通过还原一般是由所提供的信号被认为功能受体 - 配体结合，但在大多数癌细胞由于不良的受体 - 配体相互作用[丢失22]。为了表征培养的MiaPaCa2细胞与所述抗体治疗的应答​​，已经进行了许多体外研究。这些细胞怀有突变的K-Ras和显示的pErk的组成型活化，其暴露于肝配蛋白A1或所述激动mAb，IgG25后不改变。最近的研究表明，EphA2的是的直接转录靶物Ras-RAF-MAPK途径和EphA2的信号传导有助于负反馈回路中的配体依赖性方式调节Ras活性[23]。相反，最近在胰腺细胞系的另一项研究显示，EphA2的激活对MiaPaCa2细胞Erk磷酸化的刺激作用弱[24]。这些差异的解释并不明显，但应该指出的是，细胞培养，血清饥饿和配体孵育时间的不同状况可能导致这一结果的可变性。

无论肝配蛋白A1和IgG25减少pAKT水平（图3)。这一观察结果与先前在MiaPaCa2细胞上的数据形成对比，Chang等人发现，在MiaPaCa2细胞上，随着EphA2的激活，Akt磷酸化水平升高[24]，但与最近发表的模型一致，其中PI3K-Akt的的Ras-RAF-MAPK途径的组成型活化的存在EphA2受体介导的负反馈抑制[25]。此外，ephrinA1和IgG25可诱导Tyr 576上的FAK磷酸化(图)3），证实在NIH3T3细胞中，并在PC3前列腺癌细胞[已经观察到的26，27]。这是需要注意的重要，然而，经常对比数据报告对ERK，Akt和FAK通过EphA2的信号是上下文相关的，不连贯的画面已经是最新的，在这类复杂网络的弗依赖性肿瘤进展中的作用[1]。

当我们比较信令从与在对MiaPaCa2获得的那些的抗体处理的培养的MiaPaCa2细胞获得相对于EphA2的数据肿瘤从延长抗体给药后，我们观察到几个不符动物移出。不同于在体外观察到了什么，与IgG28治疗的肿瘤表明FAK的Tyr 576磷酸化。Akt的，其在培养的细胞显示出组成性活性的基础水平，代替不是在未治疗的肿瘤磷酸化但在抗体治疗变得激活。有人可能会猜测，与抗体长期治疗后观察到的生化特征是细胞适应的结果。因此，正在进行的研究主要集中在肿瘤细胞的抗体治疗的早期反应的调查。

数据表明，向IgG25的抗肿瘤功效的最显着的相关成分是受体下调。这表明，由EphA2的表达的减少来实现的机制可能是不相关的胰腺肿瘤的小鼠中的生长抑制。事实上对肿瘤生长也已经报道由显著影响siRNA介导的敲的EphA2表达的减量[15]。相反，对于IgG28的抗肿瘤作用的最可能的相关成分是在肿瘤中降低的血管发生。缺乏在两种抗体的共同施用的任何添加剂的治疗效果可能是由于对肿瘤受体下调，其结果在生长抑制的中和反作用活性。

虽然目前的工作展示了单克隆抗体的有效性作为解剖工具膜受体的治疗潜力目标在肿瘤发生,它也强调了需要一个彻底的体内免疫抗体疗法的调查来确定真正的药效学指标与抗肿瘤功效。

致谢

该authores感谢LAR设施，在流域综合管理为动物处理援助。他们还感谢莫罗Cerretani和Paolo Turrini与在小区1000分析仪的实验。最后，他们感谢的Emanuela Emili专家图形援助。五，葡萄柚来自拉齐奥大区（法国社会的Fondo欧洲人2000- 2006年）六个月的奖学金获得者。

参考

1. M. Lackmann和A. W.博伊德，“弗，蛋白质家庭时代的到来：更多的混乱，洞察力，或复杂”科学信号卷。13，第1-16页，2008年。查看在：谷歌学术搜索
2. E. B.帕斯夸莱，“Eph受体信号传导使人对细胞行为宽网，”自然评论卷。6，第462-475，2005。查看在：谷歌学术搜索
3. E. B. Pasquale，《生理学和疾病中的双向信号传导》，细胞第133卷，no。1, 38-52页，2008年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
4. A. Merlos-Suarez和E. Batlle，“ev -ephrin信号在成人组织和癌症中的作用，”当前细胞生物学意见卷。20，第194-200，2008。查看在：谷歌学术搜索
5. R. C.艾尔顿和J.臣“EphA2受体酪氨酸激酶作为用于癌症治疗有希望的目标，”目前癌症药物靶点卷。5，没有。3，第149-157，2005。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
6. J. Wykosky和W. Debinski，《实体肿瘤中的EphA2受体和EphrinA1配体:功能和治疗靶向》分子癌症研究卷。6，没有。12，第1795至1806年，2008年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
7. " MCF-10A-NeoST:研究乳腺癌中细胞- ecm和细胞-细胞相互作用的新细胞系统"，临床癌症研究卷。7，没有。11，第3640-3648，2001年。查看在：谷歌学术搜索
8. J.沃克 - 丹尼尔斯，D.J.雷斯II，和M. S.金赤，“C-CBL依赖性EphA2蛋白降解是通过诱导配体结合，”分子癌症研究，第1卷，no。1，第79-87页，2002。查看在：谷歌学术搜索
9. H.郭H.苗，L Gerber等人，“EphA2受体酪氨酸激酶线索中断易感性增加在小鼠皮肤癌变，”癌症研究第66卷，no。14, 7050-7058页，2006。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
10. K. Ogawa, R. Pasqualini, R. A. Lindberg等人，“ephrin-A1配体及其受体EphA2在肿瘤新生血管形成过程中表达，”癌基因卷。19，没有。52，第6043-6052，2000。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
11. P.多布然斯基，K.亨特和S.琼斯波林，“抗血管生成和EphA2受体拮抗剂的抗肿瘤功效，”癌症研究第64卷，no。3，第910-919页，2004。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
12. W. B. Fang, D. M. Brantley-Sieders, M. A. Parker等，" EphA2受体在促进肿瘤生长和转移中的激酶依赖性作用"癌基因第24卷第2期53，第7859-7868页，2005。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
13. H.片冈，H.五十岚，M.金森等人，“用在人原发性结肠直肠癌高微血管计数EPHA2表达的相关性，”癌症科学，第95卷，no。2，第136-141页，2004。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
14. K.卡尔斯-金赤，K. E.基尔帕特里克，J. C.斯图尔特和M. S.金赤“的EphA2的酪氨酸的抗体靶向激酶抑制恶性细胞的行为，”癌症研究第62卷，no。2002年，第2840-2847页。查看在：谷歌学术搜索
15. M. S. Duxbury, H. Ito, M. J. Zinner等人，“EphA2:胰腺腺癌的恶性细胞行为的决定因素和潜在治疗靶点，”癌基因卷。23，没有。7，第1448至1456年，2004年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
16. P. Clarke, J. Mann, J. F. Simpson等人，“人类癌胚抗原的小鼠转基因免疫治疗模型”，癌症研究第58卷，no。第1469-1477页，1998年。查看在：谷歌学术搜索
17. D. Catalucci, E. Sporeno, A. Cirillo等，“基于扩增的腺病毒5 (Ad5)包装细胞系用于生产高容量helper无关的deltaE1-E2-E3-E4 Ad5载体”病毒学杂志，第79卷，no。2005年，第6400-6409页。查看在：谷歌学术搜索
18. P. Monaci，A. Luzzago，C.桑蒂尼等人，“差通过寡核苷酸微阵列技术筛选噬菌体抗体库，”公共科学图书馆·ONE第3卷，no。1, 2008年1 - 10页。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
19. D. M. Brantley, N. Cheng, E. J. Thompson等人，“可溶性Eph A受体抑制体内肿瘤血管生成和进展，”癌基因卷。21，没有。46，第7011-7026，2002。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
20. N.程，D.布兰特丽，W. B. Fang等人，“由可溶性EphA受体VEGF依赖性多级癌变抑制作用，”瘤卷。5，没有。5，第445-456，2003。查看在：谷歌学术搜索
21. D. Kiewlich，J.章，C. Gross等人，“抗EphA2抗体降低鼠CT26结肠直肠和人MDA-231乳腺肿瘤EphA2蛋白的水平，但不抑制肿瘤生长，”瘤卷。8，没有。1，第18-30，2006年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
22. M. S.金赤和K.卡尔斯-金赤，“过表达和EphA2的酪氨酸激酶在癌症的功能改变，”临床与实验转移卷。20，没有。1期，第59-68，2003。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
23. M. Macrae, R. M. Neve, P. Rodriguez-Viciana等人，“一个条件反馈回路通过EphA2调节Ras活性，”癌症细胞卷。8，没有。2，第111-118，2005。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
24. Q. Chang, C. Jorgensen, T. Pawson，和D. W. Hedley，“达沙替尼对胰腺癌中EphA2受体酪氨酸激酶活性和下游信号传导的影响，”英国癌症杂志卷。99，没有。7，第1074至82年，2008年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
25. C. W. Menges和D. J. McCance，“构成性激活的Raf-MAPK通路导致Ras-PI3K-AKT的负反馈抑制和通过EphA2受体的细胞阻滞。”癌基因卷。27，没有。20，页。2934年至2940年，2007年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
26. N.卡特，T.中本聪，H.平井和T.亨特，“肝配蛋白A1诱导细胞骨架重新组织需要FAK和p130cas”Nature Cell Biology上第4卷第2期2002年第565-573页。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
27. M.帕里，F. Buricchi，E.詹诺尼。等，“肝配蛋白A1激活的Src /粘着斑激酶介导的运动性反应导致的Rho依赖性放线/肌球蛋白收缩力，”生物化学杂志卷。282，没有。27，第19619-19628，2007年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索

版权

©2009 Helenia Ansuini等。这是下发布的开放式访问文章知识共享署名许可，其允许在任何介质无限制地使用，分发和再现时，所提供的原始工作正确的引用。