和谐的喀斯特/ BRAF突变状态的转移性结直肠癌Anti-EGFR之前和之后的治疗

文摘

Anti-EGFR靶向治疗是一种有效的策略治疗转移性结直肠癌(mCRC),但激活突变喀斯特基因与贫穷有关应对这种治疗。因此,喀斯特突变分析是受雇于EGFR-targeted治疗病人的选择和各种研究表明高突变状态之间的一致性主要CRC和相应的转移。然而,尽管发展发生治疗相关的阻力也在小说中酪氨酸激酶抑制剂等药物的anti-EGFR治疗的效果喀斯特/ BRAF突变状态本身复发mCRC尚未阐明。因此,我们分析了21个mCRCs anti-EGFR疗法之前/之后,发现一个前置/ posttherapeutic一致性的喀斯特/ BRAF在20 21例检查的突变状态。在一个不和谐的情况下,进一步的分析显示,肿瘤镶嵌性或多个主要肿瘤存在,表明anti-EGFR疗法没有影响喀斯特/ BRAF突变mCRC地位。此外,由于病人的预选基因型anti-EGFR治疗已经成为一个标准程序,样本集这样的人我们未来的研究解决识别潜在的基础anti-EGFR疗法除了诱导基因的突变喀斯特/ BRAF突变。

1。介绍

结直肠癌(CRC)是恶性肿瘤最常见的形式之一,经常需要一个致命的课程后转移(1]。CRC是一种multipathway疾病涉及dysregulatory现象在许多信号转导途径(2]。表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶受体属于ErbB家族,在25% -80%的CRC和被发现发病机制中发挥重要作用的CRC诱导下游信号通路如phosphatidylinositol-3-kinase / Akt和Ras /皇家空军/增殖蛋白激酶(MAPK)途径,这是至关重要的在调节细胞生长,增殖,凋亡,入侵,移民和血管生成3]。因此,针对表皮生长因子受体的抗体,如西妥昔单抗和帕尼单抗,已经检查了CRC患者的治疗效果(4]。虽然是确定伊立替康联合治疗和西妥昔单抗是更成功的治疗转移性CRC (mCRC)仅比伊立替康,整体治疗联合西妥昔单抗治疗反应率小于30%,表明有逃避机制目前在许多情况下CRC (5,6]。其中,突变的基因编码的克里斯汀•鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(喀斯特)和V-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因相同器官B1 (BRAF)韦斯建立这些机制和预选的CRC患者基因型的出现提升了anti-EGFR疗法的治疗效果7,8]。因此,临床试验涉及anti-EGFR疗法现在通常与病人进行预选突变状态(9,10]。确保治疗靶向表皮生长因子受体是有效的在初级CRC以及相应的转移,各种研究已经检查的一致性或不调和喀斯特和BRAF突变主要CRC地位和相应的转移。虽然这些研究结果出现矛盾的部分,大部分的作者报告高的突变状态之间的一致性喀斯特原发性肿瘤和相应的转移(4,9,11- - - - - -16]。在我们小组最近发表的一项研究,喀斯特突变状态监测的主要肿瘤和相应的转移106例mCRC [17]。在这里,我们发现突变状态的一致性喀斯特105年106例(图1)和能够表明,唯一的不一致是由于肿瘤马赛克或共存的多原发性肿瘤(图2),这一事实有助于解释部分矛盾结果报道在过去(13,17]。此外,在类比其他类型的癌症(18- - - - - -20.),therapy-related阻力基于treatment-induced转变喀斯特和/或BRAF突变状态也可以扮演一个角色在解释低mCRC anti-EGFR治疗的治疗效果呈现肿瘤细胞最初回应anti-EGFR马伯抵抗这种治疗方案9]。

图1

喀斯特 喀斯特 2 喀斯特 喀斯特 概述的病人数据调查106年的和谐主要crc和270对应的转移syn - / metachronic转移。每一行代表一个单独的患者主要CRC和转移性表现。红酒吧展示突变阳性crc (与相应的淋巴结转移(= 42)= 26),肝转移(= 40)、肺转移(= 22),和其他网站(= 18)包括骨髓(= 6)、软组织(= 5),腹膜(= 7)。绿色的酒吧表演突变- crc (与相应的淋巴结转移(= 63)= 43)、肝转移(= 61),肺转移(= 28),和其他网站(OS) (= 32)包括骨髓(= 10)、软组织(= 13)和腹膜(= 9)。在案例# 43不同类地分化主要CRC(参见图)显示镶嵌性(红色和绿色酒吧pCRC)检测突变G12V在其他网站(操作系统,未分化的软组织和腹膜转移(红酒吧))但不是在中度分化淋巴结和肝转移(LN和李、绿酒吧)。LN:淋巴结;李:肝脏;陆:肺;操作系统:其他网站。

图2

喀斯特 喀斯特 2 喀斯特 喀斯特 喀斯特 喀斯特 形态的变化和结果突变分析的案例# 43不同类地分化CRC的镶嵌性变异G12D。在图(一)适度一半(右)和未分化的一半(左)肿瘤领域揭示积极的检测突变G12V(插图)。相比之下,只有在软组织(b)和腹膜(c)转移窝藏完全未分化肿瘤浸润的相同突变检测到((b)和(c)小图),而在淋巴结(e)和肝脏(f)与中度分化肿瘤浸润转移,没有突变被发现((e)和(f) insets)。经过显微解剖的未分化(d)和中度分化从主要CRC (g)地区突变G12V只检测到未分化的分数((d)、插图)。照片是B50显微镜(奥林巴斯,汉堡,德国)和DP50数码相机DP-Soft 5.0软件(奥林巴斯,汉堡,德国)。

2。材料和方法

49个人标本收集的21个转移性crc和相应的转移与西妥昔单抗联合疗法之前和之后使用全息检测,认证PCR / DNA测序协议(喀斯特外显子2、Gl12/13;BRAF外显子15日V600E)以及allele-specific PCR (8]。

大部分的样品分析这种方法的样品池中提取出来的106年与270年mCRC syn / metachronic转移用于我们的早期研究的一致性喀斯特突变主要地位CRC和相应的转移(17]。活检组收集前后联合西妥昔单抗治疗,即在治疗之前收集的样本来自主要crc和/或肝转移,而治疗后聚集在不同位置转移,主要是肝脏(表2)。每个CRC研究临床记录作为一个主要在结肠或直肠恶性肿瘤和转移都确认为这样的“CRC-like”免疫组织化学特征剖面(细胞角蛋白20正,细胞角蛋白7负)。pathohistological表征后,肿瘤细胞被丰富90%从4 - 10用显微解剖m片。两个独立样本每个标本培养在含有蛋白酶K裂解缓冲由列和DNA随后提取亲和色谱法(DNA试剂盒Minikit,猫没有51306)。

如前所述(执行全息17]。简单地说,DNA标记通过尼克的翻译biotin-16-dUTP(罗氏诊断,曼海姆,德国)。失活后DNase我(罗氏诊断,曼海姆,德国)等量(1g)肿瘤和参考的DNA (DIG-labeled健康新生儿的胎盘组织的DNA)在中期cohybridized幻灯片(Vysis,,)。信号是用一个蔡司Axiophot荧光显微镜与伊希斯和分析数字图像分析系统(MetaSystems, Altlussheim,德国)。

喀斯特和BRAF突变分析进行两个独立样本所有原发性肿瘤/转移使用先前描述的协议(8]。短暂,DNA被放大使用Taq DNA聚合酶(表达载体的猫。没有。10342 - 020年)和等位基因特定的引物(欧陆坊,见下表1)。Amplificates可视化在2%琼脂糖凝胶和纯化使用列亲和色谱法(从凝胶QIAquick凝胶萃取设备,试剂盒的猫。28704号)。使用PCR引物测序PCR进行(见表1)和ABI BigDye终结者v3.1循环测序rr - 100 (ABI海德堡、德国)所描述的17]。

3所示。结果

在我们的研究的第一部分,我们分析了106年转移crc至少2多病灶的syn / metachronic转移(= 270)使用PCR / DNA测序协议认证的德国社会病理学(外显子2,Glycin12和Glycin13)以及allele-specific PCR方法。如图1,我们观察到的一致性喀斯特突变状态之间主要crc和106名患者的所有105年相应的转移。然而在一个案例中(图1# 43)喀斯特突变G12V积极中度分化和未分化的主要CRC(图2()),突变检测在软组织和腹膜转移与浸润的未分化的肿瘤部分(数据2(b)和2(c)),但不是在中度分化淋巴结和肝转移(数字2(e)和2(f))。异构CRC Microdissected小分支的主要显示相应的突变镶嵌性检测喀斯特突变G12V只有在未分化肿瘤领域(数字2(d)和2(g))。

在这项研究的第二部分,我们解决这个问题,联合西妥昔单抗治疗是否会影响喀斯特在mCRC / BRAF突变状态。因此从描述样品池(图16个病人1)以及5小说病人(包括案例# 4,见下表2)遭受mCRC进行了分析喀斯特/ BRAF突变状态使用上述分子和免疫组织化学技术。

我们在此观察的一致性喀斯特和BRAF突变状态之间的样本主要crc和/或相应的转移前后联合西妥昔单抗治疗21例(表中的20个2)。第一个和最后一个抽样范围之间的时间间隔4至81个月(平均25岁8个月)和病人参与治疗的研究收到了1到5轮(平均1 8轮)在此期间。

在一个案例中之间的不和谐喀斯特联合西妥昔单抗治疗前后突变状态(案例# 4),一个突变喀斯特(外显子2基因G12D)被发现在主CRC,虽然没有喀斯特突变是观察肝转移样品获得联合西妥昔单抗治疗后(表2)。进一步分析这个病人的活检样本显示,主要的CRC采样之前治疗和肝转移显示差异不仅在他们检查后治疗喀斯特突变状态还在整体形态和基因组成(图3)。而原发肿瘤的主要群体是组织在乳头状的方式(图3(一个)),肝脏转移表现出明显的管状组织(图3 (b))。正如上面提到的,从这些标本收集microdissected样品显示不同的外显子2基因序列喀斯特基因。而突变喀斯特(外显子2基因G12D)是主要的CRC(图中观察到3 (c)),一个基因被发现在肝转移(图3 (d))。此外,比较基因组杂交进行样本显示,显示每一个不同的基因改变。相比主要的CRC(图3 (e)),肝脏转移的样本显示,染色体序列损失4和6,而收益在20号染色体观察(图3 (f))。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

图3

喀斯特 2 喀斯特 喀斯特 喀斯特 进一步分析活检的患者不和谐的突变状态前后anti-EGFR疗法(# 4,见下表)表现出不同形态之间主要CRC与乳头状组织组织(a)和肝转移与管状组织组织(b)。突变分析相应的标本展示检测突变的外显子2 Gly12D (c)在初级CRC而不突变状态在肝脏转移(d)检测到。荧光扫描和数据分析的CGH只有在肝脏转移活检,治疗后(f)而不是主CRC (e)减少荧光染色体4和6,增加20号染色体(箭头)可以看到。

4所示。讨论

发展therapy-related抵抗癌症和是一个频繁的现象也发生在小说中药物单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂等。在胃肠道间质瘤(总结),最常见的胃肠道间质瘤,甲磺酸伊马替尼耐药机制()包括新创,更频繁,可能发生获得性耐药,经过几个月的药品管理局和通常是基于c - kit和PDGFR获得第二次突变基因(18,19]。在b细胞淋巴瘤,抵抗嵌合anti-CD20单克隆抗体美罗华,第一个单克隆抗体治疗b细胞淋巴瘤已登记,建议是由于CD20表达降低,美罗华未能触发依赖抗体和补体依赖的细胞从而抑制细胞毒性(ADCC和疾控中心),以及hyperactivation凋亡信号通路如p38激酶地图,NF-kappaB, ERK1,一种蛋白激酶(20.]。

在我们的研究的第一部分,我们分析了证据确凿的群106与270年转移crc syn - / metachronic转移有关喀斯特突变状态表现出的整体一致性喀斯特突变状态在初级crc和转移在99%的情况下,站在好的检查,根据先前的报道(21]。然而,除了可能共存的二级恶性肿瘤,喀斯特突变镶嵌现象中发现一个不同类地分化CRC(# 43岁的人物1和2)可以解释不一致的结果关于这个特质在初级crc和转移之前报道12,13,22),突显出必要性勤奋的临床和组织学特征的典型肿瘤表现mCRC防止误导的结果与对anti-EGFR靶向疗法产生负面影响。

第二和主要部分的研究旨在探讨是否therapy-related电阻由于获得第二喀斯特/ BRAF突变也会发生在转移性结直肠癌anti-EGFR疗法。因此,我们分析了49个人收集的标本21 mCRC前后联合西妥昔单抗治疗。的21个病人检查在这项研究中,20显示之间的一致性喀斯特突变状态前后联合西妥昔单抗治疗,而和谐的速度BRAF是100%。在一个病人(# 4,表2),没有来自上述样品池106 mCRC,喀斯特突变前后收集的样本之间的地位是不和谐的西妥昔单抗治疗,但由于进一步分析这些样本明显不同的形态和基因特性(图3),它可能表明,癌的细胞的数量异构对野生型和突变体喀斯特可能是出现在主癌,但转移克隆是从一个吗喀斯特消极的人口,先前报道(22,23]。

这项研究的结果提供了第一个证据,次要的喀斯特/ BRAF突变不扮演重要角色在mCRC therapy-related阻力anti-EGFR抗体治疗,虽然不能排除喀斯特/ BRAF突变Glycin12/13之外喀斯特exon2存在BRAF V600E exon15以及次级电阻由于组合化疗(如大多数病人调查)负责在mCRC therapy-related抵抗。此外,由于病人的预选基因型对西妥昔单抗治疗已经成为一个标准的过程中,样本集,如本研究中使用的一个必须小心保存用于未来的研究特别是对分析解决识别anti-EGFR治疗导致基因改变除了喀斯特/BRAF突变。

确认

作者感谢太太Margrit Bonengel,问太太低平火山口,苏菲Bruggemeier太太,为专家提供技术援助和欧文施密特先生。这项研究得到了Wilhelm-Sander-Stiftung(格兰特2007.068.01)和德意志Forschungs-Gesellschaft(52岁的DFG-SFB-Transregio TPA8)。

引用

1. a . Jemal r·西格尔·e·沃德,t·默里j .徐和m·j·图恩湖,“癌症统计数据,2007年,”CA:临床医生的癌症杂志》上卷,57号1,页43 - 66,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. j . r .爵士乐”,结直肠癌:multipathway疾病”,肿瘤形成的关键评论,12卷,不。3 - 4、273 - 287年,2006页。视图:谷歌学术搜索
3. f . Ciardiello和g . Tortora”在癌症治疗药物治疗:表皮生长因子受体拮抗剂《新英格兰医学杂志》上,卷358,不。11日,第1174 - 1160页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. n a·雷诺兹和a·j·瓦格斯塔夫”,在治疗转移性结直肠癌药物,卷64,不。1,第118 - 109页,2004。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. d·坎宁安y Humblet, s锡耶纳et al .,”西妥昔单抗单药治疗和西妥昔单抗+伊立替康在irinotecan-refractory转移性结直肠癌,”《新英格兰医学杂志》上,卷351,不。4、337 - 345年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. c . s . Karapetis Khambata-Ford,彼特·d·j . et al .,“k - ras基因突变和受益于先进的结肠直肠癌,西妥昔单抗”《新英格兰医学杂志》上,卷359,不。17日,第1765 - 1757页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. 诉Boige, d .发言,j . Taieb j。Pignon, m . Ducreux“结直肠癌:预后分子标记”,Gastroenterologie倩碧等Biologique,28卷,不。1,21-32,2004页。视图:谷歌学术搜索
8. j . h . van Krieken荣格,t·基什内尔et al .,“KRAS突变测试预测响应anti-EGFR在结直肠癌的治疗:建议欧洲质量保证计划,”菲尔绍档案,卷453,不。5,417 - 431年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. s . Benvenuti a . Sartore-Bianchi f . Di Nicolantonio et al .,“致癌RAS激活/ RAF信号通路损害的反应转移性直肠癌抗表皮生长因子受体抗体疗法,”癌症研究,卷67,不。6,2643 - 2648年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. c . j .爱兰歌娜杰塞普,j·m·m·r·索莫菲尔德et al .,”美国临床肿瘤学会临时临床意见:测试转移性结直肠癌患者的KRAS基因突变预测反应抗表皮生长因子受体的单克隆抗体疗法,”临床肿瘤学杂志,27卷,不。12日,第2096 - 2091页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. f . Loupakis l . Pollina说道,即史塔西et al .,“PTEN表达和KRAS突变在原发肿瘤和转移的预测受益于西妥昔单抗+伊立替康为转移性结直肠癌患者,”临床肿瘤学杂志,27卷,不。16,2622 - 2629年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. s . Artale a . Sartore-Bianchi s . m .维罗纳人et al .,“KRAS突变和BRAF在小学和匹配的转移性结直肠癌的网站,“临床肿瘤学杂志,26卷,不。25日,第4219 - 4217页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. 托托拉岛,r . Steinert m . Hantschick et al .,“不调和k - ras基因突变在骨髓微转移和结直肠癌原发肿瘤,”临床肿瘤学杂志,19卷,不。11日,第2843 - 2837页,2001年。视图:谷歌学术搜索
14. b苏奇,c . Zietz和h . m . rab“k - ras基因点突变在人类大肠癌癌:非整倍性和转移有关,”国际癌症杂志》上,52卷,不。1,30-33,1992页。视图:谷歌学术搜索
15. f . Al-Mulla j。j, e . t . Sowden a .冬天,i r·皮克和g·d·Birnie“异质性突变体与野生型Ki-ras原发性和转移性大肠癌癌,和协会codon-12缬氨酸和早期死亡率,”病理学杂志,卷185,不。2、130 - 138年,1998页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. j . j . Oudejans r . j . c . Slebos f . a . n . Zoetmulder w . j .魔椅和s . Rodenhuis“微分ras基因的激活点突变在人类结肠癌转移到肺部或肝脏,”国际癌症杂志》上卷,49号6,875 - 879年,1991页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. s . Gattenlohner c Germer完成的,h . k . Muller-Hermelink“k - ras基因突变和西妥昔单抗在结直肠癌,”《新英格兰医学杂志》上,卷360,不。8,835 - 836年,2009页。视图:谷歌学术搜索
18. c·r·安东内斯库”,在胃肠道间质瘤靶向治疗”,在诊断病理学研讨会,25卷,不。4、295 - 303年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. ·g·s·布鲁尼,g . Apice a . r . v . Iaffaioli f . Caponigro,“胃肠间质瘤的治疗:最先进的和未来的视角,“评论最近的临床试验,1卷,不。1,35-42,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. b . Bonavida”Rituximab-induced抑制凋亡细胞的生存途径:影响化疗/ immunoresistance美罗华反应迟钝,预后和新颖的治疗干预措施,”致癌基因,26卷,不。25日,第3636 - 3629页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. d . Santini f . Loupakis b Vincenzi et al .,“高一致性的喀斯特原发性结直肠肿瘤和转移相关的网站之间的地位:对临床实践中,“肿瘤学家,13卷,不。12日,第1275 - 1270页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. c·奥利维拉,s Velho c·穆迪尼奥et al .,“喀斯特BRAF致癌突变级数在海量存储系统(MSS)中结直肠癌患者,”致癌基因,26卷,不。1,第163 - 158页,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. f . Al-Mulla j。j, e . t . Sowden a .冬天,i r·皮克和g·d·Birnie“异质性突变体与野生型Ki-ras原发性和转移性大肠癌癌,和协会codon-12缬氨酸和早期死亡率,”病理学杂志,卷185,不。2、130 - 138年,1998页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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