文摘

假设一种蛋白激酶抑制剂,perifosine(每),结合抑制剂的谷胱甘肽(GSH)和硫氧还蛋白(硫氧还蛋白)的新陈代谢将通过代谢氧化应激诱导细胞毒性在人的头部和颈部癌症(HNSCC)细胞进行了测试。每二硫化诱导增加谷胱甘肽(GSSG百分比)在FaDu Cal-27,和SCC-25 HNSCCs以及引起严重单独细胞杀死FaDu Cal-27,镇压的同时治疗(NAC)的防治作用。谷胱甘肽合成的抑制剂,buthionine sulfoximine (BSO)敏化Cal-27 SCC-25细胞PER-induced克隆细胞死亡以及减少总谷胱甘肽和增加% GSSG。此外,抑制硫氧还蛋白还原酶活性(TrxRed)金诺芬(本身)能够诱导/致敏每SCC-25细胞最初耐火材料。这些研究结果支持这样的结论,每诱发氧化应激和克隆细胞杀死HNSCC细胞增强谷胱甘肽和硫氧还蛋白代谢抑制剂。

1。介绍

越来越多的证据表明存在癌细胞受到内在代谢氧化应激增加正常untransformed细胞相比,部分是由于线粒体功能障碍(1- - - - - -3]。研究表明,线粒体呼吸缺陷导致了Akt激活(蛋白激酶B)通路,这可能是一个重要的机制,肿瘤细胞生存的条件下使用慢性氧化应激(4]。Akt是serine-threonine蛋白激酶,它已被证明参与血管生成,细胞周期进展,分化,细胞生长5,6]。Akt hyperactivated在许多癌症类型包括乳腺癌、直肠癌、卵巢癌,尤其是头部和颈部癌症(HNSCC)与正常组织相比7,8),导致代谢氧化应激的假设可能会有因果联系的增加Akt活动中观察到癌细胞。鉴于Akt通路对细胞的生存至关重要,已经提出和癌症细胞来演示增加细胞内的氢过氧化物生产相比正常(untransformed)细胞(2,9- - - - - -11),我们建议肿瘤细胞可能会增加一种蛋白激酶活动来弥补增加细胞内的氢过氧化物和氧化应激引起的缺陷线粒体呼吸。此外,我们建议治疗干预旨在抑制Akt激活和氢过氧化物解毒与操作相结合,增加prooxidant产量将优先杀死肿瘤细胞与正常细胞通过氧化应激。

(Perifosine(十二烷基)- 1,1-dimethyl-piperidinio-4-yl磷酸(/))是一种可利用alkylphospholipid目前正在测试在第一阶段和第二阶段的临床试验12- - - - - -17),是一大群膜渗透单链抗肿瘤alkylphosphocholines (apc) [18- - - - - -20.]。每显示显著的抗增殖活性在体外和体内肿瘤模型包括乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和HNSCC [18,21]。Akt的每一个具体的目标是针对plekstrin同源性(PH)领域的一种蛋白激酶,防止其易位到质膜被激活(21]。本研究的目的是确定如果每诱发氧化应激和扰乱硫醇氧化代谢途径进一步提高灵敏度PER-induced单独细胞杀死HNSCC细胞。

2。材料和方法

2.1。细胞培养条件

FaDu、Cal-27 SCC-25人体头颈部鳞状细胞癌细胞得到来自美国类型文化集合(弗吉尼亚州马纳萨斯)。FaDu Cal-27细胞保持在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)包含4毫米谷酰胺,丙酮酸钠1毫米,1.5 g / L碳酸氢钠和4.5 g / L葡萄糖10%胎牛血清(的边后卫;Hyclone,洛根,UT)。SCC-25细胞被维护在一个 杜尔贝科的混合物的修改鹰的媒介和火腿的F12培养基含有1.2 g / L碳酸氢钠,2.5毫米谷酰胺,消息灵通的15毫米,0.5毫米丙酮酸钠,葡萄糖4.5 g / L, 400 ng / mL氢化可的松10%胎牛血清。文化有限公司保持在5%2和湿润的 孵化器。

2.2。药物治疗

n -乙酰半胱氨酸(NAC)和L-buthionine - (S, R) -sulfoximine (BSO)从西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州)。金诺芬(本身)是获得ICN生化药剂(极光,哦)。Perifosine(每)从开曼群岛获得化学(安阿伯市MI)。所有药物均使用前未经纯化。药物被添加在最后的1 - 10浓度细胞 米/ 0.5 M本身,NAC 20毫米,1.0毫米BSO。每和与溶解在乙醇和二甲亚砜(DMSO),分别,然后稀释0.9%氯化钠(Hospira森林湖,IL),南汽是溶解在1 M碳酸氢钠(pH值7.0)和BSO溶解在PBS。所需数量的每种药物是直接添加完成细胞培养媒体对细胞达到预期的最终浓度。所有的细胞都被放置在一个 孵化器和收获时间点。

2.3。检测Akt激活和总Akt的水平

细胞收获24小时后药物接触,用PBS洗净,然后用细胞裂解缓冲细胞溶解。细胞溶解产物是蛋白质含量标准,通过sds - page来解决。硝基墨迹图与兔子antiAkt探测、antiphospho-Akt爵士473年(细胞信号技术,贝弗利,MA),或antiGAPDH(细胞信号)抗体。

2.4。谷胱甘肽测定

细胞颗粒在50 mM PO解冻和均质4缓冲(pH值7.8)包含1.34毫米diethylenetriaminepentaacetic酸(DETAPAC)缓冲区。总谷胱甘肽含量测定方法的安德森(22]。减少谷胱甘肽(GSH)和二硫化谷胱甘肽(GSSG)被添加2杰出 L的 每30 2-vinylpyridine和乙醇的混合物 L 1小时化验样本随后孵化的如前所述[23]。谷胱甘肽决定都是规范化整个匀浆的蛋白质含量用洛瑞的方法等。24]。

2.5。单独使用细胞生存实验

细胞治疗每24小时之前每个单独生存实验。在指定的实验中,细胞治疗与南汽、BSO或与1小时之前和期间/曝光。连接细胞实验菜使胰蛋白酶化1毫升trypsin-EDTA (CellGro,位于弗吉尼亚州赫恩登)和灭活与含有10%胎牛血清的DMEM (Hyclone)。这些细胞被稀释,使用库尔特计数器计算。细胞被镀在低密度每板(150 - 1000),并允许克隆生长在湿润有限公司5%2, 在完全培养基环境14天,庆大霉素的0.1%。细胞被固定为70%乙醇和沾Coomassie蓝色单独分析细胞生存如前所述[25]。

个人化验进行克隆与稀释倍数至少四个菜每个数据点,至少重复3个独立的实验。

2.6。硫氧还蛋白还原酶测定

硫氧还蛋白还原酶(TrxRed)活动决心spectrophotometrically使用Holmgren和Bjornstedt[的方法26]。减去时间增加酶活性测定的吸光度在412 nm的TR活性抑制剂,aurothioglucose从总活动。一个单位的活动被定义为1 M TNB形成/(最低 毫克的蛋白质)。酚试剂法测定蛋白质浓度测定的(24]。

2.7。统计分析

统计分析是通过使用GraphPad棱镜版本4为Windows (GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。确定3或更多的差异意味着,单向方差分析与图基进行后续测试。误差线代表平均数标准误差。所有执行统计分析 水平的意义。

3所示。结果

3.1。Perifosine对一种蛋白激酶表达的影响

确定每在HNSCC Akt表达的影响,FaDu, Cal-27, SCC-25细胞处理5 米每24小时然后收获的检测Akt激活(pAkt)和总一种蛋白激酶。Akt激活被发现在所有3细胞系,但不同(图的表达水平1)。每完全抑制的表达pAkt FaDu和Cal-27细胞和部分抑制pAkt表达SCC-25细胞(图1)。总Akt也抑制了/在Cal-27细胞(图1)。这些结果证实/抑制HNSCCs pAkt活动。


图1
perifosine效果(每)Akt表达式。一种蛋白激酶磷酸化在FaDu Cal-27, SCC-25细胞被西方化验的屁股(50 一种蛋白激酶g蛋白在每个加载)和phosphor-Akt Ser473 5的存在与否 米每24小时。GAPDH是用作加载控制。
3.2。Perifosine对细胞生长和存活的影响

探讨影响每对人体头颈部鳞状细胞癌的细胞生长,FaDu, Cal-27, SCC-25细胞治疗剂量的增加/ (1 - 10 米),然后计算在0,24、48和72小时后治疗。每1、5、10 M抑制FaDu细胞生长(图后72小时2(一个)),而只有5和10 M /抑制Cal-27增长后72小时(图2 (b))。SCC-25细胞没有回应任何/剂量在72小时内(图2 (c))。当我们分析单独生存与每24小时的治疗后,我们观察到1 M /并不影响生存的细胞行但5和10 M /显著降低生存FaDu Cal-27细胞相比,控制( ,图2 (d))。再次SCC-25细胞耐药/治疗10 米每造成轻微但无意义的减少SCC-25细胞相比,控制(图2 (d))。这些结果表明,每导致HNSCC增长逮捕和细胞毒性细胞,但这些影响是剂量依赖和不同细胞类型。

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图2
perifosine效果(/)的头部和颈部癌症细胞生长和生存。Cal-27 FaDu (a) (b),和SCC-25 (c)细胞治疗1、5、10 mol / L /和增长了72小时。(d)与1 - 10细胞治疗 米每24小时然后镀单独生存。单独使用细胞生存数据归一化控制(CON)。误差线代表±1 sd 实验在不同的日子里进行至少2克隆菜从1治疗盘。*, 与控制。
3.3。Perifosine诱导中断谷胱甘肽代谢与氧化压力一致

我们检查如果氧化应激可以导致生长抑制和细胞毒性的影响通过测量细胞中谷胱甘肽(GSH / GSSG)水平。谷胱甘肽(GSSG氧化还原电对代表一个重大小分子量thiol-disulfide细胞内氧化还原缓冲(27]。被氧化的总谷胱甘肽(GSSG)是用来计算GSSG百分比(% GSSG)。因此,增加% GSSG被认为代表一个转向一个更高度氧化细胞内环境的氧化应激的说明(27]。我们分析了谷胱甘肽(GSSG水平FaDu, Cal-27, SCC-25细胞治疗后5 米每24小时。我们选择进一步分析的影响5 米每FaDu Cal-27细胞,因为它是临床可行的剂量下,意味着稳态血浆浓度(16.2 米)实现了在实体肿瘤患者的最大耐受剂量200毫克/天(12]。我们分析了10的影响 M / SCC-25细胞因为这是单独使用唯一的剂量显示轻微的细胞毒性细胞的生存分析(图2 (d))。每造成Cal-27总谷胱甘肽含量的增加和SCC-25细胞相比,控制这表明每诱导总谷胱甘肽的合成和积累,以维持细胞内的氧化还原缓冲能力减少环境(图3(一个))。每总谷胱甘肽水平没有显著改变FaDu细胞(图3(一个))。增加GSSG观察当所有细胞系都接受每尽管这种效应只在FaDu细胞(图3 (b))。当我们计算的影响/ % GSSG,所有3细胞系表现出显著增加% GSSG相比,控制细胞数量增加最多的FaDu显示% GSSG和SCC-25显示(图3 (c))。这些结果支持这一假设的毒性可能每部分由中断谷胱甘肽和/或硫醇代谢符合导致氧化应激。

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图3
perifosine效果(/)和N-acetyl-cysteine (NAC)总谷胱甘肽(GSH)含量(a)、二硫化谷胱甘肽(GSSG)水平(b),二硫化谷胱甘肽比例(% GSSG) (c)水平,以及细胞毒性(d)在头部和颈部癌症细胞。细胞治疗5 每(FaDu和Cal-27)或10 M 米每24小时(SCC-25)有或没有20毫米NAC治疗1小时之前和期间/曝光。(一)——(c)细胞收获谷胱甘肽分析使用光谱光度测量的回收试验。误差线代表 1 sd 实验。(d)分析了细胞克隆细胞生存和数据归一化控制(CON)。误差线代表 1 sd 实验在不同的日子里进行至少2克隆菜从1治疗盘。*, 与控制; , 与各自没有NAC治疗。
3.4。PER-Induced中断谷胱甘肽代谢和细胞毒性抑制南汽

进一步分析氧化应激参与PER-induced细胞毒性,FaDu, Cal-27,和SCC-25细胞治疗20毫米的硫醇抗氧化剂n -乙酰半胱氨酸(NAC) 1小时接触之前和期间/,然后分析了谷胱甘肽(GSSG水平和单独生存。SCC-25 NAC治疗显著增加谷胱甘肽水平细胞,也增加了谷胱甘肽的存在/ SCC-25细胞(图3(一个))。此外,南汽镇压PER-induced GSSG增加3细胞系FaDu和Cal-27达到意义(图3 (b))。然而,PER-induced增加% GSSG显著抑制了南汽在所有3细胞系可比单独NAC(图3 (c))。当我们分析了NAC对PER-induced细胞毒性的影响,南京部分显著但获救的结合引起的细胞毒性/(每83%:36%:NAC + /, (图)FaDu细胞3 (d))。南京没有明显救援Cal-27和从PER-induced SCC-25细胞细胞毒性(图3 (d))。综上所述,图3支持的假设每引发中断硫醇代谢与氧化压力一致,由南京逆转,PER-induced FaDu细胞细胞毒性可能是由于部分增加氧化应激。

3.5。PER-Induced细胞毒性增强了Buthionine Sulfoximine

以确定谷胱甘肽耗竭将进一步提高每诱导的细胞毒性,Cal-27,与1毫米BSO SCC-25细胞治疗,这是一种抑制剂的谷胱甘肽合成,1小时前和治疗期间每24小时然后分析生存和谷胱甘肽(GSSG单独使用。我们没有研究的影响BSO PER-induced以来FaDu细胞细胞毒性/引起如此广泛的细胞杀死一个代理在这个细胞系。结果表明,观察到的细胞死亡与每Cal-27被BSO显著提高(每56%:77%:BSO + /, ,图4(一))。此外,SCC-25细胞最初对每治疗(图2 (d)每在BSO)成为致敏(每11%:44%:BSO + /, ,图4(一)),但这敏感并不是与诱导的细胞毒性/在FaDu(83%)和Cal-27细胞(56%,图2 (d))。BSO独自在每显著减少总谷胱甘肽Cal-27但只有不到10%的控制细胞减少35%的总谷胱甘肽SCC-25细胞(图4 (b))。此外,BSO独自,结合每显著增加% GSSG Cal-27细胞相比,控制细胞并没有观察到SCC-25细胞(图4 (c))。这些数据表明,大量消耗的谷胱甘肽(GSH)和BSO增强了细胞毒性观察每和敏感的程度可能是由于GSSG的谷胱甘肽耗竭程度和归纳。

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图4
谷胱甘肽和硫氧还蛋白代谢抑制剂对perifosine(每)在头部和颈部癌症细胞毒性。(一)Cal-27 SCC-25细胞处理5 每(Cal-27)或10 M 米每24小时(SCC-25)有或没有治疗1毫米buthionine sulfoximine (BSO) 1小时之前和期间/曝光。(b) - (c)细胞如上所述进行处理和收获总谷胱甘肽(GSH)含量(b)、二硫化谷胱甘肽和百分比(% GSSG)水平(c)使用光谱光度测量的回收试验。误差线代表±1 sd 实验。(d) Cal-27 SCC-25细胞治疗和5 每(Cal-27)或10 M M / (SCC-25) 24小时有或没有治疗0.5 M金诺芬(本身)1小时之前和期间/曝光。单独使用细胞生存数据归一化控制(CON)。误差线代表±1 sd 实验在不同的日子里进行至少4克隆菜从1治疗盘。*, 与控制; , 与各自的治疗没有BSO或本身。
3.6。金诺芬PER-Induced细胞毒性增强

由于BSO没有显著提高PER-induced PER-induced SCC-25细胞中细胞死亡的细胞杀死FaDu和Cal-27(图中观察到2 (d)),我们决定如果抑制硫氧还蛋白(硫氧还蛋白)的新陈代谢将加强在SCC-25 PER-induced细胞杀死细胞,结果Cal-27相比。我们用0.5进行预处理细胞 M与1小时之前和期间接触(图4)。我们选择这一剂量为0.5 米本身,因为它是显示抑制硫氧还蛋白还原酶(TrxRed)活动大约50% Cal-27 SCC-25细胞相比,控制细胞(表1)。本身造成约30%相比,两种细胞系细胞杀死控制(图4)。有趣的是,本身没有进一步加强PER-induced细胞杀死Cal-27细胞本身却使敏感细胞SCC-25 PER-induced细胞杀死现在相当于PER-induced细胞杀死的细胞Cal-27(56%:本身+ / [SCC-25]和56%:/ (Cal-27),图4)。表1显示,与孤独,结合每确实抑制Cal-27 TrxRed活动和SCC-25细胞。每单并不影响TrxRed活动的细胞系(表1)。图中的数据4和表1表明,抑制谷胱甘肽和硫氧还蛋白代谢途径增强敏感性/。

表1
3.7。Perifosine硫醇氧化状态预测响应

因为每个头部和颈部细胞系评估在这些研究中每(数据不同的回应1和2),我们表明,扰乱了谷胱甘肽或硫氧还蛋白抗氧化途径激活的特定细胞系/(图4),我们决定如果谷胱甘肽或TrxRed活动对每个预测反应。我们绘制的存活分数每个细胞株在回应每TrxRed活动在控制水平的函数(图5(一个)(图)和总谷胱甘肽含量控制水平5 (b))。结果表明,TrxRed活动与PER-induced细胞毒性显著相关,与FaDu证明反应最大的细胞死亡(图2 (d)(图),至少TrxRed活动5(一个)),SCC-25细胞抵抗每(图2 (d)),拥有最高水平的TrxRed活动( ,图5(一个))。此外,还总谷胱甘肽水平与PER-induced细胞毒性,FaDu细胞有高谷胱甘肽水平相比其他细胞系和SCC-25细胞谷胱甘肽水平低( ,图5 (b))。这些数据表明细胞TrxRed活动和高总谷胱甘肽水平低可能对每TrxRed活动和较低的和细胞谷胱甘肽含量高对每个可能是敏感。

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图5
perifosine协会(每)诱导细胞毒性与谷胱甘肽(GSH)含量和硫氧还蛋白还原酶活性(TrxRed)在头部和颈部癌症细胞。FaDu、Cal-27 SCC-25细胞分析平均基线TrxRed活动(a)和平均总谷胱甘肽含量(b)和相对于各自的意思是幸存的分数在5 每(FaDu和Cal-27)或10 M M / (SCC-25)。

4所示。讨论

每个作为一个单一的代理显示良好的反应在晚期软组织肉瘤患者14)和Waldenstrom巨球蛋白血(28]。然而,每个患者常见的实体肿瘤反应令人失望,没有正当理由的每个作为一个代理的进一步调查。在这项研究中,我们调查的作用氧化应激在每和显示敏感性的机制可以增强扰乱硫醇氧化代谢途径和增加氧化应激在头部和颈部癌症细胞。

Akt表达式和hyperactivation HNSCC频繁事件和与疾病进展密切相关8,29日]。在这项研究中,使用的HNSCC细胞系FaDu, Cal-27, SCC-25都表达了一种蛋白激酶的激活形式(pAkt,图1),由24小时抑制治疗5 M /。尽管pAkt被抑制在所有情况下,对每个不同的细胞系FaDu表现出最大的生长抑制和细胞毒性和SCC-25展示没有响应(图2 (d))。然而,这些数据支持发现Kondapaka et al。(2003),显示5 米每24小时抑制pAkt曲泽前列腺癌的细胞表达和增长(21Patel)和等人与0.6 - -8.9显示抗增殖效果 M /在头部和颈部癌症细胞(30.]。另外我们发现pAkt表达在不同级别3细胞系FaDu显示最高的表达和SCC-25显示(图1)。因为FaDu细胞表达最高的pAkt Akt抑制剂/是最敏感和SCC-25细胞相对较低的pAkt表达抗/,肿瘤可能与高pAkt表达式更容易Akt通路抑制剂比肿瘤低pAkt表达式。

Akt通路的激活细胞存活率和细胞氧化还原状态的关键是参与了可逆的激活和失活途径(4,31日,32]。例如,温和的ROS水平激活Akt通路信号,促进细胞存活,但高或慢性氧化应激抑制这个途径导致细胞凋亡(4,31日- - - - - -34]。因为癌细胞正在增加代谢正常细胞相比氧化应激和Akt通路可能激活这些氧化条件下生存,我们建议Akt通路的抑制/会增加氧化应激到了这样一种程度,使癌细胞敏感氧化压力进一步增加。

我们调查了每对氧化应激的影响通过分析谷胱甘肽(GSH / GSSG)水平。谷胱甘肽系统是一个主要的细胞内氧化还原缓冲细胞和参与解毒的H2O2和有机氢过氧化物(27),谷胱甘肽比GSSG可以作为细胞内氧化还原状态的反映(27]。每诱导显著增加% GSSG 3细胞系相比,控制细胞(图3 (c)),表明氧化应激增加,表明一种蛋白激酶的抑制可能参与增加氧化应激。进一步支持这一想法,硫醇氧化NAC能完全抑制的增加% GSSG 3细胞系(图3 (c))。此外,NAC能部分但明显扭转引起的细胞毒性/ FaDu细胞表明增加氧化应激参与PER-induced细胞毒性细胞系(图3 (d))。

进一步调查中谷胱甘肽的作用的影响,我们使用BSO,谷氨酸,半胱氨酸连接酶的抑制剂被认为是病原反应酶的合成谷胱甘肽(35,36在Cal-27和SCC-25细胞。在我们实验室之前的研究已经表明,BSO显著减少乳腺癌和头部和颈部癌症细胞中谷胱甘肽池而敏化肿瘤细胞化疗药物(37,38]。BSO也被用于癌症治疗的临床试验来增强化疗药物的细胞毒性39]。在目前的研究中,发现了BSO大幅增加诱导的细胞毒性/ Cal-27细胞(图4(一))。正如所料,BSO显著总谷胱甘肽水平降低,增加% GSSG Cal-27细胞作为一个代理,结合每(图4 (b)),这表明抑制谷胱甘肽合成进一步提高每,进一步诱导的氧化应激激活的细胞每Cal-27细胞的毒性。

整体SCC-25细胞比FaDu更耐每次治疗和Cal-27细胞(数字1和2)。我们还观察到BSO不是Cal-27一样有效SCC-25细胞的细胞在致敏/(图4(一)),这是明显的缺乏明显的谷胱甘肽耗竭细胞系(图4 (b))。虽然有一个趋势增加% GSSG在BSO +每相比,独自在SCC-25细胞(图4 (c)),这增加不显著,没有那么伟大BSO + PER-induced增加% GSSG Cal-27细胞(图中观察到4 (c))。这些观察表明,PER-induced SCC-25细胞细胞毒性并不依赖于谷胱甘肽比Cal-27细胞/谷胱甘肽过氧化物酶系统。在我们的实验室支持这些观察和初步实验表明,每Cal-27细胞诱导GPx活性的增加而不是SCC-25细胞(数据未显示)。因此,我们建议其他抗氧化系统,如硫氧还蛋白系统(硫氧还蛋白)可能参与PER-induced SCC-25细胞的细胞毒性。

硫氧还蛋白系统是一个高度保守的无处不在的系统组成的硫氧还蛋白还原酶(TrxRed),硫氧还蛋白(硫氧还蛋白),硫氧还蛋白氧化酵素。、抗氧化蛋白)和NADPH [40]。硫氧还蛋白系统扮演着一个重要的角色在多个细胞内的氧化还原调控过程和抗细胞毒性药物,从而诱导氧化应激(41,42]。TrxRed是selenocysteine-containing蛋白质催化硫氧还蛋白的减少利用NADPH作为还原剂(40]。TrxRed已被证明启动信号通路在氧化应激反应中发挥作用在保护细胞不受氧化应激,因此被认为是一个潜在的目标细胞毒性药物诱导氧化应激(40,43,44]。

调查Trx SCC-25细胞新陈代谢的作用我们使用金诺芬(S-triethylphosphinegold (I) 2, 3, 4, 6-tetra-O-acetyl-1-thio-b-Dglucopyranoside(本身)),这是一个相对具体的TrxRed抑制剂(表1)。本身属于黄金(我)的药物类用于治疗类风湿性关节炎(45),已被证明刺激线粒体过氧化氢的生产(46,47]。明显与敏化SCC-25细胞/(图4 (d)比BSO(图)在更大程度上4(一)),这是与PER-induced细胞毒性在Cal-27(图2 (d))。有趣的是,本身并没有显著提高Cal-27细胞/(图4 (d))。这进一步支持,硫氧还蛋白通路是更多地参与PER-induced cytotxicity SCC-25细胞比Cal-27细胞中谷胱甘肽通路似乎更为重要。

我们预计BSO或本身会使敏感Cal-27和SCC-25细胞在更大程度上比我们观察到的数字4(一)和4 (d)基于BSO,本身和每个诱导氧化应激作为单一代理商从力学上看,应该联系在一起。然而,我们得承认,更广泛的剂量反应分析BSO +每和本身+(即需要。isobologram分析),我们的数据显示在图4不解决这一问题的机械联系。另一方面,我们的数据强烈建议相反,BSO或本身结合每从力学上看可能是分离自BSO + (Cal-27和SCC-25)和每(SCC-25)似乎与+添加剂(数字4(一)和4 (d))。BSO抑制谷胱甘肽的合成,与抑制TrxRed活动和每抑制Akt通路信号,因此,这些药物的作用机制并不相关。BSO,本身和每对氧化应激有重要的影响,进一步证明这些药物需要更广泛的剂量反应分析来确定相加或协同作用。

重要的是要注意,SCC-25细胞拥有两倍TrxRed活动Cal-27细胞和Cal-27细胞拥有两倍的数量总谷胱甘肽相比SCC-25细胞(表1,图4)。这使我们建议总谷胱甘肽和TrxRed活动可能预测应对每在头部和颈部癌症细胞。深入了解这种关系我们绘制TR活动每个细胞株在控制水平和总谷胱甘肽对幸存的分数在应对每(图5)。结果表明,高TrxRed活动和低总谷胱甘肽(如SCC-25细胞)细胞呈现每治疗抵抗,而低TrxRed活动和高总谷胱甘肽(如FaDu细胞)细胞呈现敏感/(图5)。这些结果支持数据切et al。48],显示,肺癌细胞高硫氧还蛋白表达水平有一个更激进的表型,但更敏感硫氧还蛋白抑制细胞与低硫氧还蛋白表达水平。这些结果也可以解释为什么TrxRed是调节在许多肿瘤细胞和支持的猜测,可能更容易耐药细胞抑制TrxRed促进细胞毒性和其他化疗药物敏感性。此外,我们的初步实验表明高等GPx活性FaDu细胞相比Cal-27 SCC-25,和GPx活性似乎与灵敏度/类似如图5 (b)(数据没有显示)。我们目前正在重复这些实验,但这些令人鼓舞的结果进一步表明,可能有一个更高层次的谷胱甘肽代谢FaDu细胞相比SCC-25细胞。

总的来说,这里提供的数据支持这样的结论,每诱发氧化应激在HNSCC细胞和破坏硫醇氧化代谢途径增强对每通过氧化应激。这些数据也支持猜测TrxRed活动和总谷胱甘肽水平可能有助于预测响应/。最后,这些数据提供了一个生化原理使用谷胱甘肽和硫氧还蛋白代谢抑制剂结合每提高敏感性HNSCC细胞克隆细胞细胞每杀死的结合形态的癌症疗法。

缩写

/: Perifosine
与: 金诺芬
BSO: L-buthionine——-sulfoximine (S, R)
南京: n -乙酰半胱氨酸
谷胱甘肽: 谷胱甘肽
GSSG: 二硫化谷胱甘肽
TrxRed: 硫氧还蛋白还原酶
硫氧还蛋白: 硫氧还蛋白。

确认

Werner Wilke博士作者要感谢他的帮助在Akt蛋白分析和Anjali Gupta博士为有益的讨论。KO1-CA134941,这项工作是由国家卫生研究院RO1-CA100045 T32-CA078586-08, R01-CA133114, P30-CA086862,美国爱荷华大学放射肿瘤学。