抗菌筛选Gunnera perpensa介导的银纳米粒子

摘要

纳米粒子的生物合成已经成为一种非常流行的方法，由于其成本效益和生态友好性，已经被提出作为冗长、昂贵和有毒的物理和化学合成方法的替代品。本研究涉及到抑菌活性的生物合成、表征和评价Gunnera perpensa介导AgNPs。利用TEM、UV和FTIR对生物合成的AgNPs进行了表征。采用纸片扩散法测定6株细菌的抑菌活性，用肉汤稀释法测定其最低抑菌浓度(MIC)。TEM检测结果显示，所有NPs均为球形团簇，尺寸从13 nm到24 nm不等。吸收峰在421 ~ 425 nm之间，且存在带有胺基的C=O键，证实了该化合物的合成和稳定性g . perpensaextract-mediated AgNPs。两种制剂在7.0 ~ 9.0 mm范围内均表现出良好的抑菌活性g . perpensa提取物介导的AgNPs对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的研究，在MIC范围为3.2至12.5 μ克/毫升。总体而言，良好的抗菌活性较低剂量达到用的两种制剂g . perpensa-介导的AgNPs对所有检测的细菌菌株均有效，提示g . perpensa-介导的AgNPs作为良好的抗菌剂。

1.介绍

近年来，纳米技术已成为一个快速发展的领域，其应用在纳米医学、药物传递、治疗和诊断。这种技术涉及在原子和分子尺度上操纵物质，从而产生纳米器件或材料，即纳米颗粒(NPs)，具有独特的电学、光学和物理化学特性[1］.这些NP包括金（Au），银（Ag），硒（Se），铁氧化物，和铂（Pt），仅举几个例子;而这当中，的AgNPs是最常见的研究纳米粒子2］.

几个世纪以来，AgNPs因其抗菌作用而闻名，因此已普遍用于制药和医疗设备[3.］.这些纳米粒子由银或氧化银组成，尺寸从1纳米到100纳米不等。这些NPs可以通过物理和化学方法合成。然而，由于使用有毒化学品，需要昂贵的设备，以及高费力、环境安全、低成本、快速和易于扩大的合成方法。因此，生物合成通过消除对高压、能量或有毒化学物质的需求，解决了这个问题，这是一个正在变得相当流行的研究领域[4］.近年来，各种研究人员已经证明了利用细菌、放线菌、真菌和植物生物合成AgNPs，其中NPs在细胞外产生，在溶液中稳定[4，5］.植物由于其潜在的药用特性、巨大的可用性和更快的合成速度，已经成功地用于AgNP的合成[6］.许多植物以前被用来研究AgNPs的合成，其中大多数涉及使用叶子提取物[7- - - - - -9］.根据Burlacu等人[10]、蛋白质、多酚和植物中水溶性杂环成分是银盐还原和NPs稳定的主要原因。

g . perpensa属菊科。它通常被称为河南瓜[11］.祖鲁名“ughobo”指的是液体的流动及其在传统药物的使用，以清除体内多余的液体[12］.根厚可达300毫米，叶片从靠近顶端的中心丛中生长出来。这些叶子很大，呈肾状，深蓝绿色，两面都被毛覆盖。花很小，红棕色，从比叶子高的长穗突出。它是一种专性的湿地植物，发现在沼泽地区和沿着河流。它不能忍受霜和寒冷的环境[13］.它被用于农村人口的痛经治疗，水提取已被用于缓解类风湿疼痛，协助分娩，治疗女性不孕症[14］.根茎已被证明具有镇痛和抗炎特性[15］.在南非，一种根的汤剂被用来排出出生后的胎盘和缓解月经疼痛[16］.咖啡酸，槲皮素，鞣花酸和鞣花单宁，以及两种花青素，而生物碱，氰苷，环烯醚萜类，原花青素，皂素，和sedoheptulose未检测到某些Gunnera物种[17］.叶的甲醇提取物中发现了1,4 -苯醌和反式植物-2-烯醇的衍生物g . perpensa［18］.植物提取物同时充当还原剂和封端剂为银的还原和稳定NP的。这种现象被归因于植物化学物质的植物提取物内的存在，如蛋白质，类黄酮，生物碱，糖和酚酸。多酚类底物的高水平的发现g . perpensa促进绿色合成的AgNPs的抗菌活性。

因此，本研究重点研究了银藻水提物/甲醇提物的合成、表征和抗菌活性评价g . perpensa植物叶片。

2.实验

2．1.材料

的Mueller Hinton琼脂平板，微量滴定板，和的Mueller Hinton肉汤（MHB）购自Bio-Rad实验室（里士满，VA，USA）购买。细菌培养物从柳叶刀实验室（SA）获得。Microbank小瓶从戴维斯诊断（SA）购买。所有化学品都是分析级的，并且由Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国）提供。

２.２.方法

2.2.1。植物的收集与叶提取物的制备

植物g . perpensa是在南非夸祖鲁纳塔尔省德班附近获得的。它的叶子用自来水洗了两次，然后在室温下风干。叶子提取是按照之前Dubey等人的描述进行的[19]稍作修改。In brief, 50 g of thoroughly washed leaves were finely cut and boiled in 250 ml autoclaved distilled water for 20 minutes. The extract was cooled down and filtered with Whatman No. 1 filter paper. Thereafter, the filtrate was sterilized with a syringe filter through a 0.22 μm孔过滤器(Millipore)，储存在4°C，以供进一步使用。对甲醇提取物进行了相同的程序，但用甲醇代替水作为溶剂。

2.2.2。纳米银的绿色合成

Initially, 1 M silver nitrate (AgNO_3.)，用无菌蒸馏水在Erlenmeyer烧瓶中制备。从这里，60毫升1毫米AgNO_3.在室温下分别加入叶水提物/甲醇提取物2.5 ml，配制成溶液。然后，将无色溶液在搅拌器中混合5分钟，肉眼观察到显示AgNPs形成的黄褐色变化[19］.然后将产生阳性颜色变化的溶液储存在4°C的玻璃瓶中。

２.３.纳米粒子合成的表征

2.3.1。紫外线(UV)光谱

的AgNPs的形成和稳定性，通过紫外可见（VIS）光谱法进行分析用的Varian卡里100 UV-Vis分光光度计含有赢UV软件。一个scan in the wavelength range of 200 to 800 nm was carried out. Samples were poured into quartz cuvettes, placed into the spectrophotometer, and a scan in the wavelength range of 200 to 800 nm was carried out. Thereafter, the absorbance measurements in relative light units (AU) were recorded.

2.3.2。透射电子显微镜

利用透射电镜测定了合成的AgNPs的形貌和粒径。样品准备包括将AgNP溶液在1300 rpm的转速下离心45分钟，然后丢弃上清液，将沉淀液重新悬浮在蒸馏水中。然后，每个样品的一滴被放置在碳涂层铜网格上，并在室温下风干，然后装入透射电子显微镜进行分析。使用的显微镜是JEOL JEM-1010透射电子显微镜，带有Megaview III相机和iTEM UIP软件(日本东京)，从夸祖鲁纳塔尔大学(南非韦斯特维尔校区)访问。

2.3.3。傅里叶变换红外光谱(FTIR)

FTIR分析还用于确定是否相同的生物分子负责不同提取物的AgNPs的合成和盖层。开始时，样品准备包括AgNP溶液1300 rpm离心45分钟，然后丢弃上清液，将沉淀重悬于蒸馏水中。然后，一滴样品被放置在PerkinElmer, Spectrum 100 FTIR分光光度计上，扫描测量波长范围从500到4000厘米的透光率百分比⁻¹拍摄。然后，利用E-FTIR软件对结果进行分析，确定峰值，然后进行解释。

2.3.4。细菌培养和维护

所用的六种细菌均为革兰氏阴性大肠杆菌（B3578)，大肠杆菌（U10948),大肠杆菌（P4055）和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌（S6158)，金黄色葡萄球菌（P4215),金黄色葡萄球菌（S5878)，并根据它们与宿主隔离的物种名称的参考代码进行区分。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌因为这两种细菌都是快速生长的微生物，所以被选为抗菌素敏感性的靶点。大肠杆菌与15-20分钟的短世代时间相比金黄色葡萄球菌一代人的时间大约是30分钟。

所有细菌培养物置于并验证。贮存培养物保存在用50％甘油microbank小瓶中。当需要时，将培养物在MHB在37℃下生长24小时。细菌细胞的吸光度调整为0.5麦克法兰标准，其对应于10⁸CFU /毫升(20.］.

2.3.5。在的AgNPs的抗菌活性

使用的植物提取物制备的水和甲醇的AgNPs的抗菌活性g . perpensa如先前所描述，使用琼脂盘扩散分析研究[21］.总之,100年μ用无菌棉签将每个检测细菌的l拭于Mueller Hinton琼脂平板上。然后,15μl的AgNP样品溶液(30μg/ml)移液到5.5 mm无菌滤纸(Whatman No. 1)上，置于生物安全柜中风干。然后将处理过的圆盘置于接种过的细菌培养皿表面，在37℃下培养24小时。阴性对照为100% DMSO，阴性对照为AgNO_3.(30μ克作为阳性对照/ ml）中。所有测试都重复进行三次。所测试的细菌的敏感性通过测量抑制区的直径确定。

2.3.6。最低抑菌浓度(MIC)的测定

用微量滴定板测定AgNP样品溶液中细菌活性的MIC值。简单地说，从浓度为50进行连续稀释μ1.125 g / mlμ克/毫升。一个井中含有DMSO作为阴性;另一口井含有MHB作为无菌对照，另一口井含有MHB和测试细菌作为生长对照。然后,100年μ除无菌对照外，每孔加细菌培养物l，封闭微孔板，37℃过夜孵育12小时。孵化后,50μl 2μg / ml的增长指标p在每孔中加入-碘硝四唑(INT)，再孵育30分钟。生长抑制由无色悬浮液显示，而生长被视为紫罗兰色悬浮液[21］.

2.3.7。统计分析

抑菌活性研究共进行3个重复，结果以均数±标准差(SD)表示。数据采用双向方差分析和t-检验，以GraphPad Prism 6.0表示有统计学意义的值 ．

3.结果与讨论

3．1.AgNPs的合成、紫外-可见光谱和透射电镜分析

金属纳米颗粒以其独特的性质而闻名，尤其是表面等离子体共振(SPR)的光学性质。因此，通过颜色变化和紫外可见光谱证实了AgNPs的成功形成。

通过混合的植物提取物制备的的AgNPsg . perpensa与AgNO_3.成功合成了溶液。这可以通过反应混合物从无色溶液到黄褐色溶液的颜色变化来说明(图)1)．颜色的变化可以归因于银离子的还原（银⁺)通过植物提取物中的活性生物分子从硝酸银转化为AgNPs [22］.AgNPs的颜色是由于SPR的激发，SPR是由相互作用的电磁场诱导的自由导电电子的集体振荡而产生的[2］.此外，AgNPs的特征吸收波段在400 nm和425 nm之间。测试样品的吸收波段在421 nm和425 nm之间(图)2)，从而证实该提取物成功制备了AgNPs。TEM分析能够给出清晰的AgNPs图像，并确定了颗粒的大小、形状和分布。所有合成的NPs均为球形，分布均匀，范围为13 ~ 24 nm(图)3.)．

３．２．红外光谱分析

FTIR测量进行了识别的植物提取物的表面，并在的AgNPs的封盖和稳定其可能参与对主要的官能团/生物分子。它也被用来确定是否有来自水和甲醇提取物形成的AgNPs之间的任何链路。数字4(一)和4 (b)显示了在水溶液和甲醇中生成的AgNPs的光谱g . perpensa提取物。强烈的峰值在3289、2973、1634和1635厘米处⁻¹所观察到的振动归因于胺的N-H、醇的O- h和羧酸或酯的C=O的伸缩振动[23］.的两个样品中的酰胺和羧酸键的存在证实蛋白质聚合物的在叶提取物的存在，其可能涉及Ag的还原⁺对Ag)⁰［22］.生物分子是已知的通过这些官能团与金属盐进行互动，并减少他们的帮助到的NP [24］.数字4(一)和4 (b)进一步证明了由甲醇样品合成的AgNPsg . perpensa形成了比水态AgNPs更高强度的峰。这表明，甲醇样品能够洗脱更多的极性化合物，因此与水溶液中的NP相比，具有更大的稳定性。

３．３．抗菌活性

AgNPs以其抗菌活性而闻名，据说这是由于微生物带负电荷的细胞膜与带正电荷的AgNPs之间的静电相互作用[25］.AgNPs在细胞膜上的积累被认为会改变细胞膜使其失去渗透性从而导致细胞死亡[26］.然而，由于准备这些NP时所使用的化学药剂影响其生物相容性和造成环境问题，生物合成的AgNPs最近已研究的课题。

研究了由g . perpensa采用圆盘扩散法研究植物提取物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑制作用。在本实验中，DMSO作为阴性对照，证明是一种安全的溶剂，对测定结果没有干扰。表中给出了用AgNP方法求解的每口井周围的抑制层直径(mm)1．MIC为最低浓度，在此浓度下，被测细菌未见明显生长2)．

合成的AgNPs总体上对革兰氏阳性和革兰氏阴性研究菌均表现出良好的抑菌活性，但抑菌区不同程度(见表)1)．两者处理后，与革兰氏阳性菌相比，革兰氏阴性菌的抑制区域略大g . perpensaextract-mediated AgNP准备。对革兰氏阴性菌活性最高大肠杆菌P4055 (9.0 mm)，革兰氏阳性菌活性最低金黄色葡萄球菌S5878 (7.0 mm)经水处理后制备g . perpensaextract-mediated AgNPs。然而，对革兰氏阴性菌的活性最高大肠杆菌U10948 (8.7 mm)，对革兰氏阳性菌活性最低金黄色葡萄球菌S6158 (7.3 mm)经甲醇处理后g . perpensaextract-mediated AgNPs(表1)．这些活性变化可归因于每个菌株具有的不同特性，这些特性构成了其抑制机制[27］.特别是革兰氏阳性菌的细胞壁组成，据说其细胞壁由一层很厚的多糖组成，NPs很难穿透，而革兰氏阴性菌则相反[25］.这些发现与Sánchez-López等人之前的报告一致[28，表明AgNPs对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有选择性。

值得注意的是,这两个g . perpensa提取液介导的AgNP制剂表现出显著( ）与阳性对照AgNO相比，AgNO对供试细菌的抑菌活性在7.0 ~ 9.0 mm之间_3.(范围6.0 - -6.7毫米)。这些发现是意料之中的，因为已经证明生物合成AgNPs具有增强的抗菌活性，据说是由于银和植物提取物的联合使用，因为银在纳米形态中被还原，增加了它的表面积，从而使其更具活性，而植物提取物由于其良好的抗菌效果，提高了AgNPs的治疗效果[29］.

此外，水溶液和甲醇的制备g . perpensa-介导的AgNPs在所有测试细菌中通常表现出较低的MIC值，范围从3.2到12.5μg/ml如表所示2．AgNPs对细菌表现出的较低的MIC值据说在医疗保健提供系统中具有重要意义，因为这可以为患者提供更小的剂量要求，从而限制或甚至防止有害的副作用[30.］.总的来说，这些发现表明，在较低剂量的两种制剂中都能获得良好的抗菌活性g . perpensa -介导的AgNPs对所有检测的细菌菌株，表明g . perpensa介导的AgNPs很好的抗菌剂。

4.结论

利用植物提取物成功地合成了纳米银g . perpensa。这些NPs非常稳定，在低剂量下均对一系列革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌表现出有效的抗菌活性，因此证明是良好的抗菌药物。

数据可用性

根据要求，本文作者提供了SEM和TEM图像、UV-Vis和FTIR光谱以及用于支持本研究结果的生物数据。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

南非国家研究基金会和德班理工大学获得了财政和基础设施支持。

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