表面改性的组合蘸水笔纳米和软光刻技术减少细菌的粘附

文摘

蘸水笔纳米(DPN)和软光刻技术适用于修改生物材料的表面。修改后的表面可能发挥作用在调节细胞,减少细菌粘附和生物膜的形成。本研究的主要目的有三个:第一,创建模式使用DPN在微尺度模型表面;第二,重复,这些模式转移到一个真实的生物材料表面使用microstamping技巧;最后,评估这些发达的表面使用生龋齿的细菌粘附的物种变形链球菌。DPN是使用聚合物来创建点模式在模型表面的粘合剂。弹性体聚二甲硅氧烷被用来复制模式和硅溶胶转移他们的医疗级不锈钢316 l microstamping表面。光学显微镜和原子力显微镜(AFM)是用来描述模式。变异链球菌附着力进行菌落(cfu)、肝癌和可行性分析,扫描电镜(SEM)。DPN允许创建微阵列从1到5µ米直径模型表面,被成功转移到通过microstamping 316 l不锈钢表面。显著降低了一个数量级细菌粘附微型图象表面观察。前面提出的实验方法可以用来创建模式在微尺度表面,并将其转换到其他表面。减少细菌粘附的表面可能会由于附着力产生重大影响的一个关键步骤biomaterial-related感染的生物膜的形成和发展。

1。介绍

仿生学可以被定义为科学研究,形成结构,或者产生物质和生物材料和生物机制的函数和过程由人工合成类似产品机制模拟大自然(1),是一种方法,可以应用于材料科学,并有助于提高或增加生物相容性(2]。表面特征基于鲨鱼组织已经应用于聚合物材料允许的减少金黄色葡萄球菌附着力和生物膜的形成3]。此外,这种模式是用于硅胶评估减少粘连和生物膜形成相关的肺炎细菌种类、和类似的结果(4]。因此,控制修改模式基于自然的表面结构表明,细菌粘附和生物膜的形成可能推迟而修改的表面(3,5]。Glinel et al。6]总结不同的方法,如涂层材料与精油或antiquorum-sensing分子,固定的抗菌肽,表面的结构和制造材料,将仿生学的研究发现,在表面改性代替创建抗菌表面。

表面使用不同的技术可以修改,包括光刻(7),软光刻技术(8- - - - - -11),蘸水笔纳米(12),超声纳米晶体表面改性(UNSM) [13),胶体光刻,蒸汽退火(14),或激光照射15),等等。

光刻一直被公认为最常见的技术制造所需的主模型软光刻技术(3,7,8,11,16,17]。钟等。3)用光刻和软光刻技术修改PDMS表面为了评估细菌接触的表面行为,发现细菌慢殖民和有图案的表面上形成一个成熟的生物膜。Hochbaum和Aizenberg5)获得了类似的结果,得出的结论是,有图案的表面被细菌更难被殖民的大小特征方法单一细菌的大小。Vasudevan et al。18)修改PDMS比较细菌粘附与平面,发现修改大肠下水道覆盖更多的表面平坦的PDMS(50%)比任何修改PDMS表面(或低于20%)。徐和Siedlecki19)用光刻和软光刻技术修改聚氨酯脲对细菌粘附的进行评估美国epidermidis和金黄色葡萄球菌在动态条件下,得出的结论是,细菌粘附后降低趋势随着剪切速率的增加相比,修改后的表面平坦的表面,特别是美国epidermidis在PBS,附着力达到减少值高达90%。然而,光刻提出了一些不足之处,尤其是在生物医学领域,因为它需要昂贵的设备和设施,由几个严格的步骤,不存在控制表面化学,不能弯曲的或非平面的表面上实现(20.]。

软光刻技术是间接的集合技术通过复制和转移过程,使制造图案表面的微米和亚微米水平(7,8]。这组技术依赖于一个弹性聚合物用作面具或邮票图案软材料,如聚合物、凝胶和有机层。软光刻技术的共同使用保利(dimethylsiloxane) (PDMS)作为复制结构的关键组件从一个模型被称为大师制作的。这种技术的优点,可能产生的大量的副本PDMS从一个主也许是最相关的21]。

蘸水笔纳米(DPN)是一种直接的技术,允许创建模式直接在材料表面的各种目的,包括蛋白质沉积(22,23)或制造的蛋白质阵列(24,25]。它是一个基于探针技术,使用一个原子力显微镜小费作为一个“心”固体基质”,“和分子与固体基质的化学亲和力“墨水”(12]。许多解决方案和分子,包括蛋白质,胶体粒子,和无机化合物用作油墨(23,25,26]。DPN的优点包括复杂的多组分总成的制造没有交叉污染(24),这个过程是适应性强,不是特殊的墨水或表面,不需要任何特殊的操作条件,任何模式可以创建(27]。其主要缺点是大面积的模式可能成为一个缓慢的过程因为每个特性分别(28]。

光刻和软光刻技术是两种广泛报道技术修改材料表面的生物医学应用程序(11,16,17]。DPN受到关注替代化学修改表面(29日),作为一种工具来创建模式与其他使用光刻技术(30.]。然而,软光刻技术的结合和蘸水笔纳米生物医学应用,尤其是对细菌粘附评价修改的表面,没有研究据我们所知。DPN可能是一个有前途的替代方法来创建主因为这种技术提供了一些优势光刻,包括这样一个事实,这是一个直接沉积法,它不需要一系列步骤和任何模式可以伪造任何表面,包括非平面的表面。

目前的工作了,我们所知,这些组合技术的应用程序第一次修改医疗级材料以减少表面细菌粘附。因此,这项工作的目的是创建点模式使用DPN在模型表面的硅和黄金,然后重复这些模式转移到不锈钢316 l的表面用软光刻技术,并评估生龋齿的物种的附着力变形链球菌这些发达的表面。图案表面可能有潜在的医学及牙科的兴趣提高设备(如骨科植入物的表面,牙科假肢,心脏瓣膜,或osseous-fixation盘子,等等,修改后的表面已经证明不仅减少细菌粘附[3- - - - - -6)但是也改善细胞粘附和安排10,11),这将最终导致改善生物材料/设备和周围组织之间的关系。

2。材料和方法

2.1。化学物质

商业高分子胶粘剂(诺兰庄园光学胶68吨,诺兰庄园的产品,公司,美国)作为墨水。这是保持在4°C在整个实验。

硅溶胶制备使用单程溶胶-凝胶方法如前所述,我们(31日,32]。Tetraethylorthosilicate (teo)和methyltriethoxysilane (mt)(德国ABCR GmbH & Co .)被用作硅前体混合溶胶,0.1 N硝酸(美国默克密理博)和醋酸(冰川,100% v / v,默克密理博,美国)被用作催化剂,和绝对乙醇(99.9% v / v,默克密理博,美国)作为溶剂。最后的SiO浓度₂18岁的gL⁻¹。

2.2。基板

商业1厘米×1厘米硅和黄金薄片(Nanoink, Inc .)、美国)被用作模型底物由于其亲和力的墨水。这些基质包含嵌入式矩阵的信件进一步协助模式位置成像和分析。

不锈钢316 l (SS316L) (Onlinemetals.com美国)10×10×1毫米板抛光使用1µ金刚石研磨膏(LECO公司(美国),直到镜面表面。SS316L盘子顺序清洗使用表面活性剂,丙酮(99.8% v / v,默克密理博,美国),蒸馏水,绝对乙醇(99% v / v,默克密理博,美国)8分钟每个超声波浴,让干燥的空气。

2.3。点母模制作

DPN进行了使用NLP 2000系统(NanoInk, Inc .)、美国)。0.4µL的墨水注入每个好twelve-well板(NanoInk, Inc .)、美国)。M三角技巧(10-tip数组)选择存款基板上的墨水考虑刚度。

主设计(∼10毫米²)由一个点在一个11×11矩阵数组处理,这意味着每个提示捏造的11点X轴和11Y每行轴。这个配置的空间被选中,因为连续两个点,包括它们之间的空间,大约是6µm。每种类型m三角尖存款墨水的X轴长度为66µm,该配置允许每个提示制作自己的11×11安排没有重叠的邻居数组。因此,每一行的点组成的121点X轴和11点Y轴。行多次捏造的覆盖整个区域。一个Z间隙的50µ建立了m和停留时间为0.5秒。

2.4。Microstamping

聚二甲基硅氧烷(PDMS)(硅橡胶2,道康宁公司(美国)被用来复制主基板(图上创建1)。只有硅和金大师组成的点1µ米直径。根据制造商和PDMS准备治愈24 h。然后,小心翼翼地从表面,视觉检查来验证其物理完整性和热治疗在80°C 3 h完成聚合。PDMS被用作microstamp SiO转移₂SS316L表面。总之,7µL的硅溶胶是沉积在不锈钢表面,PDMS microstamp被放置在下降,应用温和的压力,和允许溶胶凝胶4 h rt, PDMS压模然后仔细删除,和不锈钢板转移模式是在450°C热处理炉30分钟。

三种类型的样本。SS316L对照组(SS抛光)是由抛光盘子和两组:SiO持平₂涂涂板(SS)由浸渍涂层(4厘米/分钟)和SiO₂花纹板(SS微型图象)microstamping获得的。SS-coated SS-micropatterned板块和热治疗30分钟的450°C。

2.5。表面特征

点主和PDMS microstamp表面特征使用光学显微镜(OM) (Axio绿色40席,卡尔蔡司显微镜GmbH是一家德国)和原子力显微镜(AFM) (Nanosurf Easyscan 2, Nanosurf AG)、瑞士)。AFM收购,因(纳米传感器™,瑞士)提示的力常数48 N / m在开发模式中使用。图像后处理进行了使用软件AxioVision (V 4.9.1.0,卡尔蔡司显微镜GmbH,德国),软件映像J 1.51 (33),和软件WSxM 5.0 [34]。

SS316L表面性质进行评估通过AFM如上所述,通过接触角测量。10的AFM图像50µm×50µm用于表面粗糙度测量的算术平均粗糙度轮廓(Ra)使用AFM分析软件计算(Gwyddion 2.34, Nanometrology,捷克计量研究所,捷克共和国)。跟着液滴接触角测量方法随机盘子从每组10日使用相机(佳能EOS叛军XS、日本)和macrolens(105毫米一生DG OS,σ,美国)与使用软件AxioVision获得的角度值。

2.6。生物特征

变形链球菌美国微生物学的(写明ATCC 25175)被用来描述控制和实验表面细菌粘附。

细菌生长在脑心浸液(BHI)琼脂(Scharlab S.L.,Spain) supplemented with 0.2 U/ml bacitracin (Sigma Fluka, USA) for 24 h at 37° ± 1°C. Then, they were cultured in a solution of peptone water (3% peptone and 20% sucrose in distilled water) at 37° ± 1°C for 24 h. The bacterial solution was centrifuged, and the supernatant was discarded. The bacterial pellet was resuspended in peptone water at 10⁻⁷CFU /毫升通过测量浊度的浊度单位(南大)(基于南大vs CFU /毫升)的校准曲线。SS316L盘子从实验组和对照组被放置在单井24-well参与聚苯乙烯板(合演,康宁,Inc .)、美国),和1毫升细菌的解决方案是添加到每个。盘子在孵化37°±1°C 2, 4, 8、12、24小时。每次孵化期后,SS316L板块被移除,与500年洗了三次µl 0.9%的生理盐水去除不依从细菌,和准备表征方法。

扫描电子显微镜(JEOL地产- 5910 lv,日本),分析细菌粘附形态和范围,控制,和实验表面用3%戊二醛preincubated永久修复细菌细胞。

5-dimethylthiazol-2-yl MTT (3 - (4) 2, 5-diphenyltetrazolium溴)四唑还原试验被用来评估细胞的可行性。总之,500年µl (MTT方法准备5毫克/毫升蒸馏和无菌水(美国分子探针)添加到控制和实验表面和孵化37°±1°C 4 h。之后,表面被拍到使用一个倒置显微镜(AxioVert 40席,卡尔蔡司显微镜GmbH是一家德国)在50 x。软件映像J 1.51 (33)是用来计算细菌菌落的覆盖面积百分比。

控制和实验样本表面也受到3秒钟声波降解法在50%力量(美国Qsonica 125)在10毫升的0.9%生理盐水。连续稀释用的解决方案是准备和10µl从每个管在BHI琼脂培养板下降法(后一式三份35]。文化板块在孵化37°±1°C 48 h,然后菌落(cfu)计算。整个过程在不同的时间段重复了三次。

2.7。统计分析

实验结果给出的平均值±标准偏差(SD)。比较组间进行使用单向方差分析测试与事后图基方法。的值被认为是具有统计学意义。软件SPSS(22)被用于统计分析。

生成的数据集可以按照客户要求在当前研究的通讯作者。

3所示。结果

3.1。点掌握制造

商业胶粘剂作为油墨来创建一个模式对模型硅基质和黄金。

点矩阵硅上第一次被创建。点尺寸测定使用DPN系统和确认通过OM, SEM, AFM。OM画面显示点直径平均2.9±0.27µ米和314±21 nm的高度。连续两个点之间的分离取决于每个点的直径。图2SEM和AFM图像显示模式沉积在硅和黄金。

观察硅上,点直径平均为2.8µm和特性显示高度在200 - 400纳米范围与3和5之间的两个相邻点之间的分离µ黄金。

3.2。Microstamping

图3显示了一个50×50µm的AFM图像-积极点模式的重复创建表面(PDMS压模)。点转移模式SS316L使用硅溶胶成功作为点直径平均2.49±0.4µm和点高度平均为298±26海里,这是相同的尺寸范围在原来的基板(图创建的特性4)。

3.3。表面性质

接触角测量显示增加抛光涂布微型图象SS(图5)。接触角测量的差异是显著的三个表面处理( )。关于粗糙度,涂布党卫军显示值最低,其次是抛光和微型图象。粗糙度涂层和微型图象SS之间的差异具有统计学意义( )。

3.4。生物特征

变形链球菌被加入到三种基质(SS党卫军涂层,并和SS微型图象)五个不同时期(2、4、8、12和24小时)。MTT试验显示细菌生存能力增加从4到8 h无论表面处理。最低的观察细菌殖民化SS-patterned表面两次(数字6 (c)和6 (f))。建筑面积的百分比在4 h SS-polished没有显示差异,SS-coated和SS-patterned表面(分别∼33%,34%,和31%)。然而,在8 h,覆盖面积的百分比显示减少的一个重要SS-patterned表面SS-polished相比(23%)(47%)和SS-coated(51%)的表面。

细菌粘附量化cfu从2增加到8 h,然后下降24 h(图7)。党卫军涂层显示之间在统计上有显著差异的细菌粘附和殖民2和4 h ( )和2和8 h ( ),最大的殖民时观察到。统计上显著的减少从8到24小时观察( )。党卫军微型图象显示最低的细菌粘附和殖民,并在不同的时间被发现没有明显的统计学差异。控制表面不锈钢抛光,统计上的显著差异被发现在细菌之间的附着力4和8 h ( )。然后,显著减少观察24小时( )。组,有显著统计学差异控制党卫军抛光和SS涂层( )和SS涂层和SS微型图象之间( )4 h。同样,控制党卫军抛光和SS微型图象统计上显著差异( )和SS涂层和SS微型图象之间( )8 h被发现。扫描电镜的图像在不同的表面细菌粘附和殖民图所示8。

4所示。讨论

DPN和软光刻技术修改的目标生物材料表面分析这种方法是否会影响细菌粘附尚未发布到我们所知。因此,DPN在模型表面,用来制造模式和软光刻技术采用这样的模式转移到一个真正的生物材料表面。这种基质选择因为硅溶胶和聚合物粘合剂显示高亲和力与金属和非金属基板。

两个主要并发症出现在制造模式。首先,油墨很难应用在两个基板由于其高粘度,拥挤和断裂的技巧。拥挤的技巧,反过来,应用大量的油墨在一个地方,创建池塘衬底上的墨水。这是在硅表面尤其明显。小心NLP的校准和操纵系统是必要的,以抵消这种情况。在黄金基质应用墨水的过程更简单,虽然提示拥堵和池塘形成也被观察到。出血过多油墨的过程,提出了王et al。27),用于确保正确数量的墨水是沉积。然而,一些池塘观察制造模式时,其中一些后形成过程已经启动。其次,一些技巧并不总是携带足够多的油墨来创建一个特定的模式,所以空的点在一个特定的模式可以被观察到。纠正这种情况,在可能的情况下,现场通过创建另一个模式。

创建的特性与DPN在当前工作在微米(1 - 5的顺序µ米直径)和亚微米(身高100到400海里),尽管nanometric大小(50 - 100 nm)可以达到36]。地形设计考虑这一事实变异链球菌组织在短链和集群,在扫描电镜观察到的图像,所以物理障碍(点高度和间距)必须建立在这样一种方式,他们应该围绕组织的细菌而不是单个细菌,因为它提出了功能在同一范围的大小作为细菌物种减少细菌粘附和殖民,因为这些特性作为物理屏障(5]。

重复过程简单,制造模式的尺寸硅和黄金是守恒的转移后不锈钢PDMS能够复制和转移功能低于阈值比在这项工作中创建(800海里)(37]。得到了硅涂层和有图案的表面后,表面特性的表面粗糙度和接触角测量分析表面疏水性。涂层或模式后不锈钢表面疏水性增加,这是根据其他研究在党卫军涂以硅(38- - - - - -41]。桑托斯et al。39]观察疏水性增加,但没有提供任何解释,而杨et al。41)获得的接触角值超过120°与硅溶胶形成使用teo和太作为前体在不同摩尔比和解释说,疏水性主要取决于表面化学和形态的二氧化硅薄膜。相反,Hosseinalipour et al。38)发现,亲水性增加teo比率增加时用硅溶胶与tetraethylorthosilicate (teo)和3-methacryloxypropyltrimethoxysilane (TMSM)在不同的摩尔比率。然而,最近,王et al。40)评估SS316L样品涂以硅溶胶准备使用teo和太作为前体在不同摩尔比率,发现增加疏水性teo:太比例增加。他们的接触角值相同的teo:太比获得在当下工作(40:60)是相似的(85°),高于裸SS316L样品(27°)。据王et al .,疏水性的增加在目前的工作可能是解释的甲基,反过来,会降低表面吸收水的能力(40]。在关于粗糙度,降低SS与二氧化硅涂层后,这也可能被解释成厚均匀的沉积二氧化硅薄膜,能够覆盖在表面屏蔽划痕,因此使其平滑。图案表面所表现出的最高粗糙度都由这一事实可能是诠释了PDMS显示粗糙表面(平均47.4±24.1 nm)和粗糙的材料可能会被转移到基板上。

细菌粘附的生物材料是一个动态的过程,和许多变量是参与表面属性,发挥重要作用的早期步骤附着力。在当前的工作中,细菌粘附的表面显示减少至少一个数量级与抛光和silica-coated SS316L,短时接触的研究具有重要意义(24小时)。这个菌株的粘附高峰到控制面(裸SS)的条件下,这些实验是8 h,所以这次是本研究最相关的。此外,低可行性观察12 h后可能由于培养基不是取代和细菌可能被剥夺的营养。此外,硅的表面图案是最艰难也最疏水性,而硅涂层表面亲水性和光滑,但他们表现出相反的行为细菌粘附。这些发现表明,最高的抗菌效果显示图案的表面可以被解释为一种物理而不是化学现象(硅)。可访问的接触面积是遵守相关的细菌,因为变异链球菌组织在短链,形成小集群,表面上创建的模式可能是物理障碍为集群组织、扩大,并找到对方,至少暂时没有出现在平面(抛光或涂层)。此外,大多数疏水表面显示最低的细菌粘附,这可能表明该菌株具有更亲水表面,所显示Satou et al。42)后发现,不同的菌株变异链球菌有一个亲水表面,亲水细菌显示高附着力亲水表面(43]。考虑表面改性及其对细菌粘附的影响,这项工作的结果与其他作者一旦协议显示,微型图象的引入降低了95%变异链球菌粘附在8 h,甚至高于被钟等。3)降低87%金黄色葡萄球菌在14天,类似于可能et al。4)介于99.9%和95.6因为他们评估不同的菌株。

当前工作提出一个替代方法表面改性DPN的结合和减少microstamping显示表面细菌粘附的修改。除了减少细菌粘附,这种组合呈现的是一系列的优势,包括DPN的事实显示高分辨率和是一个通用的技术,因为模式可以创建在任何衬底,只要存在化学亲和力,和软光刻技术是一种高通量技术抵消DPN的事实是一个非常低吞吐量的过程。DPN在现实生活中的生物材料的适用性驻留在创建任何模式在任何衬底使用复合油墨。一些限制必须事先得到解决,包括高成本和低吞吐量。在我们的考虑,结合软光刻技术克服了后者的限制。未来考虑应该包括再评价,评价不同的菌株,并使用multispecies表面效果的方法。

5。结论

表面图案通过DPN显示模式大部分地区是一个耗时的过程,但其高分辨率展示了一个合适的替代光刻制造的主,对于软光刻技术是必要的。此外,DPN的组合和软光刻技术改进过程,和更大的地区也可以减少时间。图案表面显示低比涂布或抛光表面细菌粘附。这项工作的结果表明,与这些结合物理表面改性技术是一个成功的方法来减少细菌粘附在生物材料和生物膜的形成,这可能帮助防止biomaterial-related感染。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这部分工作由拉西的对位el Desarrollo de la Investigacion (CONADI)从大学Cooperativa de哥伦比亚(批准号A21-R22)和哥伦比亚大学Nacional de塞代麦德林。作者想表达最真诚的感谢Johana古铁雷斯,理学硕士,生物技术和纳米技术的员工从实验室Tecnoparque SENA的宝贵的援助在DPN实验和AFM鉴定。

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