文摘
介绍了DNA疫苗的第一代以来1988年,显著改善了提高疗效和免疫原性。尽管人类临床试验表明,运送DNA疫苗耐受性良好,安全,这些疫苗的效力在人类有点小于最优。发展一种基于基因疫苗,是足够有效批准临床使用在人类将之一,如果不是最重要的,在疫苗迄今为止。本文强调了文学与基于基因疫苗,特别是DNA疫苗,并提出可能的方法来提高性能。此外,我们探讨的想法结合RNA和纳米材料可能的关键的成功基于基因疫苗预防和治疗疾病。
1。介绍
近年来基于基因疫苗都已经被广泛地研究过了,希望释放他们的潜能,对传染病的预防或治疗工具,癌症、自身免疫性疾病和其他条件产生的分子缺陷。理想的疫苗是安全的,高免疫原性,nonintegrating,易于操作,稳定,廉价生产。除了这些特点,治疗性疫苗不能受到任何既存的病人的免疫与疫苗运载工具(1- - - - - -5]。
基于基因疫苗方法这个理想和演示几个优势传统疫苗。然而,基于基因疫苗,特别是DNA疫苗,产生了令人失望的结果在人类临床试验,表明了这个谜题。基于基因的方法需要一个性能提升之前,这些疫苗将适合诊所。一种方法可能是探索使用核糖核酸疫苗的好处,而不是DNA疫苗。这种方法提出了稳定和交付的问题,进而提出纳米材料潜在的角色,基于基因疫苗的重要组件。
利用纳米材料作为稳定的基于基因疫苗运载工具。小尺寸和大表面积,纳米材料有能力提供高负载的DNA或RNA (6),从而增加基于基因疫苗的功效。最常见的纳米材料研究了疫苗交付是金属和磁性纳米颗粒,nanoliposomes,树枝状分子(7]。本文涉及基于基因疫苗的最新进展及其优势的诱导细胞和体液反应。RNA的想法,随着纳米材料,可以发挥重要作用的发展理想的基于基因疫苗也在讨论,以及纳米材料的潜在优势的绑定,稳定,和交付。
2。概述当前疫苗的方法
传统疫苗是由重组蛋白、减毒活疫苗病毒、纯化细菌或病毒组件,或配合的蛋白质与多糖运营商(3]。这些疫苗有很长的记录并已广泛用于消除许多传染病,如天花、脊髓灰质炎、白喉(8]。然而,传统的疫苗有许多问题。例如,重组蛋白疫苗的生产成本非常高,往往是乏味的净化,而且也不能有效地诱导CD8+T细胞(3,4]。传统疫苗使用重组病毒有他们自己的风险,包括降级、无意的传播感染,插入突变,诱导自身免疫(3- - - - - -5]。除了这些风险,有很多疾病的常规疫苗是无效的;另外,基于基因疫苗表现出巨大的承诺在其中的几个领域,包括癌症(7,9)、肺结核(10,11],艾滋病毒[12,和疟疾13,14]。
3所示。DNA疫苗
3.1。交付
DNA疫苗背后的概念是由沃尔夫等人使用报告基因表明转染的细胞类型依赖于传递的路线和方法(15]。DNA疫苗可以送到细胞由几个不同的路线,包括,但不限于,肌内,表皮内的,静脉注射,鼻内,口服和皮下的交付1,4,16,17]。交付方法有很多,包括注射、纹身,particle-mediated即peg轰炸,电穿孔,激光和超声波。肌内注射是最常见的方法,它主要是导致转染细胞(4,15,17,18]。
在寻找一个交付方法,诱发更强的免疫反应,都花费了大量的精力来particle-mediated即peg通过基因枪轰击。对于这个方法,重组质粒DNA,包含基因编码为一个特定的抗原,是贴在惰性粒子,如黄金微粒,被迫通过高压枪靶细胞。交付通过基因枪已经受雇于表皮角化细胞的直接转染,朗格汉斯细胞,树突状细胞(19,20.]。门德斯等人所进行的研究表明,DNA疫苗所需剂量诱导小鼠的充分保护的挑战利什曼虫主要利用基因枪五倍小于皮下或肌内注射21]。有趣的是,另一项研究报道,大约100倍所需DNA是一个等价的免疫反应不及,通过小鼠注射针(22]。这两个研究清楚地表明,DNA疫苗的功效提高当由particle-mediated即peg技术而不是肌肉注射。
3.2。的作用机制
虽然确切的机制和途径仍在调查中,DNA疫苗被认为是相对简单的工具进行转染,导致抗原与免疫反应的最终目标产量。质粒DNA编码所需的抗原是哺乳动物启动子的控制下,可以无缝地在细菌(23]。优化,所需的基因序列是由几种方法之一,和质粒被运送到细胞核,它使用宿主的转录和转译机械产品生产所需的蛋白质。蛋白酶裂解蛋白肽,可随后提出的MHC类分子诱导CD8+T淋巴细胞(3,4,24,25]。树突细胞吞噬然后通过MHC抗原表达类我和MHC II级分子,从而诱导CD4细胞+和CD8+T淋巴细胞数量(19,20.]。这种疫苗接种方法的主要优点是内生的编码抗原的表达,导致要么直接处理的蛋白质抗原呈递细胞或cross-presentation如图1(19- - - - - -29日]。
3.3。潜在问题
目前文献中普遍的共识是,DNA疫苗被认为是安全的,因为他们不是生活,不要复制。然而有一些担心了,如自身免疫的感应与病人的DNA (23,30.),以及无向集成,这可能会导致插入突变诱导癌基因或沉默肿瘤抑制基因(16,31日]。质粒生产中,抗生素抗性基因作为选择工具,这使用了担心抗生素耐药性可能被转移到病人的肠道细菌16,32]。完全消除这个问题,还有其他选择的方法是可用的,包括营养缺陷型互补(33],阻遏滴定[34)和蛋白质解药/毒药选择策略(35]。尽管存在这些担忧,DNA疫苗有一个完美的安全记录在临床前和临床试验工作16,23]。因为这个记录,这些潜在的安全问题,虽然密切监测,已成为次要尝试提高疗效和DNA疫苗的免疫原性。
3.4。增强DNA疫苗
有许多可能的方法来提高疗效和免疫原性。正如前面提到的,送货的路线和方法可以对疫苗接种的结果产生深远的影响。密码子优化,启动子序列,内含子,增强剂,聚腺苷酸化信号,unmethylated胞嘧啶,鸟嘌呤,二核苷酸(CpG)重复可以修改在蛋白质的表达质粒产量最大的产品(32,36- - - - - -41]。另一个流行的选择是使用配方佐剂。最常见的包括蛋白质,使共轭小分子、脂质体、微-纳米颗粒(3,6,7]。答案的问题提高疗效和DNA疫苗的免疫原性可能驻留在小说相结合的方法。目标是提高效益的一个有效的交付系统结合不同佐剂。纳米材料,可以作为运载工具和稳定佐剂(7,42),有可能起到至关重要的作用,将在稍后讨论。
4所示。核糖核酸疫苗
4.1。简化的作用机制
核糖核酸疫苗的一个主要优点是,RNA在细胞质中,直接翻译蛋白质,因此绕过核本地化和转录所需的DNA疫苗(3,4]。就像在DNA疫苗,核糖核酸疫苗激活细胞和体液免疫反应的通路(42- - - - - -52]。其他优点的RNA是容易退化和从组织迅速清除,导致更大的控制权的结果47]。这种情况与DNA疫苗携带插入突变的风险,从而改变宿主细胞基因表达在一个不受欢迎的和无法控制的方式。
大量的研究存在关于RNA在不同形式的使用,包括信使RNA,短干扰RNA,剪切位点转换低聚物(42- - - - - -52),其中一些将在本文稍后讨论。也有双链RNA的兴趣激增,特别是polyinosinic: polycytidilic酸,也称为聚我:C。多聚肌苷酸是一种很有前途的佐剂疫苗,特别是癌症,因为它是一种强有力的免疫刺激剂和强大的活化剂的toll样receptor-3 TLR3和黑色素瘤differentiation-associated protein-5 (MDA5) [42,53]。
4.2。稳定的储存和交付
另一个普遍的担忧是,RNA太不稳定了,储存和交付在基因治疗是一种有效的角色。尽管RNA是不稳定的,新的证据表明,它可能是更适合比研究人员最初认为的疫苗(43,44]。期间的困难与RNA稳定存储正在解决,解决问题期间与稳定交付被解决。虽然一些研究已经证明,甚至不受保护的RNA可以诱导细胞毒性T淋巴细胞反应的患者(5,51- - - - - -55),目前正在努力稳定RNA分子为了交货效率和增强效果。
RNA与DNA疫苗疫苗避免很多潜在的问题,他们需要一个不太复杂的通路发挥作用。核糖核酸疫苗很可能成为未来成功的重要疫苗策略战斗传染性疾病,癌症和其他疾病引起的分子缺陷。然而,与DNA疫苗一样,有一些困难需要克服之前核糖核酸疫苗可以优化到理想的基于基因疫苗。稳定和交付的主要目标是优化,和纳米材料提供了很有前途的候选人为这些目标。
5。纳米材料:失踪的拼图的
纳米材料这一术语包括范围广泛的和迷人的,分子和化合物。但是,对于本文的目的,重点将选择纳米材料能够提高基于基因疫苗的交付和效果,特别是核糖核酸疫苗。纳米材料由于其独特的物理化学性质,是基于基因疫苗前景的平台。他们提供了许多生物医学的优点,包括增加稳定性,有效的交付,理想的biodistribution,和特定的细胞定位,只列出了其中的一些(53]。纳米材料的吸收细胞,特别是细胞免疫系统的,是受许多因素的影响53,56- - - - - -60]。不同的纳米材料及其独特的特征,如大小、形态、表面化学,在特定的内化途径中发挥作用,纳米材料对细胞的影响,及其biodistribution [56- - - - - -59]。
有许多nanomaterial-mediated交付核酸的方法和优势。为基于基因疫苗病毒运载系统相比,nanomaterial-mediated运载系统提供更高的载荷和更稳定的潜力。通常当纳米材料与生物分子,结果是改善稳定,生物相容性,保留其他可取的特点为纳米颗粒和生物分子(42,55]。这些改进是重要的,传送到身体接触生理体液,核酸酶,和其他生物组件为纳米材料创造无尽的障碍:核酸复杂达到其目标。
5.1。金纳米粒子
像DNA疫苗,RNA可以粘贴到功能化金微型飞行器或纳米粒子和由particle-mediated即peg轰炸(48,56,57]。金的表面可以携带特定的肿瘤靶向制剂,这往往是为特定的靶细胞表面的受体配体不会对其他细胞表达。这个目标代理增加疫苗的转染效率。,等人使用功能化金particle-mediated基因枪提供三种不同的信使rna分子成几个组织类型。从RNA转录蛋白表达的三个报告基因检测在体外交付在单层和悬浮细胞培养,在鼠肝组织内,小鼠肝脏和表皮组织在活的有机体内交货(48]。
Sandhu等人完成的实验表明,金纳米粒子是八倍更有效地压缩和交付核酸比常用的聚乙烯亚胺聚合物(57]。鱼精蛋白,arginine-rich蛋白质,可用于与RNA和金纳米粒子。鱼精蛋白,这是必要的DNA在精子发生凝结,也增强了RNA的稳定和保护从冷凝RNA RNA降解成纳米颗粒。除了函数作为RNA的稳定器,鱼精蛋白是cell-penetrating分子和作为一个强大的免疫系统危险信号,激活免疫反应通过myd - 88依赖途径(46]。德龙等人报道,结合核酸:鱼精蛋白与金纳米粒子形成一个复杂nanocomplex可以分析动态激光光散射粒子分析(dll),凝胶转变流动性分析,荧光55]。在其他工作中,研究者报道,RNA结构和疫苗生物活性保留即使暴露在物理、化学和热降解。他们表明,RNA的生物活性是守恒的利用剪切位点转换分析和交付核对抗癌症的一个关键目标,b - raf [55]。nanocomplex形成核交付的示意图如图2。重要的是要注意,冷凝鱼精蛋白的RNA,并把它贴在金纳米粒子可能是有用的对于许多类型的RNA,包括核、反义RNA,信使RNA。
5.2。Nanoliposomes
稳定的另一个常见的方法是使用脂质体,或nanoliposomes保护运营商的核酸。脂质体是阳离子脂质形成稳定复合物通过静电相互作用与带负电荷的核酸(49]。核酸的协会与脂质在带正电的粒子足够小或聚合物结果条目通过带负电荷的质膜内吞作用,导致double-bilayer泡的形成。在成熟的过程中核内体的溶酶体,核内体可能破裂,核酸货物可以释放到细胞质中。易位的核基因表达可能导致DNA (49- - - - - -51]。除了细胞内吞作用进入,如图3,nanoliposomes也可能与细胞膜融合和卸载货物直接进入胞液。
表面电荷的变化在nanoliposomes可以提高交货和细胞吸收。脂质体本身可以免疫刺激性,这一特性可以提高疫苗的免疫原性,或者他们可以涂上一种聚合物,如聚乙二醇衍生品等,以防止免疫系统的识别(3,7,50,51]。数据显示,抗原递呈细胞比索取更能够隔离nanoliposomes脂质体。阳离子脂质体在诱发免疫反应更强大的比阴离子或中性脂质体。脂质体的表面也可以修改各种配体允许针对特定组织或细胞49,50]。
5.3。树枝状分子
树枝状分子高度支化聚合物的高密度积极的表面电荷。Polyamidoamine (PAMAM)树枝状分子能够凝结核酸纳米颗粒;这样的缩合可以保护他们免受核酸酶降解[7,55]。树枝状分子也已知cell-penetrating分子。有不同的代PAMAM树枝状分子,这个参数,随着size-to-charge比率,是重要的稳定纳米粒子的形成61年]。增加PAMAM树形分子的一代已经相关交付效率的增加,然而众所周知,代树枝状分子也越高细胞毒性(59- - - - - -65年]。核酸绑定与细胞毒性特征必须仔细平衡,经常执行的功能化聚合物分支。这种功能化的一个例子是PAMAM树枝状分子的胺乙酰化作用。这乙酰化作用减少小干扰rna的树枝状分子的相互作用,从而促进解目标细胞的核。释放的增加聚合物的核货物单元中导致转染效率的增加(61年,64年]。
不同代PAMAM树枝状分子已经复杂到其他纳米粒子稳定和提供DNA和RNA (61年]。锅等人复杂的磁nanopartcles PAMAM树枝状分子和反义生存素寡核苷酸。人类细胞在乳腺癌和肝肿瘤与这些nanocomplexes孵化,随后,样本被分析3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT),定量rt - pcr,免疫印迹,透射电子显微镜。结果表明,在15分钟内,nanocomplexes已进入肿瘤细胞的差别和重要对这些目标生存素观察基因及其蛋白产品。作者报道,此外,细胞增殖抑制存在剂量依赖的相关性和时间的方式61年]。
5.4。纳米材料和Nanotoxicity
纳米材料可以有非常不同的物理化学性质与散装材料相同的化学成分。其中的一些属性(体积小、表面积大等),使纳米材料的生物医学使用也产生细胞毒性的潜在风险。各种纳米材料从众多的实验结果表明,大小、表面积、形态、表面化学,化学成分的主要决定因素是纳米材料的吸收和细胞毒性54,56- - - - - -65年,67年,68年]。就像许多其他纳米科学,研究nanotoxicity变得强烈关注的领域;然而,研究人员仍在试图开发一种改进途径和机制的理解。
实验由Kroll et al。62年]证明了物理化学性质对细胞毒性的影响通过使用不同组的工程纳米颗粒具有相同的化学成分。例如,使用的一些样品使用相同的粒子准备准备,但是一个样本分散博士其他样品的表面积不同,不同粒径、表面化学。研究人员使用了三个在体外化验在十个不同的细胞系监控不同阶段的细胞毒性:氧化应激、细胞代谢活动,和细胞死亡。本研究的结果,虽然太广泛的阐述,证实了在体外毒性不能链接到一个特定的物理化学性质的纳米材料。Kroll等人建议的反应是由于合并后的影响大小、形态、表面化学、纳米材料和化学成分,但也程控依赖,影响和结果取决于所使用的端点来衡量毒性。
因为树枝状分子有巨大潜力作为治疗核酸的运载工具,重要的是要利用这一潜力,同时平衡细胞毒性的影响。有许多方法可以降低细胞毒性,同时保持最优函数,包括绑定亲水性聚合物侧基的最外层的分支,创建half-generation树枝状分子和修改一些阳离子胺组中和他们(59- - - - - -65年]。
金纳米粒子通常被认为是安全的和生物相容性68年- - - - - -72年]。Chithrani等人所进行的研究表明,50纳米球的柠檬酸ligand-stabilized金纳米粒子是由海拉细胞内源性迅速超过14 nm和74 nm范围(68年]。古德曼等人研究了阳离子和阴离子金纳米粒子和确定阳离子微粒表现出温和的毒性,而阴离子黄金粒子无毒(69年]。研究人员建议,毒性的机制与最初的静电绑定阳离子微粒带负电荷的细胞膜,而从细胞表面阴离子微粒被击退,从而降低毒性。在实验中研究了金纳米粒子的形态对吸收的影响和毒性,再次执行Chithrani et al .,是决定纳米棒和团簇都是由海拉细胞,尽管纳米吸收速度慢得多(70年]。其他纳米材料,如氧化铁(73年,74年],氧化锌[75年- - - - - -77年],二氧化硅[78年,79年,量子点80年),更多的是接受调查他们潜在的可以使基因传递载体的生物相容性。
6。总结
总之,寻找理想的疫苗导致了基于基因的方法,因为他们有很多优势传统疫苗。基于基因疫苗的基本优势是它们诱导细胞和体液免疫系统的途径,能力,传统疫苗已无法实现。DNA疫苗的性能的问题引起的想法使用各种形式的RNA的DNA。尽管RNA提供明确的优势用于DNA疫苗,这种方法生成新的问题与RNA稳定储存和交付。很多RNA稳定性的担忧已经解决,稳定和使用纳米材料作为运载工具可能是解决这些问题的关键。表1总结当前的优势和挑战不仅DNA和RNA的疫苗,而且核糖核酸疫苗增强纳米材料,我们认为基于基因疫苗的未来。
7所示。结论
在地平线上,纳米材料可能在最后能够兑现的承诺基因疫苗和实现有益的蛋白质组的变化。核糖核酸疫苗,可以坚定地翻译成蛋白质抗原,可以更有效地引起免疫治疗Th1、Th2反应,代表一个强大的和有前途的解决方案治疗到目前为止没有发现的癌症和传染病。这个解决方案的关键将识别允许RNA的纳米材料进入细胞,绕过细胞膜,同时保护RNA从许多核酸酶,可以摧毁它。这条路线可能会使更长期和持续的编码蛋白的表达,因此,考虑在加大对整个蛋白质组模式的关键细胞免疫系统。进一步的工作,可以构建RNA nanoconjugates这些关键功能构建到他们。
目前,这是一个巨大的努力确定纳米材料,同时提供上述优势,引出所需的细胞蛋白质组的变化,但没有麻烦的,非标靶或其他不良影响。蛋白质组是复杂的,我们理解它如何能调制选择性地发展。这些bionanoconjugates绑定的影响,稳定,和交付的DNA和RNA的疫苗,除了这些小说如何bionanomaterials“提示蛋白质组”可能是21世纪的关键科学问题之一。
确认
作者要感谢我们的合作者,特别是理查德·加拉德博士和Christopher Field博士的慷慨支持,鼓励,和有益的讨论。r·k·Dlong k . Ghosh m·克雷格和一个。支持Wanekaya面积/ R15授予国家癌症研究所的资格,“抗癌RNA Nanoconjugates”(1 R15 CA139390-01)。