用于活性肿瘤靶向和光热疗法的金纳摩码生物缀合物

摘要

活性肿瘤靶向的掌握是近红外光热疗法（NIRPTT）的巨大挑战。为了提高靶向治疗恶性肿瘤的效率，我们改变将金纳米颗粒与肿瘤特异性抗体缀合的技术。制备聚乙二醇涂覆的（聚乙二醇化）金纳米棒（GNR）并与抗EGFR抗体缀合。通过比较缀合之前和之后GNR的抗体结合和光热效果来表征GNR的共轭效率。我们证明与聚乙二醇化的GNR缀合的抗体的结合效率与未改性抗体的结合效率相当，比廖和哈卜纳（2005）报道的聚乙二醇化抗体-GNR缀合物大的33.9％。此外，NIRPTT的细胞死亡足以杀死近90％的肿瘤细胞，其与NIRPTT单独验证使用GNRS的NIRPTT不通过GNR与抗体缀合而损害。

1.介绍

癌症治疗的最大障碍之一，无论是过去还是现在，是积极靶向和选择性治疗恶性细胞而不伤害正常细胞的能力。近红外(NIR)光热疗法(PTT)利用金纳米颗粒(GNPs)和近红外光治疗恶性肿瘤在体外和体内已证明希望作为癌症的治疗方法[1- - - - - -11］．集体概念将导致靶向，成像和治疗恶性肿瘤的单一形式。通常，PTT以GNP的形式利用造影剂，其在NIR光谱范围内具有等离子体共振，其中正常组织是透明的。GNP将吸收的NIR光能转化为热热能并引起细胞死亡。即使已经证明了PTT的治疗性质，也需要进一步发展活性靶向组分。

目标战略是在体外和体内对一些成功的ptt进行的研究在体外纳米颗粒偶联肿瘤靶向抗体的实践尚未实施体内楷模。例如，已经显示了SIO₂-核金壳纳米球[3.]和金纳罗od [4]与单克隆抗体（mAb）缀合并用于NIR PTT在体外．这体内由相同的研究组进行的研究利用针刺PTT的未缀合的纳米颗粒[12，13[肿瘤血管系统引起的增强渗透性和耐保留（EPR）效应是肿瘤部位纳米颗粒组装的原因。然而，EPR效应是一种被动靶向策略，允许流浪纳米颗粒分散在整个身体上并在非肿瘤相关的位点中积聚。另一方面，活性靶向需要使用共价键的成功GNPS-抗体缀合，以确保对肿瘤的特异性递送。

将金纳米颗粒与使用共价键合的金纳米颗粒的标准由本地的先驱公布，Liao和Hafner [14］．然而，需要耐用的共轭过程来保护缀合物免受身体的生理条件，减少非特异性结合，确保将纳米颗粒的活性递送到恶性肿瘤部位，并增加NIR激光处理的功效。掺入活性靶向方法将改善PTT的影响使其成为一种可行的方法，用于过度表达表达表皮生长因子，结直肠癌，卵巢癌，颈椎，乳腺癌，膀胱，胰腺癌和前列腺癌的各种癌．在这项研究中，我们报告了辽化抗体-GNRS缀合物的廖和赫克纳方案的比较[14]，从而使GNRs与肿瘤靶向抗体的偶联效率提高33.9%。

2。材料和方法

２.１.抗体

西妥昔单抗(ImClone Systems, New York, NY)是一种重组人/小鼠嵌合单克隆IgG抗体，用于本研究。该单克隆抗体特异性结合人EGFR的细胞外结构域，该结构域在头颈部肿瘤中过度表达。西佗昔单抗由小鼠抗egfr抗体的Fc区和人免疫球蛋白IgG1重链和kappa轻链恒定区组成，分子量约为152 kDa。西妥昔单抗以2mg /mL的水溶液提供，水溶液中含有氯化钠、磷酸二钠七水合物、磷酸二钠一水合物，pH值从7.0到7.4。

2.2。交叉角

长链琥珀酰亚胺酰6-（3- [2-吡啶二硫基] - 丙钠酰胺）己酸酯（LC-SPDP），MW = 425.52g / mol，间隔臂长度埃（Thermo Scientific，Rockford，IL）用于生物缀合物的甲豆蛋白到金纳米棒。LC-SPDP是异质官能，硫醇可切割和膜可渗透的交联剂。LC-SPDP含有胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，与赖氨酸残基反应，在抗体表面形成稳定的酰胺键。间隔臂的另一端端接在吡啶二硫基上，它将与巯基反应形成可逆的二硫键，并与巯基聚乙二醇化金纳米棒反应。

2.3。金纳罗德制造

根据SAU和MURPHY描述的方法制造金纳米棒[15]总结如下。

股票的解决方案准备
将30毫升HPLC级水置于冰上。虽然水的温度冷却至0摄氏度，但制备了其他溶液：1mm金（III）氯化物三水合物，（Haucl₄h·3₂O) (Sigma-Aldrich)， 200 mM十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) (Sigma-Aldrich)， 78.8 mM抗坏血酸和32 mM AgNO_3.(Sigma-Aldrich)。用小于50°C的热水浴溶解CTAB。将冰冷的水迅速加入NaBH中₄从NaBH开始溶液又变回冰₄溶液不稳定，在室温下迅速分解。

种子溶液制备
2.5毫升1毫米的Haucl₄h·3₂O;5 mL 200 mM CTAB;和0.6 mL冰水10 mM NaBH₄室温(25°C)孵育2小时后使用。这最后一步需要分解剩余的NaBH₄为了防止在生长溶液中出现不需要的种子。在这个阶段的种子溶液应该是米色褐色的颜色。

增长的解决方案准备
17-20毫升1 mm Haucl₄h·3₂O和17-20 mL 200 mM CTAB联合80-120l 32 mm agno_3.，280-360. μ.78.8 mM抗坏血酸，60-80μ.L种子溶液。溶液颜色从黄色橙色变为无色，然后最后到深粉红色。纳米棒在室温下允许在2小时内生长2小时。纳米₄应该在这个阶段完全分解。

２.４.聚乙二醇在金纳米棒生物功能化中的应用

采用表面活性剂CTAB作为封盖剂制备了纳米金棒，控制了纳米金棒的尺寸。用聚乙二醇(PEG)取代纳米棒表面的CTAB的过程被称为“聚乙二醇化”，即纳米棒被“聚乙二醇化”。聚乙二醇化是有利的，因为它增加了生物相容性和稳定性，降低了免疫原性和对带负电荷的血管管腔表面的吸附，并抑制了带电分子的非特异性结合[5，16，17］．在CTAB去除过程中，纳米棒在(7000 g, 20分钟)离心，滗出，颗粒在2ml的100 mM PBS-EDTA中重悬。然后使用1 mM端硫醇甲氧基聚乙二醇(mPEG-SH) (MW)对纳米棒进行生物功能化和聚乙二醇化， Nanocs, New York, NY)和2毫米碳酸钾(Acros, Fair Lawn, NJ)，并孵育过夜。PEG的硫醇基团与金纳米棒表面形成共价键取代CTAB。使用VersaMax微孔板阅读器测定纳米棒的相对光密度和浓度。聚乙二醇化纳米棒的测量浓度为毫克/毫升。聚乙二醇化纳米棒的光密度为(~ 1.73×10¹²GNRs/mL)，除非另有说明。用紫外-可见分光光度计计算吸收光谱的平均峰．通过透射电子显微镜(TEM)成像来验证形状和尺寸的一致性。

2.5。金纳米棒与抗体缀合，然后聚乙二醇化

首先根据廖和哈卜纳呈现的方法首次生物缀合金纳米棒[14］．金纳米棒与抗体的生物偶联是用LC-SPDP按照提供的程序进行的。将小瓶LC-SPDP试剂平衡到室温后，在二甲基亚砜DMSO (Sigma-Aldrich)中制备20 mM LC-SPDP。西妥昔单抗未加修饰。将25毫升LC-SPDP溶液加入1毫升西妥昔单抗溶液中，室温孵育60分钟，得到计算出的连接子:抗体摩尔比为37:1。西妥昔单抗混合物通过Zeba脱盐旋转柱(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)或Microcon离心过滤装置(Millipore, Bedford, MA)交换到1ml纯PBS-EDTA缓冲液中。反应的副产物、过量的西妥昔单抗和过量的LC-SPDP也被脱盐柱除去。将40毫升生纳米棒离心(7000 g, 20分钟)，滗出，然后用1ml PBS-EDTA重悬。将2.5微升的抗体/交联剂混合物加入纳米棒溶液中，然后在室温下培养过夜。然后通过添加10将纳米棒聚乙二醇化μ.L 1毫米mPEG-SH和100μ.L 2 mM碳酸钾在室温下再次培养过夜。最后，将生物共轭纳米棒离心、滗析，并在PBS-EDTA中重悬数次，以去除多余的CTAB和未反应的mPEG-SH [14］．

2.6。抗体与聚乙二醇化金纳米棒的结合

聚乙二醇化金纳米棒与抗体西妥昔单抗结合，采用类似Liao和Hafner的方法[14]一种主要改性 - 缀合和聚乙二醇化的顺序。西妥昔单抗和LC-SPDP交联剂以不同的摩尔比合并，脱盐，然后加入预先聚乙二醇化的纳米棒。代替聚乙二醇化，共轭纳米棒交联 - 抗体单元，已经生物相容性的聚乙二醇化纳米棒与抗体交联。在我们的协议中，通过以下修饰进行金纳米棒对抗体的生物缀合物。将四十毫升的原料纳米棒离心（7000g，20分钟），倾析，然后重悬于1ml的PBS-EDTA中。然后通过添加10将纳米棒聚乙二醇化μ.L 1毫米mPEG-SH和100μ.L 2 mM碳酸钾，培养过夜。将生物功能化的纳米棒离心、滗析，并在PBS-EDTA中重悬数次，以去除多余的CTAB和mPEG-SH。在DMSO溶液中加入不同数量的20mm交联剂LC-SPDP，加入1ml西妥昔单抗，室温下孵育60分钟，产生可调节的连接剂:抗体摩尔比。100 - 200μ.将L的抗体/交联剂混合物加入到聚乙二醇化的纳米棒中，然后在室温下温育过夜。使用Zeba Desalt旋转柱（Pierce Biotechnology，Rockford，IL）或微管离心过滤装置（Millipore）来交换PBS-EDTA的缓冲液，并除去聚乙二醇化纳米杆抗体复合物的反应副产物。

2.7。聚乙二醇化和纳米棒与抗体结合的顺序比较

在图1，我们总结了两种偶联协议的序列，我们将其分为三步进行比较，以清楚地说明金纳米棒与抗体偶联后聚乙二醇化过程的差异[14和抗体结合到聚乙二醇化金纳米棒上。

数字1(一)展示廖和赫夫纳的协议[14需要将交联剂加入抗体(第一步)，将抗体与金纳米棒结合(第2步)，然后进行聚乙二醇化(第3步)。相反，图1 (b)显示我们对Liao的改进，描述了将交联剂连接到抗体（步骤1），Pegymating纳米棒（步骤2），然后将抗体与聚乙二醇化纳米棒（步骤3）缀合（步骤3）。基本上，我们协议序列和Liao的差异[14方案是，我们仅Pegylate仅纳米棒不是纳米棒 - 抗体缀合物。

2.8。金纳米棒与抗体共轭表征

通过透射电镜检测金纳米棒/抗体的结构、一致性和效率。具体来说，我们使用碳铜网格，醋酸铀酰染色，FEI TecnaiT12 80千伏或120千伏(双TEM, Hillsboro, or)。我们在AMT (Danvers, MA) 2k相机上捕捉了金纳米棒的数字图像和共轭图像。用紫外-可见分光光度计测量透射率，计算等离子体共振吸收。采用改进的ELISA方法评价抗体与GNRs偶联前后的结合效率。我们增加了500μ.L PBS重组人体表皮生长因子受体（EGFR）/ ERBB1 FC Chimera，CF（50 μ.G / VIAL R＆D Systems，Inc。，明尼阿波利斯，Mn）终浓度为0.1mg / ml，并使用50 ng / 100 μ.l在pbs w / ca中的regfr⁺⁺和Mg涂层96孔板。用保鲜膜或封板覆盖，4°C孵育过夜。我们用1%的BSA在不含Ca的PBS中阻断平板⁺⁺对于非特异性结合的Mg，并孵育1小时RT或以4度储存直至使用。从孔中除去BSA或PBS，并加入样品，孵育1小时，并用PBS洗涤几次。通过珍珠脉冲成像仪（Li-Cor，Lincoln，Nb）分析样品。

2.9。近红外光热疗法

本研究使用了头颈部人鳞状细胞癌(Thomas Carey, University of Michigan, Ann Arbor, MI)细胞系SCC-5。HNSCC系保存在Dulbecco 's Modified Eagle培养基中，该培养基含有10%胎牛血清，添加l -谷氨酰胺、青霉素和链霉素，并在37°C的5% CO中培养₂．聚乙二醇化纳米棒的测量浓度为毫克/毫升。聚乙二醇化纳米棒的光密度为(~ 1.73×10¹²粒子/毫升)。聚乙二醇化纳米棒和纳米棒-抗体结合物的平均等离子体共振吸收为785 nm。使用近红外二极管激光器(SDL, Inc, San Jose, CA, 8350)对细胞进行光热治疗，曝光时间4分钟，波长785 nm, 9.5 W/cm²流量。用1：1稀释的台盼蓝进行细胞活力测定。

3。结果与讨论

在这项工作中，我们评估了一种方案，通过提高gnr与肿瘤靶向抗体的偶联效率来增强恶性肿瘤的靶向治疗。因此，我们可以改进纳米棒的交付，使NIR PTT更有效。通过修改现有协议[14]，我们利用共价键、巯基和酰胺基团化学来提高共轭效率。我们比较了共轭和聚乙二醇化的顺序及其对纳米棒形成簇、聚集的影响，以及两种情况下抗体结合效率的百分比。我们还比较了抗体偶联前后的结合效率以及偶联前后用于光热治疗的纳米棒的治疗效果。

3.1。纳米棒表征和生物官能化

本研究的第一个目的是通过优化抗EGFR抗体，西妥昔单抗来鉴定通过优化缀合参数来选择性地靶向恶性细胞的成功模态。通过用抗体缀合纳米棒，我们可以改善纳米棒的特异性。使用LC-SPDP交联剂和PEG-SH的纳米棒与抗体的缀合物的质量可以受到图中所示的步骤的顺序顺序的影响2．

图中的TEM图像2显示了聚乙二醇化和共轭顺序的物理差异，如图所示1一组金纳米棒。我们通过重复Liao和Hafner发表的方法得到的结果[14使用抗egfr而不是抗兔IgG抗体，如图所示2（a）．简而言之，结合的gnrs抗体单元被聚乙二醇化;这个过程导致了超过70%的纳米棒的个性损失，这里描述为聚集。为了克服这种聚集，我们将聚乙二醇化的gnr偶联到抗体上，如图所示2（b）．我们在各种形状和尺寸的集群中观察到超过70％的GNR。在图2（c）在美国，我们展示了没有抗体或交联剂的聚乙二醇化gnr作为对照。我们没有发现如图所示的聚合2（a）或者在图中群集2（b）使用相同浓度的gnr。这表明纳米棒与抗体的相互作用受偶联顺序和聚乙二醇化顺序的影响。

抗体结合效率也受到聚乙二醇化和缀合令的影响。使用未缀合的抗体作为结合效率标准，我们调查了由图中所示的协议产生的结合效率1采用改进的ELISA法。在图3.，我们总结了滴定抗体浓度的结果，并且没有任何稀释抗体浓度。

我们观察到，在这两种情况下，抗体结合效率随着抗体浓度的增加而增加。在不稀释抗体浓度的情况下，我们测量了结合到GNRs的抗体的46.5%的结合效率，然后使用Liao和Hafner协议聚乙二醇化[14与缀合与聚乙二醇化的GNRS的抗体的抗体的结合效率为80.4％。通过改变缀合和聚乙二醇化的顺序，我们证明了缀合抗体的结合效率的6倍。

我们的目标是优化光热治疗的一些参数，而不损害已经有效的方面，即抗体的靶向能力和纳米棒与近红外激光结合使用时的治疗能力。我们测定了未结合的抗efgr抗体与表皮生长因子受体抗原的结合能力。以未结合的抗体作为结合效率的标准，在0到5的尺度上，我们研究了抗体与聚乙二醇化纳米棒结合后的结合效率，如图所示4(一)．

我们发现在从0到5的比例下缀合后缀合后的结合效率略微改善，但考虑到标准误差，我们可以估计与聚乙二醇化纳米棒缀合之前和之后的抗体的结合效率大致相同。4(一)．该结合测定结果证实抗体在缀合后仍然结合。与纳米棒缀合之前和之后的抗体结合效率的9％差异在与纳米鳕与纳米棒缀合的抗体的结合效率相比，该抗体的结合效率然后具有0.29的结合效率的PEG化，与抗体的82％差异结合前结合。

以前的研究报告说，GNR介导的NIR PTT提供了大约95％的死亡率，这与缀合之前和之后的发现相当。在通过将GNR缀合至抗体来优化活性靶向组分的过程中，我们维持成立和成功实现的治疗能力。在图4 (b)，我们展示了将纳米棒与抗体缀合的效果在光热疗法上。该细胞活力测定显示在以前进行的治疗后死细胞的百分比在体外添加GNRs后不清洗细胞的研究[4］．近红外激光仅作为对照处理细胞，用激光和聚乙二醇化纳米棒，以及与抗egfr抗体结合的激光加聚乙二醇化纳米棒。这些处理后的死亡细胞百分比分别为4.5%，96%和89%。偶联过程前后纳米棒的治疗效果只有7%的差异，这可能与抗体和交联剂导致的gnr与细胞表面之间的距离有关。所有实验都是用9.5 W/cm的785 nm二极管激光器进行的²，约4分钟使用gnr(~ 8.65×10¹¹和300:1交联剂:抗体比率。

体内的生理条件需要一种有弹性和功能性的结合，以确保gnr向恶性肿瘤的最佳输送，并在到达时获得成功治疗。我们已经证实，偶联后，抗体的结合效率和GNRs的治疗能力分别与偶联前相当。为了进一步评价与GNRs的偶联性能和光热效应，我们用GNRs单独和偶联处理细胞，并用培养基洗涤三次以去除任何未结合的GNRs。我们观察到在表面上有一些吸附效应发生，但这在非常稀的GNRs浓度下是可区分的。在图5，我们比较了NIR PTT与GNRs单独和偶联后的细胞死亡百分比。

具有0.412,0.549,1.648和3.296的光学密度的GNR与14.3,19.1,11.12和9.52的抗体浓度缀合 μ.胃肠/ ml分别。我们展示了一种趋势，随着纳米码浓度的增加，细胞死亡增加。观察到由NIR PTT引起的细胞死亡百分比的差异，用于较低浓度与高抗体浓度相关的GNR。对于与在测定中使用的EGFR结合的抗EGFR抗体结合的抗EGFR抗体的结合效应也可能存在差异，如图所示3.图中用于细胞活力实验的SCC-5细胞表面表达的EGFR经过三次洗涤后的结合结果5．这里尚未研究抗体 - 纳米棒比和所得到的相对治疗效果和化学计量。

4.总结和结论

我们探索了优化参数，以提高使用共价键将gnr与抗egfr抗体西妥昔单抗结合的成功率。抗体与GNR的共价结合促进了纳米棒对肿瘤位点的主动靶向。这种主动靶向比以前报道的结果更有效[14使抗体-纳米棒结合物聚乙二醇化。我们通过比较金纳米棒与西妥昔单抗偶联前后的抗体结合效率和光热效应来表征金纳米棒与西妥昔单抗偶联的效率。与peg修饰纳米棒-抗体偶联相比，将抗体偶联到已聚乙二醇化的纳米棒上的抗体偶联效率要高出6倍(33.9%)[14］．我们发现，偶联抗体与表皮生长因子受体(EGFR)的结合能力没有受到偶联的影响，而偶联前的结合效率为3.93，偶联后的结合效率为4.4，从0到5。

此外，通过使用金纳米棒的纳尔光热疗的细胞死亡在金纳米棒与抗体的缀合之后不会受损。当用激光和聚乙二醇化纳米棒进行光热处理后的细胞的百分比仅为4％，当用激光加上与抗Egfr抗体缀合的激光加纳米棒处理后的11％的细胞相比。缀合过程前后纳米棒的光热治疗效果的差异仅为7％。用抗体 - 纳米棒缀合物的NIR光热处理选择性地加热GNR并且足以杀死近90％的肿瘤细胞，其与单独的GNR进行光热疗法相当。这些结果表明，纳米德抗体缀合物是未来改进的活性靶向剂体内研究。需要进一步的研究来确定抗体结合发生了什么，每个抗体有多少纳米棒结合，以及生物分布有哪些改进体内有效。这种活性靶向和随后的恶性细胞的光热处理的组合是一种可行的方法，用于治疗各种癌症类型，其过表达表皮生长因子，包括头部和颈部，结直肠癌，卵巢癌，颈椎，皮肤，乳腺，膀胱，胰腺，和前列腺癌。

致谢

该工作由国家物理科学财团，NSF授予：EPS-0814103和NIH / NIDCR R21 Grant：1R21DE019232-01A2。本工作的一部分已在2011年纳米粒子和纳米材料中提供给纳米颗粒和纳米系统（IC4N）的国际会议。作者感谢UAB高分辨率成像设施和Melissa Foley，以获得TEM成像。他们承认Yolanda Hartman，Jason Warram，Kirk Zinn，Renato Camata，Paul Castellanos和William Grizzle鼓励和支持讨论。

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