西妥昔单抗(艾克隆系统,纽约,纽约),重组体人/鼠嵌合单克隆免疫球蛋白抗体,被用于这项研究。这个单克隆抗体结合人类表皮生长因子受体的细胞外的领域,这是在头部和颈部癌症。西妥昔单抗的Fc地区由鼠anti-EGFR抗体和人类免疫球蛋白IgG1沉重和kappa轻链恒定区域和有一个近似152 kDa的分子量。西妥昔单抗作为2毫克/毫升的解决方案提供的含有氯化钠、磷酸氢二钠七水硫酸锌、磷酸氢钠一水合物,在水中,pH值从7.0到7.4不等。

长链Succinimidyl 6 -己酸酯类(3 - [2-pyridyldithio] -propionamido) (LC-SPDP) MW = 425.52克/摩尔,间隔臂的长度 = 15.6 埃(热科学,罗克福德,IL),用来bioconjugate西妥昔单抗金纳米棒。LC-SPDP heterobifunctional, thiol-cleavable,膜渗透交联剂。LC-SPDP包含一个amine-reactive N-hydroxysuccinimide (NHS)酯,与赖氨酸残基反应形成稳定的酰胺键表面的抗体。间隔臂的另一端是终止的吡啶基二硫集团将与含巯基的反应,形成一个可逆的双硫键,与硫醇反应聚乙二醇金纳米棒。

金纳米棒是捏造根据分和墨菲(描述的方法 15)总结如下。

黄金纳米制造与表面活性剂CTAB,作为覆盖剂来控制奈米棒的大小。的过程使用poly-ethylene乙二醇(挂钩)取代CTAB表面的纳米棒被称为“PEGylation”即“聚乙二醇纳米棒。“PEGylation是有利的,因为它增加生物相容性和稳定性,降低免疫原性和吸附带负电荷的血管支架表面,并抑制非特异性结合的带电分子( 5, 16, 17]。在CTAB切除过程中,纳米棒在离心机(7000克,20分钟),倾析,小球在2毫升的100毫米PBS-EDTA resuspended。纳米棒然后biofunctionalized,聚乙二醇,使用1毫米thiol-terminated methoxy-poly-ethylene乙二醇(mPEG-SH) (MW = 5000年 Nanocs,纽约)和2毫米的碳酸钾(记述、公平草坪,NJ)和孵化过夜。共价键形成硫醇基之间的挂钩和金奈米棒取代CTAB的表面。一个VersaMax标仪是用于确定相对光密度和浓度的纳米棒。测量浓度的聚乙二醇纳米棒 浓缩的 PEG-NR = 4.41 毫克/毫升。聚乙二醇纳米的光密度 OD PEG-NR = 8.24 (~ 1.73×10¹²GNRs /毫升)除非另有注明。紫外可见分光光度计是用来计算平均吸收光谱的峰值 λ = 784年 纳米 。成像通过透射电子显微镜(TEM)是用于验证形状和大小的一致性。

金纳米棒首次bioconjugated根据辽和Hafner给出的方法 14]。Bioconjugation金纳米棒与LC-SPDP抗体进行了以下提供的过程。后平衡LC-SPDP试剂瓶的室温,20毫米LC-SPDP准备在二甲亚砜,DMSO (Sigma-Aldrich)。西妥昔单抗应用没有修改。25毫升的LC-SPDP的解决方案是添加到1毫升的西妥昔单抗的解决方案,允许在室温下孵化60分钟产生一个计算链接器:抗体37的摩尔比率:1。西妥昔单抗的混合物被交换到1毫升的纯PBS-EDTA缓冲区使用Zeba淡化旋转列(皮尔斯生物技术,罗克福德,IL)或Microcon离心过滤装置(微孔,贝德福德,MA)。反应副产物,西妥昔单抗、过剩和过度LC-SPDP也被淡化的列。40毫升原始纳米棒的离心机(7000克,20分钟),倾析,然后,resuspended PBS-EDTA 1毫升。两个半每毫升的抗体/交联组合被添加到奈米棒在一夜之间解决方案,然后在室温下孵化。通过添加10纳米棒被聚乙二醇 μL(1毫米mPEG-SH和100年 μL 2毫米的碳酸钾在一夜之间又在室温和孵化。最后,bioconjugated纳米离心机,倾析,resuspended PBS-EDTA几次删除多余的CTAB和未反应的mPEG-SH [ 14]。

聚乙二醇黄金纳米抗体结合,西妥昔单抗,使用方法类似于辽、Hafner [ 14)一个主要modification-the接合的顺序和PEGylation。西妥昔单抗和LC-SPDP交联剂结合在不同摩尔比,脱盐,然后添加到先前聚乙二醇纳米棒。PEGylating,而是共轭nanorod-crosslinked-antibody单位,已经可以使聚乙二醇奈米棒的生物相容性,是抗体交联。在我们的协议,bioconjugation黄金纳米抗体进行了以下修改。40毫升原始纳米棒的离心机(7000克,20分钟),套利交易,然后resuspended PBS-EDTA 1毫升。通过添加10纳米棒被聚乙二醇 μL(1毫米mPEG-SH和100年 μL 2毫米碳酸钾和孵化过夜。纳米biofunctionalized离心机,倾析,resuspended去除多余的CTAB和mPEG-SH PBS-EDTA几次。LC-SPDP 20毫米的各种量交联剂,在DMSO溶液加入1毫升的西妥昔单抗和被允许在室温下孵化60分钟产生一个可调链接器:抗体摩尔比率。100 - 200 μL抗体/交联的混合添加到聚乙二醇纳米棒,然后孵化在室温下过夜。要么Zeba淡化旋转列(皮尔斯生物技术,罗克福德,IL)或Microcon离心过滤装置(微孔)交换缓冲区用于PBS-EDTA和删除聚乙二醇的反应副产物nanorod-antibody复杂。

在图 1,我们总结的顺序两个共轭协议,我们比较三个步骤清楚地说明过程的区别金奈米棒结合抗体PEGylation紧随其后( 14)和抗体结合聚乙二醇金纳米棒。

图 1(一)显示了辽和他的协议 14),要求将交联剂添加到抗体(步骤1),共扼的金纳米棒的抗体(步骤2)其次是PEGylation(步骤3)。相反,图 1 (b)廖的展示了我们的修改协议,描述了交联剂添加到抗体(步骤1),PEGylating的奈米棒(步骤2),然后接合抗体的聚乙二醇奈米棒(步骤3)。基本上,我们的协议序列的差异和辽 14)协议是我们PEGylate只有纳米nanorod-antibody共轭。

金奈米棒/抗体结合检查结构,一致性,通过TEM和效率。具体地说,我们只使用碳铜网格、醋酸双氧铀染色,范TecnaiT12 80千伏和120千伏(双TEM、Hillsboro或)。我们捕获了金纳米棒的数字图像,并且配合在AMT(丹弗斯,MA) 2 k的相机。紫外可见分光光度计百分比是用来测量透光率和计算等离子体共振吸收。改良ELISA试验被用来评估抗体绑定之前和之后的效率GNRs接合。我们增加了500 μL PBS重组人表皮生长因子受体(EGFR) / ErbB1 Fc嵌合体,CF (50 μ克/瓶的研发系统,Inc .,明尼阿波利斯,明尼苏达州)的最终浓度为0.1毫克/ 100 ng / mL和使用 μL在PBS rEGFR w / Ca^{+ +}和Mg外套96孔板。板上覆盖保鲜膜或板封口机和孵化一夜之间在4°C。我们封锁了板1% BSA在PBS w / o Ca^{+ +}和Mg非特异性结合和孵化1小时直到使用RT或储存在4度。BSA或PBS从井和样本添加,孵化1小时,用PBS好几次了。样本分析珍珠冲动成像仪(LI-COR、林肯、NB)。

头颈部鳞状细胞癌,(托马斯·凯里,密歇根大学安阿伯市MI),细胞系SCC-5,被用于这项研究。HNSCC线保持在杜尔贝科修改鹰中含10%胎牛血清,补充谷酰胺、青霉素、链霉素和孵化公司37°C的5%₂。测量浓度的聚乙二醇纳米棒 浓缩的 PEG-NR = 4.41 毫克/毫升。聚乙二醇纳米的光密度 OD PEG-NR = 8.24 (~ 1.73×10¹²粒子/毫升)。聚乙二醇纳米棒和nanorod-antibody配合使用平均785 nm的等离子体共振吸收。近红外二极管激光器(SDL公司,圣何塞,CA, 8350)被用来执行光照疗法的细胞,4分钟曝光时间,785 nm波长,9.5 W /厘米²影响。细胞生存能力分析与执行1:1台盼蓝的稀释。

第一个目标在本研究旨在确定一个成功的模式有选择地目标金纳米棒恶性细胞通过优化结合参数anti-EGFR抗体,西妥昔单抗。通过与抗体接合纳米棒,我们可以提高纳米棒的特异性。结合的纳米棒的质量使用LC-SPDP抗体交联剂和PEG-SH可以影响如图顺序的步骤 2。

TEM照片图 2显示的顺序的物理差异PEGylation接合,如图 1,对金纳米棒的集合。我们得到的结果重复辽和Hafner发布的方法 14)使用anti-EGFR代替anti-Rabbit IgG抗体在图所示 2(一个)。简而言之,共轭GNRs-antibody单位是聚乙二醇;这个过程导致损失了70%以上的奈米棒的个性,形容这里聚集。为了克服这种聚合,我们共轭聚乙二醇GNRs抗体,如图 2 (b)。我们观察到超过70%的GNRs集群的各种形状和大小。在图 2 (c)我们显示,聚乙二醇GNRs没有抗体或交联剂,控制。我们没有发现聚合像图 2(一个)或聚类图 2 (b)使用相同的GNRs的浓度。这表明nanorod-antibody交互影响的顺序结合和PEGylation。

抗体绑定效率也受到PEGylation和共轭秩序的影响。使用非结合的抗体作为绑定效率标准,我们调查产生的绑定效率协议如图 1使用修改后的ELISA测定。在图 3,我们总结滴定的结果没有任何稀释的抗体浓度和抗体浓度。

我们观察到抗体绑定效率随着抗体浓度增加而增加。没有任何抗体稀释浓度,我们衡量一个绑定效率46.5%抗体共轭GNRs然后使用辽和Hafner协议(聚乙二醇 14)和抗体绑定效率80.4%聚乙二醇GNRs共轭。通过修改接合的顺序和PEGylation,我们证明3年来的绑定效率改善共轭抗体。

我们的目标是优化光照疗法的一些参数在不影响已经有效的方面,即目标能力的抗体和治疗能力的纳米棒使用时结合近红外激光。我们测量的绑定能力非结合的anti-EFGR抗体抗原,表皮生长因子受体。使用非结合的抗体作为标准绑定效率规模从0到5,我们研究后抗体的结合效率共轭聚乙二醇纳米棒,如图 4(一)。

我们发现绑定效率略有提高接合后从3.93到4.4范围从0到5但考虑到标准错误,我们可以估计绑定效率大约是相同的抗体结合聚乙二醇纳米棒,之前和之后的人物 4(一)。这个绑定化验证实了抗体接合后仍然是绑定。绑定效率9%的差异之前和之后的抗体结合到纳米棒相对的绑定效率相比可以忽略不计的抗体结合到奈米棒然后聚乙二醇绑定效率为0.29,82%的差异从抗体接合之前绑定。

先前的研究报告,GNR-mediated NIR PTT提供了大约95%的死亡率,这是与之前和之后我们发现接合。在优化的过程中积极目标组件通过接合GNRs抗体,我们维持治疗能力,已经建立,取得了成功。在图 4 (b),我们展示效果,接合纳米抗体对光照疗法。这个细胞生存分析显示的百分比死细胞治疗后在之前执行 在体外研究添加GNRs之后没有洗细胞( 4]。细胞治疗与近红外激光只控制、激光和聚乙二醇纳米棒,和激光+聚乙二醇纳米共轭anti-EGFR抗体。这些治疗后死亡细胞的百分比是4.5%,96%,和89%,分别。只有7%的治疗效果差异前后纳米接合过程可能归因于GNRs之间的距离和细胞表面由于抗体和交联剂。所有实验进行785纳米二极管激光器在9.5 W /厘米²,用GNRs ~ 4分钟 OD PEG-NR = 4.12 (~ 8.65×10¹¹粒子/毫升),300:1交联剂:抗体的比例。

体内生理条件需要弹性和功能结合,以确保最佳的交付GNRs恶性肿瘤并到达成功的治疗。我们已经证实,接合后,抗体绑定效率和GNRs治疗结合之前单独与他们的表现能力。进一步评估与GNRs接合性能和光照效果,我们用GNRs细胞治疗,单独和共轭,和清洗介质消除游离GNRs三倍。我们观察到有吸附效应发生在表面的GNRs但这是区分GNRs的稀释浓度。在图 5后,我们比较细胞死亡的百分比NIR PTT GNRs孤独和共轭。

GNRs光学密度为0.412,0.549,1.648,和3.296共轭抗体浓度的14.3,19.1,11.12和9.52 μ分别g / mL。我们将展示这一趋势随着奈米棒的浓度的增加,细胞死亡也在不断增加。细胞死亡的百分比的差异引起的近红外光谱PTT观察GNRs关联的低浓度较高的抗体浓度。绑定中观察到的影响也有区别的anti-EGFR抗体绑定中使用的表皮生长因子受体分析显示在图 3和绑定,结果从表面的表皮生长因子受体表达SCC-5细胞用于细胞可行性实验三洗后在图 5。antibody-to-nanorod比率和合成相对疗效和化学计量学尚未研究。