高糖高脂饮食对代谢综合征模型大鼠脂肪酸氧化和极低密度脂蛋白分泌的相反影响

抽象的

目的．研究两种不同饲料(高蔗糖(HS)和高脂肪(HF))对可能导致脂肪变性的主要代谢途径的影响:(1)肝脏溶酶体和肝素释放脂肪酶的活性;(2)脂肪酸氧化;(3) FFA合成德诺维；(4) VLDL输出在活的有机体内在代谢综合征(MetS)大鼠模型中，遗传性高甘油三酯血症(HHTg)大鼠喂养HS或HF饮食。结果．两种饲粮均导致肝脏中三酰基甘油(TAG)积累(HF > HS)。两组细胞内溶酶体脂肪酶对TAG的脂解均增加，且与肝脏TAG含量呈正相关。饲粮类型显著影响细胞内tag衍生脂肪酸在利用脂肪酸代谢途径中的分配，HS饲粮促进VLDL分泌并下调FFA氧化，而HF饲粮则完全相反。FFA德诺维在HS组（FED»捕获）中，在HF组完全消除的同时显着增强葡萄糖的合成。结论．我们发现，在易于罹患met相关疾病的大鼠中，饮食诱导的脂肪变性并不仅仅是TAG降解受损的结果，而是依赖于根据饮食组成而特定的其他机制(提高FFA合成或减少VLDL分泌)。

1.介绍

代谢综合征（METS）也称为胰岛素抵抗综合征的特征是心细镜耐性危险症的组合，包括胰岛素抵抗，葡萄糖不耐受，血脂血症，非酒精性脂肪肝病和高血压[1]与2型糖尿病发展的显着增加有关[2］.肝脏是部分易受异位脂肪堆积，代谢综合征的最重要的起因成分之一，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）现在被认为是代谢综合征的肝脏表现。

脂肪肝产生于TAG征地拆迁不平衡。肝甘油三酯积累的常规的解释是，肥胖和胰岛素抵抗导致的游离脂肪酸的脂肪细胞从释放增多。增加脂肪质量，并通过激素敏感性脂肪酶有助于增强活性增加将甘油三酯水解成游离脂肪酸的血浆水平升高。最新的无FFA的转运特异性调节成肝细胞已经描述，并因此假设肝FFA吸收速度是枪调节，并因此正比于血浆FFA浓度。通过Kalopissis和她的同事进行详细然而研究表明，脂肪喂养大鼠的细胞摄取¹⁴通过肝细胞进行C-酸酯体外尽管肝脏中有重大标签积累，但减少了。定性地在不同代谢背景（Wistar，Zucker Lean，Zucker肥胖）上观察到这种现象，并且仅在其表现的范围内不同[3.-5.］.这些观察结果表明，肝脏三酰甘油含量的调节不仅是血浆FFA输送的功能，而且还有其他肝内机制(例如，调节细胞内TAG的分解、氧化和酯化之间FFA的分配、德诺维脂肪酸合成，标签分泌调控）确定脂肪变性发展。

毫无疑问，膳食因素是NAFLD表型的重要贡献者之一，膳食推荐是当前健康促进趋势的重要工具。从这个观点来看，详细了解不同饮食对肝标签代谢的代谢途径网络的影响基本上是必要的。应特别注意膳食组成与特定遗传/代谢背景的相互作用。

遗传性高甘油泛血症（HHTG）大鼠是我们研究的主题，显示大多数METS症状，包括高甘油脂血症，葡萄糖耐量受损，高胰岛素血症，胰岛素抵抗和增加的血压（参见辅助材料S1http://dx.doi.org/10.1155/2012/757205）.即使没有营养刺激，这种表型也会表现出来，但高蔗糖喂养会进一步加重这些症状[6.］.本研究的目的是确定两种不同的饮食(高糖和高脂肪)对可能导致脂肪变性发展的主要代谢途径的影响，特别是在特别容易出现糖尿病症状的遗传背景上。我们着重研究了以下代谢过程:(1)肝脏溶酶体(LIPA)活性对细胞内TAG降解的调控机制;EC3.1.1.13)和肝素释放(HL;EC 3.1.1.3)脂酶;(2)释放的FFA作为TAG在氧化和分泌之间的分配;(3) FFA德诺维合成。

2。材料和方法

2.1。动物和实验协议

雄性遗传性高甘油三酯大鼠(HHTg)被置于温控室内，光照周期为12:12-h，暗期为下午6点至早上6点。动物可以自由饮水和饮食，除非另有说明。HHTg大鼠品系原选自本实验室Wistar品系大鼠[7.］.所有实验均已与捷克共和国311/1997的动物保护法一致，符合欧洲共同体理事会使用实验动物86/609 / ECC的建议，并由临床研究所的伦理委员会批准和实验医学。

从3个月大开始（b.wt。g)，所有动物均饲喂高蔗糖饲粮(HS: 70% cal%蔗糖;20卡%蛋白质，10卡%碳水化合物)、高脂肪饮食(HF: 70%饱和脂肪，20卡%蛋白质，10卡%碳水化合物)或标准实验室鼠粮(SD)连续4周。所有饮食都是等热量的。(见补充材料S2)。被设计为“喂食”的组在终止前可以自由进食，而被设计为“禁食”的组在最后24小时内不进食。

2.2。肝切片中葡萄糖的脂肪酸合成de novo的测定在体外

禁食或喂食的大鼠在上午9-10点被安乐死，它们的肝脏切片(大约为。1毫米厚度, mg）快速解剖。将组织在补充有5%的Krebs-Ringer重碳酸盐缓冲液中培养2小时 mmol/L未标记的“冷”葡萄糖，D-[U-¹⁴C-]葡萄糖（特定活动20 μCi/mmol）和2%牛血清白蛋白，气相95%O₂和5％的co₂．所有的培养都是在37°C的密封小瓶中使用晃动水浴进行的。估计¹⁴如前所述，将c -葡萄糖纳入总脂含量[8.］.简单地说，将肝切片从培养液中取出，用生理液冲洗，立即放入CH中_3.Cl。用特氟隆杵状均质器溶解组织块，加入甲醇(CH_3.Cl : methanol 2 : 1) and lipids were extracted at 4°C overnight according to Folch et al. [9.］.第二天取出残留组织，取透明提取物进行进一步分析。用闪烁计数法测定了样品的放射性。

为了将葡萄糖（甘油与酰基部分）掺入中性脂质的葡萄糖（甘油与酰基部分）中，在70℃下在乙醇15％氢氧化钾中蒸发并皂化的澄清提取物。通过加入5.4米H终止皂化₂所以_4.．冷却至室温后，将释放的脂肪酸反复萃取到石油醚中。蒸发汇集的石油醚级分，在闪烁液中重构，通过闪烁计数测量放射性。掺入甘油残基中的放射性量被计算为掺入中性脂质的总活性的差异和相同等分等分试样的石油醚部分。

2.3。肝切片中细胞内tag衍生脂肪酸代谢的测定在体外

细胞质标记在活的有机体内如由Francone等人所述进行。[10］.大鼠静脉注射20 μCI.¹⁴在轻质醚麻醉下C-棕榈酸络合至4％白蛋白。将动物在后续90分钟内安乐死，如上所述进行肝切片的制备。确定¹⁴C-棕榈酸氧化与CO_2，该实验是在与中央孔的玻璃小瓶中进行。的vials were capped with rubber stoppers and the reaction was terminated by addition of 0.5 mL of 0.5 M H₂所以_4.而在中心井中加入浸过氢氧化海棉的滤纸条进行收集¹⁴CO.₂．用UltraTurax (IKA Worke, Staufen, Germany)在150 mM NaCl中均质后，测定孵育后的肝切片中三羧酸循环中间产物的含量。将匀浆萃取至石油醚中，用闪烁计数法计算残留在水馏分中的放射性。根据河村和岸本[11这部分主要代表三羧酸循环中间体(>80%)，少数部分是通过三羧酸循环从FFA中提取的氨基酸(<20%)。的¹⁴在孵育培养基的叶绿蓟提取物中测定C-棕榈酸掺入分泌标签中。转换¹⁴根据氯藻提取后培养培养基水馏分中残留的放射性，对分泌的水溶性氧化产物(即主要是酮体)中的c -棕榈酸进行了评估。

２.４.脂肪酶测定:外源性底物

测定从新鲜组织制备的2％匀浆或亚细胞级分中测定脂肪酶活性。将0.5g肝脏在2.5ml均化缓冲液中均化（0.25μm蔗糖; 0.001米EDTA; 肝素7 IU/mL）在聚四氟乙烯杵均质器上。匀浆通过尼龙网，短暂离心以去除粗杂质（800 g、五, 最低温度为4°C），并在冰上保存，直到进行脂肪酶测定（最长1小时）。在10℃下通过离心获得亚细胞组分 000 g代表15人敏。

为酸或碱性脂肪酶测定中的反应介质相同制备除了使用的缓冲液。^3.将甲苯中的H-三醛添加到88 mg（100 μ在氮气流下蒸发冷硅藻土和溶剂。用150mM NaCl和0.05％Triton X-100溶解在4ml 0.1M缓冲液（醋酸盐缓冲液pH = 9.5）中溶于4ml 0.1M缓冲液（醋酸盐缓冲液pH = 9.5）中。将整个混合物乳化在Hielle Sunicator Up200s上，连续3分钟冰/水浴上的振幅1。40 μ将匀浆或亚细胞级分在30℃下孵育60分钟，160 μ在摇动水浴中加入1 L反应介质。反应结束后，根据Belfrage和Vaughan提取释放的脂肪酸[12]并计数放射性。

2.5。脂肪酶测定：内源性基质

这种方法利用了溶酶体脂肪酶及其细胞内底物的细胞内定位的协调变化。在防止溶酶体破坏的等渗透条件下，按照上述方法制备肝脏匀浆和亚细胞组分。在测定过程中，只有在分离部分后，才引起溶酶体的裂解。20%匀浆与0.2 M醋酸盐缓冲液1:1混合并在30℃下在摇动水浴中孵育60分钟。将反应混合物萃取到氯仿 - 甲醇 - 甲醇中，并分离相1M NaCl。蒸发叶绿素相的等分试样，100 μL的克雷布斯-林杰磷酸盐缓冲液添加6%不含脂肪酸的牛血清白蛋白。试管在37°C的摇晃培养箱中孵育2小时。使用市售试剂盒测定最终KRF/BSA溶液中FFA的浓度。为了检验FFA的溶解效率，用新鲜KRB + 6%牛血清白蛋白(BSA)清洗排空管，然后用100μ加入L的叶绿素。用薄层色谱法分离，未检出游离脂肪酸。

2.6。标签入口率的测定成等离子体

根据Otway和Robinson估计标签入门率估计了流通量[13].简而言之，老鼠被饿死24小时小时，然后给出1 在轻醚麻醉下，通过尾静脉，在0.9%NaCl或0.9%NaCl中静脉注射10%Triton WR-1339 mL。Triton WR-1339是一种烷基聚醚阴离子洗涤剂，可阻止血管内d<1.006的清除 g/mL脂蛋白。动物被处死通过主动脉穿刺抽血接受Triton®声波风廓线仪或0.9%氯化钠后min。已经证明，血浆中甘油三酯浓度在3%以下呈线性静脉注射WR 1339后小时，因此时间点为90 应用后的最小值在线性范围内。根据以下公式计算进入血浆的甘油三酯输入（分泌）率：

TAG入境率(μ摩尔。100 g b。wt。^-1．人力资源^-1）= [（T_90.−T_0.)/1.5]×V×（W/100），其中T_0.等离子体标签浓度（μ的Triton给药，T之前摩尔/毫升）_90.等离子体标签浓度（μMol / ml）在研究结束时，V是等离子体体积（ml），W是体重。等离子体体积确定为3.86ml / 100g体WT [14］.

2.7。组织中甘油三酯含量

将脂质从1mL H中均化的1g新鲜组织中提取。₂O. 0.2 mL匀浆用15 mL 2:1氯仿:甲醇萃取24小时。通过加入6 mL KH将有机相和水相分离₂阿宝_4.3000转离心20分钟。1 mL的有机相完全干燥，重悬在100μL异丙醇和10 μL被用于分析。使用商业可用的试剂盒(捷克Pliva-Lachema Diagnostics)测定该试剂盒中的甘油三酯浓度。

2.8.生化分析

非酯化脂肪酸、胰岛素、甘油三酯和葡萄糖的血清含量β- 羟基丁基使用市售的套件确定（FFA：FFA半导体Microtest，Roche Diagnostics，GmbH德国;甘油三酯：Pliva-Lachema诊断，捷克共和国;葡萄糖：Pliva-Lachema诊断，捷克共和国;胰岛素：瑞典Mercodia;β-HydroxyButyrate：Ranbut，Randox，英国）。

2.9。化学物质

所有材料均为试剂级。¹⁴C-palmitic酸和^3.H-Trioleinwere从Amersham购买，D- [U-¹⁴C-]葡萄糖购自UVVVR，布拉格。FFA自由牛血清白蛋白（分数V）购自Serva，棕榈酸和来自Fluka的Triolein，所有其他化学物质都是从Sigma捷克共和国购买的。

2.10。统计分析

数据表示为多次测定的平均值±SEM。统计分析使用ANOVA和杜克-Kramer多重比较检验（执行= 5-7）。在水平的情况下，差异被认为是统计学意义．计算Pearson相关系数以评估脂肪酶活性与肝甘油三酯含量、脂肪酶活性与酮体生产之间可能的关系。

结果

3.1。实验组特征

在前两周内，HS和HF饮食（HF> HS）上的动物的重量迅速升高，然后重量增益的速率显着降低。所有测试的饮食都是异蜂理，HF和HS组体重越快地增加，在饮食给药的前两周内反映了更高的食物摄入量（参见补充材料S3）。在标准饮食上的动物中，这参数甚至在整个实验中（图1）.在最后两周的饮食管理中，三组的食物摄入量和体重增加的速度是可比性的。HS和HF饲粮喂养的动物终末体重和附睾脂肪垫重量均高于SD组(HF > HS > SD)(表2)1）.只在HF组中增加了空腹血糖和胰岛素血症。HS和HF饮食对血清三酰基甘油水平的影响是相对的-HS饮食显着增加禁食和喂养的三甘油三酯血症与标准饮食相比，HF饮食具有轻微的低血脂效应（Fed S标签减少30％，）.血清FFA含量变化趋势相似。两种饲粮均显著增加了空腹生酮(HF > HS)，但只有HF饲粮增加了饲喂状态下酮体的生成。HS和HF喂养后空腹动物的肝脏三甘油酯含量分别增加了105%和280%。在标准饲粮中，饲粮和禁食状态下肝脏甘油三酯含量相同，但HS组饲粮状态下肝脏TAG含量显著低于禁食状态。相比之下，HF组的趋势则相反，禁食动物的肝三甘油酯含量实际上高于饲喂动物(见表)2）.


		Prediet 价值观	SD （饮食后）	HS. （饮食后）	高频（饮食后）	HS和SD	高频和SD

体重（克）		281±3	311±4 * * *	335±15 * * *	364±10 * * *	< 0.05	<0.001
附睾脂肪（g）		-	2.8±0.2	3.8 ± 0.3*	5.5±0.5 * * *	< 0.05	<0.001
s-glucose(更易/ L)	禁食	4.5±0.2	4.6±0.1	4.5±0.05	5.4±0.05 *	N.S。	< 0.05
s-glucose(更易/ L)	美联储	6.2±0.2	6±0.1	11.4±0.1 * * *	7.6±0.4 *	<0.001	< 0.05
s-insulin (pmol / L)	禁食	126±18	135±21	155±12	204±20 *	N.S。	< 0.05
s-insulin (pmol / L)	美联储	155±20	158±15	342±29 * * *	127±18.	<0.001	N.S。
s-标签（mmol/L）	禁食	1.3±0.25	1.5±0.3	4.9 ± 0.5***	1.4±0.3	<0.001	N.S。
s-标签（mmol/L）	美联储	2±0.4	2.4±0.2	7.2±0.4 * * *	1.8±0.2	<0.001	< 0.05
S-FFA（MMOL / L）	禁食	0.65±0.03	0.7±0.05	1±0.09 *	0.6±0.08	< 0.05	N.S。
S-FFA（MMOL / L）	美联储	0.38 ± 0.02	0.4 ± 0.02	1.3±0.1 ***	0.45±0.07	<0.001	N.S。
s -羟基丁酸盐（摩尔/升)	禁食	1.2 ± 0.04	1.3±0.05	2.2 ± 0.14**	3.8±0.2 ***	< 0.01	<0.001
s -羟基丁酸盐（摩尔/升)	美联储	0.02±0.01	0.02±0.01	0.03±0.02	0.45±0.05 ***	N.S。	<0.001

数据为平均值±SEM，．*，**, * * *在饮食之后的比例前。


饮食	禁食	美联储

SD	3.7 ± 0.3	3.7 ± 0.2
HS.	7.6±0.6 **	4.8±0.2^†
HF.	14±1.1^###	20.8 ± 2.3^XXX.

提供数据摩尔·g^-1湿重，表示为平均值±SEM，．
Arunachal Pradesh，HS禁食与SD禁食；^† 喂养的HS与SD喂养;^### HF禁食与SD禁食；^XXX. 高频馈电与SD馈电。

３．２．FFA合成德诺维

与SD组相比，喂养HS和HF饮食的大鼠肝脏含有更多的甘油三酯。为了评估德诺维从葡萄糖到升高标签含量的FFA合成，我们孵育从肝脏孵育的大鼠肝脏喂食每个特定饮食的存在¹⁴没有外源FFA的C标记的葡萄糖并测量葡萄糖将葡萄糖掺入总脂质中，进入标签分子（即，葡萄糖酯化）的甘油部分和标签分子的酰基部分（即，FFA合成德诺维).如图所示2，FFA德诺维而HF组则完全消除fel。

图2

体外 德诺维 2 P. ^†† P. ^††† P. P. 肝切片中葡萄糖与脂质结合．利用葡萄糖进行酯化和脂肪酸合成相同的样品葡萄糖掺入到总脂质中测定（在部分所述）.开放的酒吧=被禁食的动物;关闭酒吧=喂动物。所有数据均为SEM，每个酒吧的单独孵化***hs -fast vs sd -fast < 0.001;< 0.01,<0.001HS.。。。-供给与SD-馈送;< 0.05HF.喂养与SD喂养。

３．３．细胞内TAG-的脂肪酸在肝片的运用在体外

为了评估从细胞内肝标记衍生的FFA的可及性，以便进一步代谢利用，我们通过注射预先标记了胞浆标记¹⁴C-palmitic酸在活的有机体内并测量放射性掺入TCA中间体，CO₂和酮体(FFA氧化)，并在肝切片中进入TAG分泌到培养基(VLDL分泌)体外90分钟以后。据Francone等人报道[15]，在将放射性给药注入静静脉90min后，胞质TAG中发现了近90%的放射性标记，因此我们预计在本实验设置下，大部分纳入氧化产物或VLDL的FFA必须通过脂解从细胞内TAG中释放出来。在SD喂养的动物中，与禁食的动物相比，由喂食动物制备的肝脏切片的氧化和VLDL生成均较低。HSD的使用导致了TCA中间体和CO的显著衰减₂生产但禁食的keetogenesis在这个群体中有点突出（)与SD喂养的动物相比。HS喂养组大鼠的TAG分泌明显高于其他两组，并消除了膳食依赖调节。在HFD组的肝脏切片中，我们没有发现饮食对TCA中间体和CO有任何影响₂但在禁食和喂食的动物中酮体产量均显著升高(）.相比之下，将标签分泌到培养基中显着降低（）.占据了这种数据，表明饮食类型不会对代谢利用率的FFA的总可用性产生深切影响，但它相当影响它们在氧化和VLDL分泌之间的分区（表3.）.


	SD		HS.		HF.
	禁食	美联储	禁食	美联储	禁食	美联储

CO.₂(已公布)	16±1.2	11.9±1	11±1.5 *	8.3 ± 0.3^†	15±0.7	9.8±0.8
柠檬酸中间体(细胞内)	55.3±1.6	41 ± 3.4	46.6±1.8 * *	25.7±1.5^†††	54.2 ± 4.2	40.3±1
- 羟基丁酸盐（分泌）	269±9.	204±8	380 ± 18**	178±15.	452±22.^###	480±11.^XXX.
标签（分泌）	581±35	401±44	713±29 * *	825±29^†††	314±16.^###	286±35^XX.

数据在每G组织中的Nmol棕榈酸中表达，并给出平均值±SEM．*，**HS禁食与SD禁食；^† 那^††† 喂养的HS与SD喂养;^### HF禁食与SD禁食；^XX. 那^XXX. 高频馈电与SD馈电。

3.4。碱性和酸性脂肪酶的活性

如上所述，细胞内标签降低在活的有机体内在HS和HF施用动物的肝脏中。为了更详细地分析饮食对饮食对肝脏脂肪分解的影响，我们将两种肝脂肪酶的活性直接测量在外源基质上。在肝脏匀浆中，我们能够证明具有最佳pH 4.5和8-9的两个不同的脂肪酶。酸性脂肪酶可以鉴定为“溶酶体”（EC 3.1.1.13），而碱性被称为“肝脏”（EC 3.1.1.3）。这两种酶在细胞内分布和调节中不同，并且通过给药的饮食受到不同的影响。饮食对匀浆中脂肪酶活性的影响如图所示3（a）（Lysomal）和3（b）(肝)。在标准饮食中，空腹和餐后抑郁时溶酶体脂肪酶活性较高，而进食和禁食动物的肝脂肪酶活性无差异。两种饲粮均能增加溶酶体脂肪酶活性，但增加的量不同。HS饲粮中，溶酶体脂肪酶活性在空腹时升高，但在饲喂状态下保持不变。HF饮食对溶酶体脂肪酶活性的刺激作用显著高于空腹和进食状态。HS组大鼠保留了禁食的调节作用，HF组大鼠则完全消除了禁食的调节作用。肝脂肪酶对所测饮食操作有不同的反应。HS饲粮提高了空腹和餐后该酶活性，而HF饲粮显著降低了该酶活性。

(一)

(b)

图3

^3. ^3. ^‡ P. P. ^### P. P. 肝脏匀浆中溶酶体（A）和肝（B）脂肪酶的活性测量为从人工基质（H-Triolein）。测量脂肪酶活性作为脂肪酸的释放从…起H葡萄酒。开放式酒吧=禁食动物;关闭酒吧=喂动物。<喂养与禁食;*< 0.05小时禁食与SD禁食相比；<0.001HF.。禁食与SD禁食;HF.。-fed对SD-fed < 0.001。

肝脏匀浆10 000g的离心使我们能够将含有致密溶酶体（颗粒）的级分和含有胞质溶胶，总膜和光溶酶体（上清液）的馏分分离。在标准饮食中，大多数溶酶体脂肪酶活性（85％）在10 000g颗粒中定位，而大多数肝脂肪酶活性（禁食70％;喂食77％）被发现在10 000g上清液中。HS和HF饮食既不会影响肝脂肪酶的亚细胞分布，约。在所有实验设置中，在10 000g上清液中发现了75％的活性。就溶酶体脂肪酶而言，HF饮食将其活性的大部分重新分布到10 000g上清液中（表4.）.该数据表明，在总活动以及细胞内定位方面，溶酶体脂肪酶受到HF饮食的显着影响。


	溶酶体脂肪酶				肝脂肪酶
饮食	10 000克沉积物		上清10 000 g		10 000克沉积物		上清10 000 g
	禁食	美联储	禁食	美联储	禁食	美联储	禁食	美联储

SD	86±9.2	85±2	14±1.5	15±2	30±4	23±2	70±5	77±9.5
HS.	87±6.8	86±7.3	13±0.8	14±3.6	40±8.3	38±7.3	60±8.2	72±5
HF.	82±4.	75±3.^XX.	18±2^＃	25±2^XX.	38 ± 5.2	24±3.1	62±4.5	76±7

数据以10 000克沉淀物和从肝脏匀浆中制备的上清液中活性总和的%表示。．^＃ HF禁食与SD禁食；^XX. 高频馈电与SD馈电。

在内源性基质上测定溶酶体脂肪酶的活性体外与肝三酰基甘油含量呈正相关。美联储中的这种相关性更强大而非禁食状态(）（数字4.).我们发现肝脏三酰甘油和肝脏脂肪酶活性之间没有显著相关性（fed:；禁食:（数据未显示）。此外，溶酶体脂肪酶与血清呈正相关的活性β禁食中的 - 羟基丁酸盐浓度（R.²= 0.81)和fed州（图5.）.在溶酶体脂肪酶的情况下这些阳性相关性表明该酶受细胞内基质的可用性的影响，并且通过溶酶体脂肪酶作用释放的FFA至少可用于酮发生。

(一)

(b)

(一)

(b)

3.5。VLDL生产

VLDL的生产速率在活的有机体内使用Triton WR-1339进行估算。由于其对LPL的抑制作用，这种洗涤剂有效地阻止了脂蛋白从血液中的清除，因此，在这种情况下，血浆中TAG的积累可能是测量肝脏VLDL分泌速率的有效方法。如表所示5.，在HS组中，标签入门率在HS组中强烈突出，同时在用HF饮食中施用的动物中显着减少。


	SD	HS.	HF.

标签_0.（摩尔/毫升）	3.9±0.2	6.4±0.5⁺⁺⁺	3.0±0.1^{••,¶¶¶}
标签_90.（摩尔/毫升）	7.4±0.4	11.7 ± 0.75⁺⁺⁺	5.2±0.44^{••,¶¶¶}
TAG入境率(mol·60分钟^-1·公斤)	11.2±0.7	45.7±6.1⁺⁺⁺	8.2±0.5^{••,¶¶¶}

标签_0.：服用WR 1339前的三酰甘油血清浓度；标签_90.：WR 1339给药后，三酰基甘油血清浓度90分钟。标签入门率是根据公式标签入口率计算的（mol·100 g b。wt。^-1·小时^-1）= [（T_90.-T._0.）/1.5]×v×（w / 100）。数据给出了平均值±s...m.．⁺⁺⁺ HS和SD;^### HF禁食与SD禁食；^•• HF与SD;^¶¶¶ HF与HS。

4.讨论

本研究的目的是促进不同的代谢途径中的代谢综合征的模型两种不同的饮食控制（HS和HF饮食）诱发脂肪肝的发展中的作用的理解。在饮食中富含简单碳水化合物或脂肪迅速促进肝脏的TAG积聚。有人认为，脂肪肝的发展与胞内TAG水解的衰减有关。与此相反，假设我们的数据表明，脂肪分解，在细胞内的TAG利用的第一步，是不是负面HS或HF饮食的影响。我们发现，参与细胞内降解TAG重要的酶是溶酶体酶。此外，我们提供的证据表明，饮食引起的脂肪肝背后的机制取决于饮食的流行成分。的HS饮食诱发的脂肪变性与FFA合成的显著刺激相关德诺维降低FFA氧化，增加肝脏VLDL输出。相反，HF饮食相关脂肪变性的特点是FFA合成下调德诺维，增加FFA氧化与显著受损VLDL输出。

尽管几十年来一直致力于肝脏中TAG代谢的研究，但在确定特定的脂肪酶对细胞内TAG降解的确切贡献方面，仍未达成共识。在我们的研究中，我们重点研究了pH值最适为8-9的肝素释放型肝脂肪酶和pH值最适为4.5的酸性溶酶体脂肪酶中的两种脂肪酶。HS组肝脏匀浆中脂肪酶活性升高，HF组肝脏匀浆中脂肪酶活性降低。肝脂肪酶似乎是由慢性高胰岛素血症引起的[16]，其与高蔗糖以及相关联。大量的研究表明肝脂肪酶的表达和活性在胰岛素抵抗状态的增加，主要是伴随着内脏肥胖[17］.然而，归因于肝脂肪酶的大多数活动归因于肝细胞，即，促进LDL和残余乳糜微粒与LRP受体或参与HDL代谢的相互作用[18-21］.此外，我们之前曾报道碱性脂肪酶不能降解肝脏均质中的内源性TAG，唯一针对细胞内底物的脂解活性是在酸性范围内发现的[22］.从这些发现来看，肝脂肪酶可能不参与内源性三酰甘油的动员。

溶酶体脂肪酶，首先由Vavřínková和Mosinger描述[23]，在溶酶体中局部化，其活性在生理条件下禁食升高[24］.在我们的实验中，这种调节模式仅在标准和HS饮食上的HHTG大鼠中保存，但通过HF饲料完全消除。HF和HS饮食均对溶酶体脂肪酶的活性具有刺激作用，但HF饮食的效果显着高于富含蔗糖的饮食的作用。HF饲养导致将部分溶酶体脂肪酶活性的易位以粒料中发现的活性以牺牲活性为上清液（高达25％）。该观察结果符合肝细胞中最近提出的溶酶体依赖标签降解机制[25那26］.根据该假设，通过自噬的过程将脂液滴掺入自虫（Lipo）溶酶体中，类似于细胞溶质蛋白或受损细胞器的自噬。从10 000g沉淀到上清液的溶酶体活性的易位可以反映含有含有标签的较少致密的自身血糖溶胶的形成[27］.我们进一步发现酸性脂肪酶活性和肝脏匀浆标签含量之间的强正相关性。总之，这些数据表明标签劣化实际上在脂肪变性中增强，并且它由溶酶体脂肪酶介导。

与之前发表的假设相反，我们基于直接测量酸性脂肪酶活性的结果表明，肝内脂质的积累并不是细胞内三酰甘油储存活动受损的结果。尽管如此，我们发现溶酶体脂肪酶活性与内源性甘油三酯氧化(酮生成)之间存在正相关关系，即使在HF喂养组，这意味着储存的甘油三酯至少在某些代谢途径中是可获得的。由于肝细胞分解细胞内甘油三酯的能力实际上在两组饮食中都有所提高，必须有另一个因素来解释HS和HF饮食对肝脏和循环中甘油三酯积累的不同影响。

有关饮食成分（碳水化合物与脂肪）对肝标签代谢作用的影响的广泛文献可用。有一个公平的共识，即富含碳水化合物的饮食和脂肪结果低，血清标签水平升高，增加了VLDL生产率，每次粒子的标签量的升高和碳水化合物/脂肪酸氧化的衰减[28-32］.然而，对高碳水化合物摄入量的敏感性是高度可变的。为了确定可能有助于预测对碳水化合物喂养敏感性的受试者特征，进行了大量研究。性别、HF饮食中TAG浓度、BMI和胰岛素浓度等特征均可预测饮食的影响，但没有单一变量具有显著的预测价值。相比之下，碳水化合物的一种非常显著的影响已经被证明，单糖的影响要比多糖高得多，这种影响在高甘油三酯和正常甘油三酯的受试者中是相似的[33］.在我们的实验室进行以往的研究表明，HHTg老鼠显著的HS饮食更敏感，但通过这种饮食对TAG代谢造成的影响在HHTg及其normotriglyceridemic控制主要是类似，虽然他们在不同的大小[34那35］.

关于高脂饮食对肝脏TAG代谢的影响，特别是对VLDL分泌的影响，数据更为多样。20世纪90年代Kalopissis小组发表了几项针对这一问题的详细研究，分别在瘦和胖Zucker大鼠上进行。他们在原代肝细胞上证明，之前的HF喂养(60卡路里%为脂肪，猪油)降低外源性脂肪酸的摄取和利用，深刻影响细胞内TAG释放的FFA在细胞内的分配，有利于FFA的氧化，代价是VLDL的分泌(减少40-50%)和脂肪生成(抑制80%)[3.-5.那10］.值得注意的是，HFD对Zucker大鼠肝脏TAG代谢的定性影响在瘦大鼠和肥胖大鼠中是相同的，但后者的变化程度更明显。

尽管HF饮食引起的VLDL分泌抑制已被多次观察到，但这一现象的原因尚未完全阐明。与标准和高糖饮食相比，HF饮食中葡萄糖的可得性严重降低。葡萄糖在肝脏水平的直接影响之一是增加VLDL三酰基甘油的分泌[36那37］.Brown等人[38[他们对原发性肝细胞的研究表明，葡萄糖介导的效果很多，涉及将三酰基甘油从细胞中的转运加上VLDL，随着肝脏中肠道和apob-100的净合成的增加而增加。基于该数据，我们可以推测测定肝脏中脂质积累的限制条件是肝脏输出的脂蛋白输出率取决于葡萄糖的可用性。然而，我们发现HF喂养大鼠的禁食血清葡萄糖略有增加，表明内源性葡萄糖产生的增加。这种葡萄糖是否可用于VLDL生产仍然是一个开放的问题。

在本研究中，我们专注于在饮食操作尤其容易发生的模型中患有肝脏脂肪变性的机制。总之，我们提供了证据表明，在代谢综合征肝硬化的HHTG大鼠模型中（HS-或HF诱导的）与细胞内标签脂解的损伤无关。相反，在这些条件下实际增强了溶酶体标签崩溃。虽然两种测试的饮食的效果是定性的，但不是定量的，肝脏中的相同标签积累是不同的。高蔗糖饮食与脂肪酸氧化的抑制与脂肪酸氧化平行有关，与增加的标签分泌德诺维FFA合成。相比之下，在HF饮食的动物中，细胞内的tag来源的FFA主要被引导到氧化利用，即酮生成，而牺牲了分泌途径。这一发现强调了理解特定病例的确切机制的重要性，以便选择有效的治疗方法。

承认

本研究得到了授予号的支持。来自GA CR的P301 / 11/2418和项目（卫生部，捷克）的研究组织00023001（Ikem，Prague，捷克共和国） - 施工支持。

补充材料

表S1：HHTg大鼠品系的特点。如果没有特别注明外，均在饲喂标准饮食3-4个月大的动物所获得的数据。远交的Wistar-Kyoto大鼠（祖株）用作基准。HS.D = high sucrose diet.

表S2：饮食的组成。

图S3:食物摄入量的估计

补充材料

工具书类

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营养和新陈代谢杂志

高糖高脂饮食对代谢综合征模型大鼠脂肪酸氧化和极低密度脂蛋白分泌的相反影响

抽象的

1.介绍

2。材料和方法

2.1。动物和实验协议

2.2。肝切片中葡萄糖的脂肪酸合成de novo的测定在体外

2.3。肝切片中细胞内tag衍生脂肪酸代谢的测定在体外

２.４.脂肪酶测定:外源性底物

2.5。脂肪酶测定：内源性基质

2.6。标签入口率的测定成等离子体

2.7。组织中甘油三酯含量

2.8.生化分析

2.9。化学物质

2.10。统计分析

结果

3.1。实验组特征

３．２．FFA合成德诺维

３．３．细胞内TAG-的脂肪酸在肝片的运用在体外

3.4。碱性和酸性脂肪酶的活性

3.5。VLDL生产

4.讨论

承认

补充材料

工具书类

版权

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